BỘ Y TẾ TRƯ ƯỜNG ĐẠI HỌC C DƯỢC C HÀ NỘ ỘI WY ZX KIỀU THỊ BÍCH HU UỆ NGH HIÊN CỨU C XÂY Y DỰN NG PH HƯƠN NG P PHÁP P XÁC C ĐỊN NH HÀ ÀM LƯỢN L NG MỘT M SỐ Ố CHẤ ẤT PH HÂN LẬP L ĐƯỢ Đ ỢC TỪ Ừ LÁ Á CÂY Y GẠO O KHÓA LUẬN L TỐT T NG GHIỆP DƯỢC D SĨ HÀ H NỘI - 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI WY ZX KIỀU THỊ BÍCH HUỆ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu Nơi thực hiện: Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm Mỹ phẩm Hà Nội Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng số chất phân lập từ Gạo”, làm việc nghiêm túc, cố gắng, nỗ lực thân, tơi nhận nhiều khích lệ từ phía nhà trường, thầy cơ, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS Nguyễn Thái An – Bộ môn Dược liệu, NCS Hồ Thị Thanh Huyền, DS Phạm Lê Minh cho tơi đóng góp q giá đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội, cán Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm mỹ phẩm Hà Nội hỗ trợ tơi q trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè động viên tơi mặt giúp đỡ tơi tận tình q trình học tập, nghiên cứu, động lực không nhỏ để có kết ngày hơm Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Kiều Thị Bích Huệ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… CHƯƠNG I TỔNG QUAN………………………………………….……… 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO…………………………………………… 1.1.1 Đặc điểm thực vật……………………………………….………… 1.1.2 Tính vị cơng Gạo………………………………… 1.1.3 Bộ phận sử dụng………………………………………………… 1.1.4 Thành phần hóa học……………………………………………… 3 1.2 TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO………………………………………… 1.2.1 Daucosterol……………………………………………………… 1.2.2 Stigmasterol……………………………………………………… 1.2.3 Mangiferin…………………………………………………… … 1.2.4 Lupeol…………………………………………………………… 1.2.5 Taraxeryl acetat…………………………………………………… 1.2.6 Taraxerol…………………………………………………….…… 1.2.7 7α-hydroxysitosterol………………………………………… … 10 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)…………………………………………………… 10 1.3.1 Nguyên tắc HPLC…………………………………………… 10 1.3.2 Các thơng số đặc trưng cho q trình sắc ký……………………… 11 1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật HPLC………………………………… … 12 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS)…………… … 14 1.4.1 Nguyên tắc………………………………………………………… 14 1.4.2 Máy khối phổ………………………………………………….… 14 1.4.3 Ứng dụng phân tích khối phổ định tính chất…….… 1.4.4 Một số kỹ thuật LC-MS…………………………………………… 17 16 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ…………… 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu…………………………………………… 18 2.1.2 Dụng cụ thiết bị…………………………………………………… 18 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử……………………………………………… 18 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU…………………………………………… 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………… …… 19 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử………………………………………………… 19 2.3.2 Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)…………………… …… 20 2.3.3 Khảo sát tìm điều kiện sắc ký……………………………… … 21 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích……………………………… 21 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu………………………………………… 23 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……………………… ……… 24 3.1 HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN………………… 24 3.1.1 Hàm ẩm dược liệu………………………………………… 24 3.1.2 Hiệu suất chiết…………………………………………………… 24 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ……………………………………… 24 3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU… 27 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ……………………… 30 3.