BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT SINH PHƠI VƠ TÍNH TRÊN CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH VƯƠNG Niên khóa: 2006 -2010 Tháng năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÁT SINH PHƠI VƠ TÍNH TRÊN CÂY DẦU MÈ (Jatropha curcas L.) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN VŨ PHONG LÊ THANH VƯƠNG Tháng năm 2010 LỜI CẢM ƠN Để hồn tất khóa luận tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, bạn bè gia đình Sau tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: ▬ Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận ▬ Thạc sỹ Nguyễn Vũ Phong tận tình hướng dẫn, giúp đỡ nhiều động viên suốt thời gian làm đề tài ▬ Các bạn Huỳnh Thanh Khoa, Nguyễn Thị Bích Liễu, Vũ Thị Nguyệt, Ngô Thị Tú Trinh, Nguyễn Trung Tuyến tập thể lớp DH06SH động viên giúp đỡ lúc tơi khó khăn Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người bên con, cho niềm tin nghị lực để vượt qua khó khăn i TĨM TẮT Cây dầu mè Jatropha curcas L loại có triển vọng việc cung cấp nguyên liệu để sản xuất phát triển nhiên liệu sinh học (biofuel) Hiện tìm thấy nhiều nước giới có khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới Cây có nhiều ưu điểm dễ trồng, tính thích nghi rộng rãi, khả chống chịu tốt, thời gian sống đến 50 năm Trồng dầu mè quy mô lớn việc làm cần thiết để đảm bảo đủ nguồn vật liệu ban đầu cho hướng sản xuất nhiên liệu sinh học Tuy nhiên việc nhân giống từ hạt giâm cành nhiều nhược điểm chất lượng giống không đồng đều, phụ thuộc vào mùa vụ Phát sinh phơi vơ tính hướng kỹ thuật ni cấy mơ khắc phục nhược điểm Ở Việt Nam, nhân giống in vitro dầu mè thành công từ mẫu chồi hạt, chưa thấy công bố phát sinh phơi vơ tính dầu mè Do đề tài “Nghiên cứu phát sinh phơi vơ tính dầu mè (Jatropha curcas L.)” thực với mục đích tìm quy trình phát sinh phơi vơ tính, tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho nhân giống in vitro dầu mè với số lượng lớn cho nghiên cứu chuyển gen, công nghệ hạt nhân tạo Sau thời gian nghiên cứu tháng, ghi nhận kết sau: môi trường tạo mô sẹo tốt môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L IBA mg/L BA; mẫu cấy cuống đáp ứng tạo mô sẹo tốt mẫu thân; môi trường MS bổ sung BA TDZ với nồng độ mg/L 1,5 mg/L riêng lẻ kết hợp với 0,1 mg/L IBA chưa tạo phôi sau tháng nuôi cấy mô sẹo ii SUMMARY Jatropha curcas L is prospective in providing material to produce and develop biofuel It is planted in many tropical and subtropical countries in the world The advantages of jatropha are large adaption, good tolerance, easy to plant Planting jatropha in large-scale is essential to guarantee initial material for producing biofuel However, there are still disadvantages in multiplication such as quatitive seed Somatic embryogenesis is a trend of plant tissue culture that can improve these troubles In Vietnam, jatropha was successfully multiplicated from shoot and seed, but did not have any research on jatropha somatic embryogenesis Somatic embryogenesis is used to make initial material to raise in vitro jatropha in large-scale and following study such as gene transformation, artificial seed, etc Therefore, the study “Research somatic embryogenesis of Jatropha curcas L.” was carried out to find out somatic embryogenesis protocol After months studying, these results were achieved: suitable medium for callus induction is MS medium supplemented with 