BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH PROTOPLAST VÀ TẠO PHƠI VƠ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU (Piper colubrinum L.) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HUỲNH THANH KHOA Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH PROTOPLAST VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU (Piper colubrinum L.) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN VŨ PHONG HUỲNH THANH KHOA Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Mẹ anh chị gia đình tạo điều kiện động viên suốt q trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn: − Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập − Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học Thầy Cơ trường ln tận tình hướng dẫn, giảng dạy giúp đỡ − ThS Nguyễn Vũ Phong trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp − Các bạn sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp phòng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Chân thành cảm ơn Tháng 07 năm 2010 Huỳnh Thanh Khoa i TĨM TẮT Đặc tính kháng bệnh chết nhanh tiêu Piper colubrinum L nghiên cứu để ứng dụng vào công tác sản xuất tiêu giống Vì vậy, nhằm cung cấp nguyên liệu ban đầu cho nghiên cứu nhân nhanh tiêu có chứa đặc tính kháng bệnh chết nhanh nên chúng tơi thực hiên đề tài “Nghiên cứu phân tách protoplast tạo phơi vơ tính tiêu Piper colubrinum L.” Nội dung đề tài nghiên cứu phân tách protoplast tạo phơi vơ tính tiêu Piper colubrinum nhằm tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho nhu cầu sản xuất tiêu giống có đặc tính tốt Một số kết đạt tiêu vô trùng tốt nồng độ javel với nước 1: (v/v) thời gian 20 phút Mơi trường tạo sẹo thích hợp mơi trường MS bổ sung mg/L BA mg/L 2,4-D Môi trường bổ sung từ 4,0 mg/L đến 6,0 mg/L Ki kết hợp với 1,0 mg/L BA cho cảm ứng phát sinh phôi từ mô sẹo tiêu Piper colubrinum L Protoplast tiêu Piper colubrinum L phân tách với dung dịch enzyme chứa 1% cellulase 0,5% pectinase sau ủ 26oC 24 ii SUMMARY The thesis title “The study of protoplast isolation and somatic embryogenesis in Piper colubrinum L.” Anti-rapiddeath particularly in Piper colubrinum L is being studied for application to the breeding So, we have carried out this subject to provide the starting material for pepper multiplication research containing anti-rapiddeath perticullarity The main contents of this project are to study protoplast isolation and somatic embryogenesis in Piper colubrinum L to create original material for seed production needs containing good traits After study, we got some results For sterile of Pepper colubrinum leaves the optimal results were obtained with treatments using javel: water of 1: (v/v) in 20 minutes MS medium supplemented with 3,0 mg/L BA and 1,0 mg/L 2,4-D was the most effective for callus formation from leaf MS medium supplemented from 4,0 mg/L to 6,0 mg/L Ki and 1,0 mg/L BA was induced somatic embryogenesis from Piper colubrinum callus Protoplasts of Piper colubrinum L were isolated with enzyme solution containing 1,00 percent cellulase and 0,50 percent pectinase incubated at 26oC in 24 hours Keywords: Protoplast isolation, somatic embryogenesis, Piper colubrinum L iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i  TÓM TẮT ii  SUMMARY iii  MỤC LỤC iv  DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii  DANH SÁCH CÁC BẢNG viii  DANH SÁCH CÁC HÌNH viii  Chương MỞ ĐẦU .1  1.1.  Đặt vấn đề .1  1.2.  Mục đích yêu cầu .1  1.2.1.  Mục đích 1  1.2.2.  Yêu cầu .1  1.3.  Nội dung thực 2  Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  2.1.  Giới thiệu khái quát tiêu .3  2.1.1.  