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC…………………………………… 32 3.5.1 Kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký…………………… … 3.5.2 Độ lặp lại………………………………………………………… 34 3.5.3 Khoảng nồng độ tuyến tính……………………………………… 3.5.4 Độ đúng……………………………………………………… … 39 3.5.5 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ……… … 42 3.6 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO…… 43 3.7 BÀN LUẬN………………………………………………………… … 43 32 34 3.7.1 Về phương pháp xử lý mẫu……………………………………… 43 3.7.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký…………………………………….… 43 3.7.3 Về kết định lượng chất Gạo………………… 44 3.7.4 Về thẩm định phương pháp định lượng…………………………… 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………… 46 KẾT LUẬN………………………………………………………………… 46 ĐỀ XUẤT………………………………………………………………… 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ESI: ion hóa phun điện từ (Electronspray ionization) GC-MS: Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry) HO-1: Heme oxygenase – HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao HUVEC: LC-MS: Tế bào thuộc màng ống dây rốn (Human umbilical vein endothelial cell) Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification) MeCN: Acetonitril MeOH: Methanol MS: Khối phổ (Mass NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PDA: Detector PDA (Photodiode Array) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) S/N: Tín hiệu/nhiễu đường (Signal/Noise) SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự TP: Thành phần tR: Thời gian lưu UV-VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible) Spectrometry) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ khối máy khối phổ……………………………………… 15 Hình 1.2 Sơ đồ tứ cực chập ba…………………………………………… 16 Hình 3.1 SKĐ hỗn hợp chất nghiên cứu……………………………… 26 Hình 3.2 SKĐ dịch chiết toàn phần Gạo………………………… 26 Hình 3.3 SKĐ hợp chất mangiferin phân lập từ Gạo …………… 27 Hình 3.4 SKĐ hợp chất daucosterol phân lập từ Gạo…………… 28 Hình 3.5 SKĐ hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập từ Gạo… 28 Hình 3.6 SKĐ hợp chất lupeol phân lập từ Gạo………………… 28 Hình 3.7 SKĐ hợp chất taraxeryl acetat phân lập từ Gạo…… … 29 Hình 3.8 SKĐ hợp chất stigmasterol phân lập từ Gạo………… 29 Hình 3.9 SKĐ hợp chất taraxerol phân lập từ Gạo……………… 29 Hình 3.10 Phổ khối lượng ứng với pic mangiferin SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu…………………… 30 Hình 3.11 Phổ khối lượng ứng với pic daucosterol SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu……………… …… 30 Hình 3.12 Phổ khối lượng ứng với pic 7α-hydroxysitosterol SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu……………… …… 31 Hình 3.13 Phổ khối lượng ứng với pic lupeol SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu……………… …… 31 Hình 3.14 Phổ khối lượng ứng với pic taraxeryl acetat SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu…………………… 31 Hình 3.15 Phổ khối lượng ứng với pic stigmasterol SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu………………… … 32 Hình 3.16 Phổ khối lượng ứng với pic taraxerol SKĐ mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu………………… … 32 Hình 3.17 SKĐ mẫu trắng (dung môi pha mẫu)……………………….… 33 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Độ ẩm bột dược liệu…………………………………………….… 24 Bảng 3.2 Một số thông số thể phù hợp hệ HPLC lựa chọn…… 33 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại với chất nghiên cứu…….………… 34 Bảng 3.4 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính mangiferin…….