0,2 mg/l IBA and 1mg/l BA; callus from leaf and stem explant is suitable; after month culture callus on MS medium supplemented with different concentrations – 1,5 mg/l BA or TDZ alone or combinate with 0,1 mg/l IBA haven’t formed somatic embryogenesis yet Key words: Jatropha curcas L., callus, embryogenesis iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nuôi cấy mô 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Các phương pháp nuôi cấy in vitro 2.1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 2.1.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 2.1.2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn 2.1.2.4 Nuôi cấy tế bào trần 2.1.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn bội 2.1.3 Tầm quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.6 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2 Nuôi cấy phát sinh phơi vơ tính 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Ý nghĩa nuôi cấy phát sinh phơi vơ tính 2.2.3 Sự hình thành phơi vơ tính 2.2.3 Cơ chế trở lại trạng thái tế bào có khả sinh phơi từ tế bào soma: 2.2.4 Các kiểu phát sinh phôi vô tính iv 2.2.4.1 Sự phát sinh phơi vơ tính bất định 2.2.4.2 Sự phát sinh đa phơi vơ tính 2.2.4.3 Sự phát sinh phơi vơ tính cảm ứng 2.2.4.4 Nguồn gốc phơi vơ tính 2.2.5 Những nhân tố ảnh hưởng đến hình thành phơi vơ tính 2.2.5.1 Mẫu cấy 2.2.5.2 Chất điều hòa tăng trưởng 10 2.2.5.3 Môi trường nuôi cấy 12 2.2.5.4 Nguồn carbohydrate 13 2.2.5.5 Sự tương quan độ tuổi mẫu cấy sucrose 13 2.2.5.6 Thời gian xử lý 13 2.2.5.7 Kiểu gene đặc điểm mẫu cấy 13 2.2.5.8 Điều kiện môi trường chiếu sáng 14 2.2.6 Ni cấy phát sinh phơi vơ tính từ mô sẹo 14 2.2.6 Những vấn đề thường gặp trình phát sinh phơi vơ tính 15 2.3 Giới thiệu dầu mè (Jatropha curcas L.) 16 2.3.1 Đặc điểm sinh học 16 2.3.1.1 Mô tả 17 2.3.1.2 Điều kiện sinh trưởng phát triển 17 2.3.1.3 Ưu dầu mè 17 2.3.1.4 Nguồn gốc dầu mè 18 2.3.2 Công dụng 18 2.3.3 Thành phần đặc tính dầu hạt dầu mè 19 2.3.4 Dầu mè nhiên liệu sinh học 20 2.3.5 Ảnh hưởng môi trường đến suất hạt 20 2.3.6 Nhân giống 21 2.3.6.1 Phương pháp nhân giống cổ truyền 21 2.3.6.2 Phương pháp nhân giống đại 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu 24 3.1.1 Thời gian địa điểm 24 3.1.2 Đối tượng thí nghiệm 24 v 3.1.3 Trang thiết bị dụng cụ 24 3.1.4 Hoá chất 24 3.1.4 Điều kiện nuôi cấy 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên tạo mơ sẹo 26 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng loại mẫu cấy lên tạo mô sẹo 27 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả tạo phôi vơ tính 28 3.3 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên tạo mô sẹo 29 4.3 Ảnh hưởng mẫu cấy lên tạo mô sẹo 31 4.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả tạo phơi vơ tính 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BA 6-benzyladenine DNA: deoxyribo nucleic acid IBA: indole-3-butyric acid MS: Murashige and Skoog MT: Murashige and Tucker NAA: α-naphtalene acetic acid TDZ: thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3-thidiazon-5-ylurea) DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm hóa lý dầu hạt dầu mè 19 Bảng 3.1 Các loại môi trường tạo mô sẹo 26 Bảng 3.2 Loại mẫu cấy thành phần môi trường 27 Bảng 3.3 Thành phần môi trường 28 Bảng 4.1 Thời gian xuất mô sẹo 29 Bảng 4.2 Bảng trọng lượng trung bình mơ sẹo sau tuần ni cấy 30 Bảng 4.3 Thời gian xuất mô sẹo 31 Bảng 