… 34 Bảng 3.5 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính daucosterol……… 35 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 7α-hydroxysitosterol…………………………………………… 36 Bảng 3.7 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính lupeol…………… 36 Bảng 3.8 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính taraxeryl acetat… 37 Bảng 3.9 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính stigmasterol…… 38 Bảng 3.10 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính taraxerol……… 38 Bảng 3.11 Tổng hợp kết khảo sát độ hợp chất……………… 39 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ với mangiferin………………………… 39 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ với daucosterol………………………… 40 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ với 7α-hydroxysitosterol……………… 40 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ với lupeol……………………………… 40 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ với taraxeryl acetat…………………… 41 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ với stigmasterol……………………… 41 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ với taraxerol…………………………… 41 Bảng 3.19 Kết khảo sát LOD LOQ (µg/ml) ………………………… 42 Bảng 3.20 Kết xác định hàm lượng chất mẫu dược liệu nghiên cứu………………………………………… 42 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - 38 - Diện tích pic (mAU.s) 40000 35000 S = 959,80.C + 17,58 R² = 1,0000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 10 15 20 25 30 35 Nồng độ chất đối chiếu Stigmasterol (mcg/ml) 40 Phương trình hồi quy xác định là: S = 959,80.C+17,58 Phương trình đường chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát 3,636,4µg/ml với hệ số tương quan r 1,0000 Bảng 3.10 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính taraxerol STT Nồng độ C (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 5,5 8,3 11,0 22,1 33,1 55,2 8851 13251 17601 35301 53091 88450 Diện tích pic (mAU.s) 100000 80000 S = 1602,88.C - 27,29 R² = 1,0000 60000 40000 20000 0 10 20 30 40 50 Nồng độ chất đối chiếu Taraxerol (mcg/ml) 60 Phương trình hồi quy xác định là: S=1602,88.C-27,29 Phương trình đường chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát 5,555,2µg/ml với hệ số tương quan r 1,0000 - 39 - Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ chất phân tích diện tích pic đáp ứng khoảng nồng độ khảo sát hợp chất nghiên cứu Kết sử dụng làm sở để lựa chọn nồng độ định lượng hợp chất nghiên cứu tương ứng 3.5.4 Độ Thêm lượng xác dung dịch chuẩn vào dung dịch thử, cho tổng nồng độ sau thêm nằm khoảng tuyến tính phương pháp Tiến hành phân tích kết sắc ký để khảo sát độ Kết tổng hợp bảng 3.11, chi tiết cho chất thể bảng 3.12 đến bảng 3.18 Bảng 3.11 Tổng hợp kết khảo sát độ hợp chất Nồng độ thêm vào mẫu (μg/ml) Hợp chất Mangiferin Daucosterol 7-hydroxy sitosterol Lupeol Taraxeryl acetat Stigmasterol Taraxerol 6,43 2,72 2,75 7,17 5,09 1,92 4,42 Tỷ lệ thu hồi (%) Trung bình 100,69 101,42 100,75 100,22 100,25 101,22 100,10 (min-max) 98,34-102,04 100,58-102,19 100,02-101,76 99,54-101,48 98,85-102,61 100,28-102,27 99,00-101,84 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ với mangiferin TT Smẫu (mAU.s) 169480 168431 169540 168650 168896 168565 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 196595 196245 196346 196355 196546 196145 6,43 C cũ (µg/ml) 40,00 39,75 40,01 39,80 39,86 39,78 C (µg/ml) 46,39 46,31 46,34 46,34 46,38 46,29 C tìm lại (µg/ml) 6,39 6,56 6,33 6,54 6,52 6,51 Trung bình % tìm lại 99,48 102,04 98,34 101,64 101,44 101,18 100,69 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - 40 - Bảng 3.13 Kết khảo sát độ với daucosterol TT Smẫu (mAU.s) 6194 6170 6125 6156 6243 6162 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 9070 9034 9012 9045 9153 9062 C cũ (µg/ml) 3,07 3,06 3,04 3,05 3,09 3,05 C (µg/ml) 4,44 4,43 4,42 4,43 4,48 4,44 1,36 C tìm lại (µg/ml) 1,37 1,37 1,38 1,38 1,39 1,39 Trung