4.4 Trọng lượng mô sẹo sau tuần nuôi cấy 32 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển phơi vơ tính Hình 2.2 Cây dầu mè 16 Hình 2.3 Hoa, hạt dầu mè 18 Hình 3.1 Mẫu lá, cuống thân 27 Hình 4.2 Mơ sẹo từ mẫu cuống 30 Hình 4.3 Mơ sẹo từ loại mẫu cấy 32 vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Với phát triển kinh tế - xã hội mạnh mẽ nay, giới phải đối mặt với vấn đề an ninh lượng Nguồn lượng hóa thạch đứng trước nguy cạn kiệt Cho đến nay, dầu mỏ đóng vai trò vơ quan trọng việc cung cấp lượng cho giới, nên mỏ dầu có nguy cạn kiệt, nhiều nguồn lượng thay đề xuất Trước tiên phải kể đến than đá Than đá trữ lượng lớn Nhưng loại lượng có hại cho mơi trường thải nhiều khí độc hại Pin nhiên liệu hydro, xem lựa chọn độc đáo thay dầu lửa Loại pin chứa hỗn hợp hóa học hydro oxy, cung cấp lượng sạch, lâu bền tái sử dụng Tuy nhiên nay, giá thành sản xuất loại nhiên liệu đắt Như vậy, để đảm bảo an ninh lượng, việc quốc gia cần phải sử dụng tiết kiệm nguồn lượng có, bên cạnh cần phải tìm nguồn lượng tái tạo, thân thiện với môi trường, hiệu kinh tế cao đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững Năng lượng sinh học nguồn lượng thay đáp ứng đòi hỏi đó, trọng phát triển từ năm 1980, bao gồm hai sản phẩm ethanol dầu diessel sinh học Dầu diessel sinh học có lợi ethanol không làm ảnh hưởng xấu đến an ninh lương thực Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) giải pháp hữu hiệu nguyên liệu sản xuất diessel sinh học, dễ trồng chống chịu tốt, hạt dầu mè có hàm lượng dầu cao, phổ biến từ 35 -40% (NIIR Board of consultans and Engineers, 2006), loại dầu thân thiện với môi trường không chứa lưu huỳnh Ở Việt Nam, dầu mè nhập vào từ lâu song trồng phân tán làm bờ rào gia đình nơng thôn gần trồng tập trung Trong vài năm gần có nghiên cứu bước đầu giống, kỹ thuật trồng chiết xuất dầu lồi Ngày 19/6/2008, Bộ Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn có định 1842/QĐ – BNN - LN phê duyệt đề án “Nghiên cứu, phát triển sử dụng sản phẩm Cọc rào (Jatropha curcas L.) Việt Nam giai đoạn 2008 – Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Thời gian địa điểm Các thí nghiệm tiến hành Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thí nghiệm từ tháng 2/2010 đến tháng 6/2010 3.1.2 Đối tượng thí nghiệm Mẫu in vitro nuôi cấy từ hạt 3.1.3 Trang thiết bị dụng cụ + Tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, máy cất nước, pipet, ống đong, cân, bể rửa chai lọ, dụng cụ thủy tinh + Tủ cấy vô trùng + Giá bàn để môi trường + Môi trường + Các dụng cụ thao tác cấy: kéo, pince, ống thủy tinh, đèn cồn, đĩa nhôm đường kính 20 cm, cốc… + Các giá có tầng để bình ống nghiệm ni cấy + Các giá lắp đèn ống (ánh sáng trắng) để chiếu sáng + Trong phòng cần có máy móc kiểm tra xác: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, máy điều hòa nhiệt độ + Phòng ni tối dùng để ni mơ sẹo xử lý đặc biệt Các điều kiện giống phòng sáng khơng có đèn, cần che bên ngồi vải len bịt kín 3.1.4 Hố chất + Nước + Các chất kích thích tăng trưởng: auxin, cytokinin + Đường (sucrose) + Vitamine + Amino acid 24 Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Khoáng đa lượng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lượng (mg/l) MnSO4.4H2O 22,300 H3BO3 6,200 ZnSO4.4H2O 8,600 KI 0,830 Na2MoO4.2H2O 0,250 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Vitamins (mg/l) Glycine 2,0 Pirydoxine (B6) 0,5 Myo-inositol 