bình % tìm lại 101,02 100,58 101,40 101,46 102,19 101,85 101,42 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ với 7-hydroxysitosterol TT Smẫu (mAU.s) 3568 3510 3534 3556 3543 3562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 5871 5850 5872 5865 5853 5862 C cũ (µg/ml) 4,29 4,22 4,25 4,27 4,26 4,28 C (µg/ml) 7,04 7,02 7,04 7,04 7,02 7,03 2,75 C tìm lại (µg/ml) 2,76 2,80 2,80 2,76 2,76 2,75 Trung bình % tìm lại 100,17 101,76 101,68 100,41 100,44 100,02 100,75 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ với lupeol TT Smẫu (mAU.s) 50552 50367 50454 50356 50243 50562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 65841 65542 65672 65665 65453 66032 7,17 C cũ (µg/ml) 23,76 23,67 23,71 23,66 23,61 23,76 C (µg/ml) 30,95 30,80 30,87 30,86 30,76 31,04 C tìm lại (µg/ml) 7,19 7,14 7,16 7,20 7,15 7,27 Trung bình % tìm lại 100,29 99,54 99,82 100,42 99,77 101,48 100,22 - 41 - Bảng 3.16 Kết khảo sát độ với taraxeryl acetat TT Smẫu (mAU.s) 24501 24470 24454 24356 24243 24562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 31100 30942 31172 30865 30753 31132 C cũ (µg/ml) 18,38 18,36 18,35 18,27 18,18 18,43 C (µg/ml) 23,51 23,39 23,57 23,33 23,24 23,54 5,09 C tìm lại (µg/ml) 5,13 5,03 5,22 5,06 5,06 5,11 Trung bình % tìm lại 100,80 98,85 102,61 99,42 99,43 100,35 100,25 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ với stigmasterol TT Smẫu (mAU.s) 5370 5340 5325 5456 5343 5362 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 8210 8144 8152 8265 8203 8202 C cũ (µg/ml) 3,69 3,67 3,66 3,75 3,67 3,68 C (µg/ml) 5,64 5,59 5,60 5,68 5,64 5,63 1,92 C tìm lại (µg/ml) 1,95 1,93 1,94 1,93 1,96 1,95 Trung bình % tìm lại 101,59 100,28 101,11 100,46 102,27 101,58 101,22 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ với taraxerol TT Smẫu (mAU.s) 32055 32367 32345 32356 32243 32562 C thêm (µg/ml) S thêm (mAU.s) 39084 39442 39372 39365 39453 39732 4,42 C cũ (µg/ml) 20,02 20,22 20,20 20,21 20,14 20,34 C (µg/ml) 24,41 24,63 24,59 24,58 24,64 24,81 C tìm lại (µg/ml) 4,39 4,41 4,38 4,37 4,50 4,47 Trung bình % tìm lại 99,30 99,94 99,26 99,00 101,84 101,28 100,10 Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy phương pháp phân tích lựa chọn cho tỷ lệ thu hồi cao, có độ tốt Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - 42 - 3.5.5 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ Xác định LOD dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường (S/N) Việc xác định tỉ lệ S/N tiến hành cách so sánh đáp ứng mẫu trắng từ tính nồng độ tối thiểu chất phân tích phát Tỷ lệ S/N nằm 3:1 2:1 thường chấp nhận để thiết lập giới hạn phát Tỷ lệ S/N khoảng 10:1 thường chấp nhận để thiết lập giới hạn định lượng Kết ghi bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết khảo sát LOD LOQ (µg/ml) Mangiferin Daucosterol 7-hydroxy sitosterol Lupeol Taraxeryl acetat Stigmasterol Taraxerol LOD 1,67 0,34 0,33 0,61 1,80 0,32 0,83 LOQ 3,35 0,8 0,96 1,43 4,07 0,91 2,94 Nhận xét: Kết khảo sát cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, giới hạn định lượng LOQ thấp nồng độ định lượng nhiều lần Việc xác định LOQ chủ yếu giúp cho việc phân tích tạp chất Nhận xét chung: Từ kết thẩm định tính đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại phương pháp định lượng thành phần Gạo HPLC thu trên, cho phương pháp hoàn toàn phù hợp để xác định hàm lượng thành phần Gạo, phục vụ cho mục tiêu khai thác nguyên liệu Gạo - 43 - ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO 3.6 Bảng 3.20 Kết xác định hàm lượng chất mẫu dược liệu nghiên cứu Hợp chất Khối lượng hợp chất (mg) Có cắn đem định Tương đương 0,5 g cắn lượng Lần Lần Lần Lần Lần Lần Tr.bình Hàm lượng (mg/100g dl) Mangiferin 0,953 0,949 0,944 0,941 0,943 0,939 0,941 8,145 Daucosterol 0,132 0,132 0,131 0,130 0,131 0,131 0,131 1,130 0,108 0,108 0,111 0,106 0,107 0,111 0,108 0,937 0,650 0,667 0,661 0,642 0,662 0,658 0,654 5,660 0,473 0,474 0,477 0,467 0,471 0,475 0,471 4,077 Stigmasterol 0,103 0,106 0,104 0,102 0,105 0,103 0,103 0,895 Taraxerol 0,598 0,595 0,599 0,591 0,592 0,596 0,593 5,133 7α-hydroxy sitosterol Lupeol Taraxeryl acetat Lượng cắn cân cho lần định lượng là: 0,5064g; 0,5032g 0,5022g Tiến hành song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp chất đối chiếu Tính tốn lượng chất có mẫu thử tương đương với 0,5000g cắn Tính giá trị trung bình lần thử Từ lượng dược liệu đem chiết hàm ẩm tổng lượng cắn thu tính hàm lượng chất có 100g dược liệu khô Kết thu bảng 3.20 3.7 BÀN LUẬN 3.7.1 Về phương pháp xử lý mẫu Để định lượng chất Gạo đạt kết tốt, trước hết cần phải chiết kiệt hoạt chất làm dịch chiết Qua tham khảo tài liệu, chọn phương pháp ngâm lạnh với dung môi methanol Đây phương pháp dễ thực điều kiện phòng thí nghiệm, khơng đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt mà lại cho hiệu suất cao 3.7.2 Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC Dựa nghiên cứu trước tài liệu công bố, kết hợp với điều kiện có sẵn tơi tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký mô tả mục 3.2 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - 44 - xây dựng chương trình sắc ký máy sắc ký lỏng hiệu cao Việc đánh giá thơng qua xác định tính phù hợp hệ thống sắc ký, khả tách pic khỏi chất khác, hình ảnh pic SKĐ thời gian lưu Kết chất HPLC tách hoàn tồn, pic cân đối, thời gian lưu khơng q dài Điều chứng tỏ, chương trình sắc ký sử dụng đề tài phù hợp để định lượng thành phần Gạo 3.7.3 Về kết định lượng chất Gạo Từ mẫu Gạo dùng nghiên cứu xác định hàm lượng chất nghiên cứu có 100 g Gạo khô sau mangiferin 8,15mg, daucosterol 1,13mg, 7-hydroxysitosterol 0,94mg, lupeol 5,66mg, taraxeryl acetat 4,08mg, stigmasterol 0,90mg taraxerol 5,13mg Cần làm thêm số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu xác hàm lượng chất có Gạo 3.7.4 Về thẩm định phương pháp định lượng Sau xây dựng quy trình phân tích, để áp dụng quy trình vào phân tích thực tế cách xác, cho kết tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp theo quy định chung phân tích định lượng  Độ chọn lọc: Nhờ có phần mềm xử lý thô, ghi lại pic sắc ký pic chất thu SKĐ tinh khiết Chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc cao  Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính bảng 3.4 – 3.10 cho thấy chất có đường hồi quy khoảng nồng độ khảo sát có đường thẳng, phương trình hồi quy có hệ số tương quan >0,99 chứng tỏ tương quan tuyến tính nồng độ chất diện tích pic khoảng nồng độ khảo sát  Độ đúng, độ lặp lại phương pháp: Đều cho kết phù hợp với yêu cầu thực tế cần phân tích - 45 -  Giới hạn định lượng: Với cách chuẩn bị dung dịch thử giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) trình bày bảng 3.19 mục 3.5.5 Như vậy, chương trình định lượng chất Gạo phương pháp HPLC mà tơi xây dựng hồn tồn đáng tin cậy Đồng thời phương pháp có ưu điểm đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian chi phí kiểm nghiệm Hiện đa số Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm đến sở sản xuất thuốc trang bị máy HPLC Vì vậy, kết nghiên cứu đề tài triển khai ứng dụng vào thực tế KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, triển khai thực nghiệm thu các kết sau: (1) Đã xây dựng phương pháp cho phép định lượng đồng thời hợp chất Gạo sắc ký lỏng hiệu cao với điều kiện sắc ký cụ thể sau: - Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; µm), nhiệt