100,0 Acid nicotinic (pp) 0,5 Thiamine (B1) Fe-EDTA 0,1 (mg/l) Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Để thuận tiện, môi trường nuôi cấy pha từ dung dịch mẹ chuẩn bị: khoáng đa lượng khoáng vi lượng , vitamin, Fe-EDTA Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật sử dụng BA, IBA, TDZ (mg/l) Các thành phần khác Đường sucrose 30 g/l Agar 8g /l Môi trường điều chỉnh pH 5,8 ± 0,05 (bằng KOH 1N HCl 1N) trước hấp khử trùng autoclave 1atm (1210C) 20 phút 25 3.1.4 Điều kiện ni cấy Phòng dưỡng có nhiệt độ 260C± 20C, thời gian chiếu sáng 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa lên tạo mơ sẹo Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng loại mẫu cấy lên tạo mơ sẹo Thí nghiệm 3: Khảo sát tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên tạo mơ sẹo Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần, lần mẫu Bảng 3.1 Các loại môi trường tạo mô sẹo Nghiệm Thành phần mơi trường thức Khống IBA (mg/l) BA (mg/l) 1.1 MS 0,2 0,5 1.2 MS 0,2 1,0 1.3 MS 0,2 2,0 1.4 MS 0,2 3,0 Mục đích thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng IBA BA lên khả tạo mơ sẹo, từ tìm mơi trường có nồng độ IBA BA thích hợp cho việc tạo mơ sẹo có khả sinh phơi Mẫu cấy sử dụng thí nghiệm cuống Mẫu cuống sử dụng thí nghiệm lấy từ in vitro tháng tuổi Mẫu cắt với kích thước 0,3 - 0,5 cm Môi trường bổ sung agar g/l, pH Sau cấy bình đựng mẫu đặt điều kiện hoàn toàn tối, nhiệt độ 26 ± 20C Chỉ tiêu theo dõi: Ngày xuất mô sẹo Tỉ lệ tạo sẹo = (số mẫu tạo sẹo/tổng số mẫu)*100 Trọng lượng tươi = trọng lượng lúc sau – trọng lượng lúc đầu Hình thái mơ sẹo 26 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng loại mẫu cấy lên tạo mơ sẹo Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần, lần mẫu Mẫu cấy tương ứng nghiệm thức: lá, cuống lá, thân in vitro tháng tuổi Mẫu cắt với kích thước 0,5 x 0,5 đến x cm; mẫu cuống cắt với kích thước 0,3 - 0,5 cm; mẫu thân cắt thành lát mỏng Hình 3.1 Mẫu lá, cuống thân Bảng 3.2 Loại mẫu cấy thành phần môi trường tạo mô sẹo Nghiệm thức Mẫu cấy Thành phần môi trường 2.1 Lá MS + IBA (0,2mg/l) + 2.2 Cuống BA (1mg/l) 2.3 Thân Mục đích thí nghiệm nhằm tìm loại mẫu cấy cho kết tạo sẹo tốt làm nguyên liệu cho thí nghiệm Mơi trường sử dụng có thành phần chất thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian xuất mô sẹo Tỉ lệ tạo sẹo = (số mẫu tạo sẹo/tổng số mẫu)*100 Trọng lượng tươi = trọng lượng lúc sau – trọng lượng lúc đầu Hình thái mơ sẹo 27 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả tạo phơi vơ tính từ mơ sẹo Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm nghiệm thức, nghiệm thức lặp lại lần, lần mẫu Bảng 3.3 Thành phần môi trường Nghiệm Thành phần mơi trường thức Khống IBA (mg/l) BA (mg/l) TDZ (mg/l) 3.1 MS 0,0 1,0 0,0 3.2 MS 0,0 1,5 0,0 3.3 MS 0,1 1,0 0,0 3.4 MS 0,1 1,5 0,0 3.5 MS 0,0 0,0 1,0 3.6 MS 0,0 0,0 1,0 3.7 MS 0,1 0,0 1,5 3.8 MS 0,1 0,0 1,5 Mục đích thí nghiệm nhằm khảo sát khả tạo phôi mơ sẹo Thành phần mơi trường thí nghiệm nồng độ auxin giảm loại bỏ hoàn toàn, nồng độ cytokinin tăng lên thay đổi cytokinin có hoạt tính mạnh TDZ Mẫu mơ sẹo lấy thí nghiệm trước sau tuần nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bổ sung agar g/l, pH = 5.8 Điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 26 ± 20C Chỉ tiêu theo dõi: số phôi tạo thành/mẫu 3.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý phần mềm STATGRAPHICS 3.0, kết đọc dựa bảng ANOVA bảng trác nghiệm phân hạng 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên tạo mô sẹo từ cuống Bảng 4.1 Thời gian xuất mô sẹo Nghiệm Thời gian xuất Hình thái IBA (mg/l) BA (mg/l) 1.1 0,2 0,5 Trắng xốp 1.2 0,2 1,0 Vàng 1.3 0,2 2,0 10 Vàng xanh 1.4 0,2 3,0 10 Xanh thức mô sẹo (ngày) Kết bảng 4.1 cho thấy: Nhìn chung tăng nồng độ BA thời gian xuất mô sẹo chậm dần Mô sẹo có thay đổi màu sắc từ trắng đến vàng nhạt xanh, từ mô sẹo xốp đến mô sẹo Nghiệm thức 1.1 có thời gian xuất mơ sẹo sớm (5 ngày) Khối mô sẹo gồm phần khác biệt: xốp có màu trắng, tăng sinh nhanh, xung quanh mơ sẹo chắc, có màu vàng tăng sinh chậm Nghiệm thức 1.3 1.4 mô sẹo xuất chậm (10 ngày) Nghiệm thức 1.3 mơ sẹo có màu vàng xanh, Nghiệm thức 1.4 mơ sẹo có màu vàng xanh, chắc, có khả tái sinh Nghiệm thức 1.2 thời gian xuất mơ sẹo trung bình, mơ sẹo có màu vàng mịn, tăng sinh đồng theo hướng Như có tương quan thời gian xuất mơ sẹo với hình thái mơ sẹo Mơ sẹo xuất sớm xốp, mơ sẹo xuất chậm Sự thay đổi nồng độ BA từ 0,5 mg/L đến mg/L nguyên nhân Ở nồng độ 0,5 mg/L, BA kết hợp với IBA tạo sẹo xốp chứng tỏ IBA chiếm ưu BA kích thích phân chia tế bào khơng tạo sẹo xốp auxin Và quan sát ta thấy, khối sẹo xốp, tế bào có nguồn gốc từ tế bào nhu mơ lõi, để khắc phục cắt mẫu cuống thành lớp mỏng dọc, loại bỏ tế bào nhu mô lõi 29 Với nồng độ 1mg/l, kết hợp với 0,2 mg/l IBA, BA kích thích tế bào tăng sinh mức vừa phải, tạo tế bào có khả tái sinh cao Đây môi trường tạo sẹo tốt Khi tăng nồng độ BA lên mức mg/l mg/l tế bào tăng sinh chậm lại, hàm lượng BA cao ức chế hoạt tính auxin nên làm giảm sinh trưởng phân chia tế bào Hình 4.2 Mơ sẹo từ mẫu cuống (a) 0,5 mg/l IBA; (b)1 mg/l IBA; (c) mg/l IBA; (d) mg/l IBA Bảng 4.2 Bảng trọng lượng trung bình mơ sẹo sau tuần ni cấy Nghiệm thức IBA (mg/l) BA (mg/l) Trọng lượng tươi (%) 1.1 0,2 0,5 0,267a 1.2 0,2 1,0 0,278a 1.3 0,2 2,0 0,131b 1.4 0,2 3,0 0,117b Trong cột, số tận khơng chữ khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với mức xác suất P < 0,01 30 Qua bảng 4.2 cho thấy: Kết tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo cao nghiệm thức 2.2, thấp nghiệm thức 2.4 Hai nghiệm thức 2.1 nghiệm thức 2.2 tăng sinh mạnh so với hai nghiệm thức 2.3 nghiệm thức 2.4 Như vậy, tăng nồng độ BA lên mức mg/l mg/l làm giảm khả tăng sinh mơ sẹo Nguyên nhân khác biệt tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo vai trò IBA BA thay đổi thay đổi nồng độ BA Ở nồng độ BA 0,5 mg/L mg/L kích thích IBA BA cao IBA kích thích tăng trưởng kéo dài tế bào, BA kích thích tế bào phân chia nhanh Như qua kết quan sát hình thái mô sẹo tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo cho thấy môi trường MS bổ sung 0,2 g/L IBA mg/L BA môi trường tạo sẹo tốt 4.3 Khảo sát ảnh hưởng mẫu cấy lên tạo mô sẹo Bảng 4.3 Thời gian xuất mô sẹo Nghiệm thức Loại mẫu Thời gian (ngày) Tỉ lệ tạo sẹo 2.1 Lá 7,86a 2.2 Cuống 10,02b 2.3 Thân 10,02b Trong cột số tận có chữ khơng giống khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với mức xác suất P < 0,01 Kết bảng 4.3 cho thấy Mẫu có thời gian tạo sẹo sớm (6 ngày), mẫu thân có thời gian xuất mô sẹo chậm (9 ngày) Mẫu cuống có thời gian xuất mơ sẹo ngày Tỷ lệ tạo sẹo mẫu thấp (7,86 ) Ở mẫu cấy thân cuống tỷ lệ tạo sẹo (10,02 ) Mẫu xuất mô sẹo sớm mẫu cuống thân do: Mẫu tiếp xúc với mơi trường ni cấy tốt diện tích tiếp xúc lớn Hàm lượng auxin cao nơi tổng