độ 25º - Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A acid formic 0,1% acetonitril kênh B acid formic 0,1% methanol Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Detector PDA bước sóng làm việc 280 nm - Thể tích tiêm: 10 μL (2) Phương pháp xây dựng thẩm định, kết cho thấy tiêu đạt yêu cầu, đảm bảo phương pháp áp dụng vào định lượng chất có Gạo (3) Đã áp dụng phương pháp xác định đồng thời hàm lượng hợp chất nghiên cứu có 100g 01 mẫu Gạo khô cụ thể sau: mangiferin 8,15mg, daucosterol 1,13mg, 7-hydroxysitosterol 0,94mg, lupeol 5,66mg, taraxeryl acetat 4,08mg, stigmasterol 0,90mg taraxerol 5,13mg ĐỀ XUẤT - Tiếp tục phân lập tinh chế thêm hợp chất có Gạo để tiến hành thiết lập chất đối chiếu Đây cơng việc quan trọng để Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - 46 - cho kết xác định hàm lượng chất Gạo xác ổn định - Vì thời gian có hạn, chúng tơi tiến hành phân tích, so sánh 01 mẫu Gạo nên chưa có tính đại diện cao Do đó, cần mở rộng nghiên cứu, phân tích mẫu Gạo khác Việt Nam để có số liệu xác hàm lượng hợp chất có Gạo - Hồn thiện phương pháp, để góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Gạo (Bombax malabaricum DC.) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích II, NXB Y học Hà Nội Trần Tử An (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội Trần Thị Điểm Anh, (2001), Nghiên cứu thành phần hóa học thử tác dụng chống viêm phân đoạn Ethylacetat chiết xuất từ vỏ thân Gạo (Bombax malabaricum DC.), họ Gạo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội Đỗ Huy Bích cs (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 852 Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, 464465 Nguyễn Hoàng Hạt, Nguyễn Công Hào, Nguyễn Cửu Khoa (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học Mộc ký ngũ hùng Dendrophtoe Pentadra (L.) MIQ., họ Chùm gửi (Loranthaceae) ký sinh mít (Artocarpus Integrifolia) na (Annona Aquamosa)”, Tạp chí hóa học, (4), 48 Bùi Thị Hằng (1991), “Định lượng mangiferin phương pháp sắc ký lỏng cao áp”, Tạp chí Dược học, (5), 28-29 10 Phạm Văn Hiền (2007), Bệnh học da virus, NXB Y học, Hà Nội 11 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, II, NXB Trẻ, 513 12 Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), “Phân lập catechin momor-cerebrosid I từ vỏ thân gạo (Bombax malabaricum DC.)”, Tạp chí Dược học, 12/2012 (440), 49-52 13 Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), “Phân lập lupeol stigmasterol từ vỏ thân gạo (Bombax malabaricum DC.)”, Tạp chí Dược học, 3/2013 (443), 14-18 14 Đoàn Thị Mai Hương, Phạm Văn Cường, Nguyễn Văn Hùng, Marc Litaudon (2009), “Nghiên cứu thành phần hóa học thân Thàn mát thùy dày (Millettia Pachylobadrake – Leguminosae)”, Tạp chí Hóa học, 47(6B), 209-212 15 Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 545 16 Phạm Luận, (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Khoa Hóa Học, Trường ĐHKHTN Hà Nội Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 17 Nguyễn Hải Ngọc (2012), Chiết xuất, phân lập số thành phần từ Gạo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội 18 Nguyễn Thị Thúy (2011), Nghiên cứu đặc điểm vi học thành phần hoá học gạo (Bombax malabaricum DC.), họ gạo (Bombacaceae), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội 19 Viện Dược liệu – Bộ Y tế (2009), Cây thuốc Nghệ An, NXB Sở thông tin truyền thông Nghệ An, 354 20 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Quyển I, NXB Khoa học kỹ thuật, 852-853 Tiếng Anh 21 Agrawal GD, Rizvi SA, Gupta PC, Tewari JD (1972), “Study of a polysaccharide from the stamens of Bombax malabaricum flowers”, Planta Med, 21(3), 293-303 22 Chelvan PT (1998), “Traditional