hợp auxin nhiều Tuy nhiên tỷ lệ tạo sẹo mẫu không cao cảm ứng tạo sẹo mẫu phồng lên cuộn lại, số mẫu bị giảm diện tích tiếp xúc với mơi trường dinh dưỡng nên tạo sẹo chậm lại 31 Bảng 4.4 Trọng lượng mô sẹo từ mẫu lá, cuống lá, thân sau tuần nuôi cấy Nghiệm thức Mẫu cấy Trọng lượng tươi (mg) 2.1 Lá 0,277b 2.2 Cuống 0,274b 2.3 Thân 0,097a Trong cột số tận có chữ khơng giống khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với xác suất P < 0,01 Kết bảng 4.4 cho thấy trọng lượng tươi mô sẹo cao mẫu (0,277 g), tiếp đến mẫu cuống (0,274 g) thấp mẫu thân (0,097 g) Trọng lượng tươi tính chênh lệch trọng lượng mô sẹo sau tuần nuôi cấy với trọng lượng mẫu cấy lúc đầu Ở mẫu thân chênh lệch thấp cảm ứng tạo sẹo chậm mẫu cuống nên sau tuần nuôi cấy số lượng tế bào phân chia tạo Một lý khác biệt cấu trúc mẫu cấy Như loại mẫu cấy khác có đáp ứng tạo mơ sẹo khác Trường hợp mẫu cuống đáp ứng tốt mẫu thân nên chọn để nuôi cấy tạo mô sẹo sử dụng cho nghiên cứu khác Tuy nhiên sử dụng mẫu ex vitro cần ý việc xử lý vô trùng mẫu khó, mỏng dễ bị tổn thương a) b) Hình 4.3 Mơ sẹo từ loại mẫu cấy (a)Mô sẹo từ lá; (b)Mô sẹo từ cuống lá; (c) Mô sẹo từ thân c) 32 4.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả tạo phôi vô tính từ mơ sẹo Sau tháng ni cấy mơ sẹo mơi trường có bổ sung BA mơ sẹo khơng thay đổi kích thước hình thái đáng kể Trong mơi trường bổ sung TDZ tế bào mơ sẹo tăng sinh mạnh mẽ, tạo thành khối sẹo có kích thước lớn, mơ sẹo xanh xốp Tuy nhiên khơng có tạo phơi tất môi trường Nguyên nhân thời gian nuôi cấy chưa đủ để tế bào mô sẹo tích lũy vật chất phát triển thành phơi Theo nghiên cứu Timir baran Jha ctv (2007), việc ni cấy mơ sẹo phơi hóa phát triển thành phơi vơ tính giai đoạn hình cầu phải tuần Do việc kết luận mơi trường thích hợp hay khơng cần theo dõi tiếp, tuần 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Môi trường tạo sẹo tốt môi trường MS + IBA 0,2 (mg/l) + BA mg/l Loại mẫu cấy thích hợp cho ni cấy tạo mơ sẹo cuống Môi trường MS bổ sung BA nồng độ 1mg/l 0,5 mg/l bổ sung TDZ nồng độ mg/l 1,5 mg/l đơn lẻ kết hợp với IBA nồng độ 0,1 mg/l khơng tạo phơi vơ tính ni cấy mô sẹo với thời gian tháng 5.2 Đề nghị Theo dõi tiếp thí nghiệm tạo phơi để ghi nhận kết ảnh hưởng môi trường lên khả tạo phôi Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo mơi trường lỏng lắc Mục đích để tăng sinh khối mô sẹo tốt làm giảm khả tương tác tế bào mô sẹo nuôi cấy môi trường thạch nhằm làm tăng khả tạo phôi 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Quỳnh Anh 2009 Phân tích đánh giá đặc tính hóa học, hàm lượng dầu, acid béo hạt xác định thông số tối ưu để trích ly dầu nguyên liệu chuyển hóa biodiesel từ hạt số giống dầu mè (Jatropha curcas L.) địa thu nhập từ vùng địa lý khác Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trần Thị Dung 2003 Bài giảng Nuôi cấy mô tế bào thực vật Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Hạnh 2007 Nuôi cấy mô dầu mè (Jatropha curcas L.) Khóa luận tốt nghiệp ngành Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên 2006 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Lý Thị Lẹ 2006 Tái sinh phơi soma mít (Artocarpus heterophyllus Lam) Khóa luận tốt nghiệp ngành Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Dương Tấn Nhựt 2009 Một số phương pháp, hệ thống nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Nông nghiệp Dương Tấn Nhựt 2007 Công nghệ sinh