phytotherapy among the migrant Tamilian settlers in South Gujarat”, Biojournal, 10, 9-14 23 Dar A, Faizi S, Naqvi S, Roome T, Zikr-ur-Rehman S, Ali M, Firdous S, Moin ST (2005), “Analgestic and antioxidant activity of Mangiferin and its derivatives: the structure activity relationship”, Biol Pharm Bull, 28(4), 596-600 24 David R Lide (2007), CRC Handbook of Chemistry and Physics 8th Edition 2007-2008, CRC Press, Taylor & Francis, Boca Raton 25 Dhar DN, Munjal RC (1976), “Chemical examination of the seeds of Bombax malabaricum”, Planta Med, 29(2), 148-150 26 Dong Sheng Ming, Emma S Guns, Andy Eberding, G.H Neil Towers (2004), “Isolation and Characterization of Compounds with Anti-prostate Cancer Activity from Arctium lappa L Using Bioactivity-guided Fractionation”, Pharmaceutical Biology, Vol 42(1), 44–48 27 En-Ji Cui, Ji-Hae Park, Hee-Jung Park, In-Sik Chung, Ji-Young Kim, SeungWoo Yeon, and Nam-In Baek (2011), “Isolation of Sterols from Cowpea (Vigna sinensis) Seeds and Their Promotion Activity on HO-1”, J Korean Soc Appl Biol Chem., 54(3), 362-366 28 Faizi S et al (1999), “Shamimin: a new flavonol C-glycoside from leaves of Bombax ceiba”, Planta Med, 65(4), 383-385 29 Hossain E et al (2011), “Larvicidal activity of Dregea volubilis and Bombax malabaricum leaf extracts against the filarial vector Culex quinquefasciatus”, Asian Pac J Trop Med, 4(6), 436-441 30 Ignacio Hernández-Chávez, Luis W Torres-Tapia, Paulino Simá-Polanco, Roberto Cedillo-Rivera, Rosa Moo-Puc and Sergio R Peraza-Sánchez (2012), “Antigiardial Activity of Cupania dentata Bark and its Constituents”, J Mex Chem Soc., 56(2), 105-108 31 Jain V et al (2009), “Myths, traditional and fate of multipose Bombax ceiba L – An appraisal”, Indian Journal of traditional knowledge, Vol 8(4), 638644 32 Jain V et al (2012), Pharmacology of Bombax ceiba Linn., Springer 33 Jin-Hee Lee, Dong-Hyun Kim, Myun-Ho Bang, Hye-Joung Yang, Sung-Hoon Bang (2005), “Isolation of Sterols from the Methanol Extracts of Cymbidium goeringii REICHB Fil”, J Korean Soc Appl Biol Chem., 48(3), 263-266 34 Jue-Hee Lee, Ju Young Lee, Ji Hye Park, Hye Sil Jung, Ju Sun Kim, Sam Sik Kang, Yeong Shik Kim, Yongmoon Han (2007), “Immunoregulatory activity by daucosterol, a β-sitosterol glycoside, induces protective Th1 immune response against disseminated Candidiasis in mice”, Vaccine, (25), 3834–3840 35 M Careri, L Elviri, A Mangia (2001), “Liquid chromatography–UV determination and liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric characterization of sitosterol and stigmasterol in soybean oil”, Journal of Chromatography A, 935(1–2), 249–257 36 Margareth B C Gallo, Miranda J Sarachine (2009), “Biological Activities of Lupeol”, International Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, 3(1), 46-66 37 Mark Sacchetti, Ph.D., Anne C Schuelke, Edmund J Elder, Jr., Ph.D., R.Ph., Karen J Jones, M.S., Jeremy J Johnson, Pharm.D., Ph.D (2011), Physicochemical Characterization of Lupeol and Development of a Preclinical Formulation for Oral Administration, Lenor Zeeh Pharmaceutical Experiment Station, School of Pharmacy, University of Wisconsin – Madison, Chicago 38 Mohammed Rahmatullah, Md Rezwanul Haque., Sarder Kamrul Islam, Farhana Jarnal, A.B.M Anwarul Bashar, Rasheda Ahmed, Ishtiaq Ahmed, Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Rownak Jahan, Shamima Absan, Maieedul H Chowdhury (2010), “A survey of the Use of Medicinal Plants by Folk Medicinal Practitioners in Three Areas of Pirojpur District, Bangladesh”, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture, 4(2), 247-259 Mohammad Saleem (2009), “Lupeol, A Novel Anti-inflammatory and Anticancer Dietary Triterpene”, Cancer Lett., 285(2), 109–115 Moreau R.A (2002), “Phytosterols, phytostanols, and their conjugates in foods: structural diversity, quantitative analysis, and health-promoting uses”, Prog Lipid Res, 41(6), 457-500 Nasim Sultana, A J Afolayan (2007), “A novel daucosterol derivative and antibacterial activity of compounds from Arctotis arctotoides”, Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, Vol 21(10), 889-896 Padmanabhan P Nair, NabilaTurjman, GeorgeKessie, BeverlyCalkins, Gordon T Goodman, Helene Davidovitz, and Geetha Nimmagadd (1984), “Diet, nutrition intake, and metabolismin,Populations at high and low risk for colon cancer Dietary cholesterol,f3-sitosterol,and stigmasterol”, The American Journal of Clinical Nutrition, 40(4), 927-930 Richard E Ostlund Jr (2007), “Phytosterols, Cholesterol Absorption and HealthyDiets”, Lipids, 42(1), 41-45 Saleem R et al (1999), “Hypotensive, hypoglycaemic and toxicological studies on the flavonol C-glycoside shamimin from Bombax ceiba”, Planta Med, 65(4), 331-334 Shaahat AA, Hassan RA, Nazif NM, Van Miert S, Pueters L, Hammuda FM, Vlietinck AJ (2003), “Isolation of mangiferin from Bombax malabaricum and structure revision of shamimin”, Planta Med, 69(11), 1068-1070 Sundararaman P, Djerassi C (1977), "A convenient synthesis of progesterone from stigmasterol", J Org Chem., 42(22), 3633–3634 Toshihiro Miura, Hiroyuki Ichiki, Itsuko Hashimoto, Naoki Iwamoto, Motoshi Kato, Masayoshi Kubo, Eriko Ishihara, Yasuhiro Komatsu, Minoru Okada, Torao Ishida and Tanigawa (2001), “Antidiabetic activity of a xanthone compound, mangiferin”, Phytomedicine, Vol 8(2), 85–87 Vartika Jain, Surendra K Verma (2012), Pharmacology of Bombax ceiba Linn., SpringerBriefs in Pharmacology and Toxicology Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2012), “Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus”, Chaturvedula and Prakash, International Current Pharmaceutical Journal, 1(9), 239-242 50 Young-Jae You, Nguyen Hai Nam, Yong Kim, Ki-Hwan Bae and Byung-Zun Ahn(2003), “Antiangiogenic Activitiy of Lupeol from Bombax ceiba”, Phytother Res., 17(4), 341-344 51 Zheng MS, Lu ZY (1990), “Antiviral effect of mangiferin and isomangiferin on herpes simplex virus”, Chinese Medical Journal, 103(2), 160 52 Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao (2011), “Effects of taraxerol and taraxeryl acetate on cell cycle and apoptosis of human gastric epithelial cell line AGS”, Journal of Chinese Integrative Medicine, 9(6), 638 53 ZUO Xu, DAI Xian-zhi, ZHANG Ji-zhong, LIU Yuan (2012), “Content determination of Daucosterol in roots, stems and leaves of wild Plumbago zeylanica L by RP-HPLC-ELSD”, Medicinal Plant 2012, 3(6), 14-15, 18 Tài liệu khác 54 http://www.drugfuture.com/chemdata/taraxerol.html Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi PHỤ LỤC Sắc ký đồ mẫu thử hợp chất nghiên cứu (1) Mẫu thử (2) Mangiferin (3) Daucosterol (4) 7α-hydroxysitosterol (5) Lupeol (6) Taraxeryl acetat (7) Stigmasterol (8) Taraxerol ... đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng số chất phân lập từ Gạo thực nhằm mục đích sau: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời số hợp chất phân lập từ Gạo phương pháp HPLC... TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI WY ZX KIỀU THỊ BÍCH HUỆ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LÁ CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS... Thẩm định điều kiện định lượng số hợp chất với chất đối chiếu chất phân lập qua nhận dạng cấu trúc xác định tổng tạp chất phương pháp chuẩn hóa diện tích - Áp dụng để sơ xác định hàm lượng hợp chất