học Tập Nhà xuất Nông nghiệp Bùi Trang Việt 2000 Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nước NII board of Consultants and Engineers 2006 The Complete Book on Jatropha (Bio–Diesel) with Ashwagandha, Stevia, Brahmi & Jatamansi Herbs (Cultivation, Processing & Uses) Asia Pacific Bussiness Press Inc 10 Hambali 2009 Jatropha for fuel Surfactant and Bioenergy Research CenterBogor Agriculture University 11 Timir baran Jha Priyanka Mukherjee and Mukul Manjari Datta, 2007 Somatic embryogenesis in Jatropha curcas Linn., an important biofuel plant Springer Japan 1:135 -140, 2007 35 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 1.2 0,277 0,257 0,266 0,267 1.2 0,277 0,272 0,284 0,278 1.3 0,134 0,117 0,142 0,131 1.4 0,113 0,118 0,119 0,117 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu Bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 0,066498 0,022166 0,00062 0,0000775 286,01 0,0000 Total (Corr.) 0,067118 11 Bảng Bảng phân hạng trắc nghiệm thí nghiệm kết bảng Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Nghiem thuc -Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -14 0,116667 X 13 0,131 X 11 0,266667 X 12 0,277667 X -Contrast Difference +/- Limits -11 - 12 -0,011 0,0165755 11 - 13 *0,135667 0,0165755 11 - 14 *0,15 0,0165755 12 - 13 *0,146667 0,0165755 12 - 14 *0,161 0,0165755 13 - 14 0,0143333 0,0165755 -* denotes a statistically significant difference 36 Phụ lục Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 2.1 8,45 7,56 7,56 7,86 2.2 10,02 10,02 10,02 10,02 2.3 10,02 10,02 10,02 10,02 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 9,36002 4,68001 0,528067 0,0880111 53,18 0,0002 Total (Corr.) 9,88809 Bảng Bảng phân hạng trắc nghiệm thí nghiệm kết Bảng Multiple Range Tests for Ty le tao seo by Nghiem thuc -Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -21 7,85667 23 10,02 X X 22 10,02 X -Contrast Difference +/- Limits -21 - 22 *-2,16333 0,59271 21 - 23 *-2,16333 0,59271 22 - 23 0,0 0,59271 -* denotes a statistically significant difference 37 Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình 2.1 0,279 0,262 0,292 0,278 2.2 0,268 0,281 0,274 0,274 2.3 0,101 0,100 0,090 0,097 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,0596442 Within groups 0,000586 0,0298221 305,35 0,0000 0,0000976667 Total (Corr.) 0,0602302 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm kết bảng Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Nghiem thuc -Method: 95,0 percent LSD Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -23 0,103333 X 22 0,274333 X 21 0,277667 X -Contrast Difference +/- Limits -21 - 22 0,00333333 0,0197445 21 - 23 *0,174333 0,0197445 22 - 23 *0,171 0,0197445 -* denotes a statistically significant difference 38 ... suitable medium for callus induction is MS medium supplemented with 0,2 mg/l IBA and 1mg/l BA; callus from leaf and stem explant is suitable; after month culture callus on MS medium supplemented... acid oleic (C18:1) acid linoleic (C18:2), ngồi có acid palmitic (C16:0) acid stearic (C18:0) Một số acid béo khác gồm acid capric, acid myristic (C14:0), acid palmitoleic (C16:1), acid linoleic... acetic acid BA 6-benzyladenine DNA: deoxyribo nucleic acid IBA: indole-3-butyric acid MS: Murashige and Skoog MT: Murashige and Tucker NAA: α-naphtalene acetic acid TDZ: thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3-thidiazon-5-ylurea)