Đặc điểm tiêu 3  2.1.2.  Tình hình sản xuất tiêu thụ tiêu giới nước .4  2.1.2.1.  Trên giới .4  2.1.2.2.  Trong nước .5  2.2.  Giới thiệu protoplast 6  2.2.1.  Đặc điểm protoplast 6  2.2.2.  Ứng dụng protoplast 7  2.2.3.  Phương pháp phân tách protoplast 7  2.2.4.  Nuôi cấy protoplast 8  2.2.4.1.  Thành phần dinh dưỡng 8  2.2.4.2.  Áp lực thẩm thấu môi trường 8  2.2.4.3.  Mật độ dàn trải protoplast 9  2.2.4.4.  Tạo vách tế bào 9  2.2.4.5.  Phát triển callus tạo hoàn chỉnh 9  iv 2.2.5.  Dung hợp protoplast 9  2.2.5.1.  Xử lý NaNO3 9  2.2.5.2.  Xử lý Polyethylen glycol (PEG) 10  2.2.5.3.  Dung hợp điện .10  2.3.  Phương pháp ni cấy phát sinh phơi vơ tính 10  2.3.1.  Phơi vơ tính 10  2.3.2.  Ý nghĩa ni cấy phơi vơ tính 10  2.3.3.  Sự hình thành phơi vơ tính .11  2.3.4.  Cơ chế phát sinh phơi vơ tính .11  2.3.5.  Các kiểu phát sinh phôi 12  2.3.5.1.  Sự phát sinh phôi bất định 12  2.3.5.2.  Sự phát sinh đa phơi vơ tính 12  2.3.5.3.  Sự phát sinh phôi soma cảm ứng 12  2.4.  Những nghiên cứu tiêu 12  Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16  3.1.  Thời gian địa điểm thí nghiệm 16  3.2.  Vật liệu nghiên cứu 16  3.2.1.  Đối tượng nghiên cứu 16  3.2.2.  Môi trường nuôi cấy .16  3.2.3.  Dung dịch sử dụng tách chiết protoplast 17  3.3.  Phương pháp nghiên cứu 17  3.3.1.  Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel thời gian khử trùng 17  3.3.2.  Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA 2,4–D .18  3.3.3.  Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA Ki 19  3.3.4.  Thí nghiệm 4: Khảo sát phân tách protoplast hỗn hợp enzyme .20  3.4.  Phương pháp xử lý số liệu 21  Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22  4.1.  Thí nghiệm 1: Nồng độ javel thời gian khử trùng thích hợp 22  4.2.  Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ BA 2,4–D 23  4.3.  Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ BA Ki 26  4.4.  Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng dung dịch enzyme 29  Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .31  v 5.1.  Kết luận 31  5.2.  Đề nghị 31  TÀI LIỆU THAM KHẢO 32  PHỤ LỤC  vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2iP 6-(γ, γ-Dimethylallylamino) purine [2-isopentenyadenine] BA N6-Benzyladenine (6-Benzylaminopurine) CPA p-Chlorophenoxyacetic acid Ctv Cộng tác viên CV Hệ số biến động IBA Indole-3 Butyric acid IPC International Pepper Community Ki Kinetin MS Murashige Skoog NAA α-Naphthaleneacetic acid PEG Polyethylen glycol TDZ Thidiazuron [N-phenyl-N’-(1, 2, 3-Thiadiazol-5-yl) urea] VPA Vietnam Pepper Association vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ javel thời gian khử 17 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA 2,4-D 18 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA Ki 19 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng dung dịch enzyme 20 Bảng 4.1 Kết khử trùng mẫu sau hai tuần nuôi cấy 21 Bảng 4.2 Thời gian xuất mô sẹo từ mô tiêu 22 Bảng 4.3 Tỷ lệ tạo sẹo nghiệm thức 23 Bảng 4.4 Kết phân tách protoplast Piper colubrinum 28 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 Mẫu tiêu môi trường MS sau tuần nuôi cấy 22 Hình 4.2 Mơ sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + mg/L 2,4-D 24 Hình 4.3 Mơ sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D 24 Hình 4.4 Mơ sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + mg/L 2,4-D 25 Hình 4.5 Mơ sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D 25 Hình 4.6 Mơ sẹo môi trường tạo phôi bổ sung 5,0 mg/L Ki 26 Hình 4.7 Mơ sẹo môi trường tạo phôi bổ sung 4,0 mg/L Ki 26 Hình 4.8 Mơ sẹo môi trường tạo phôi bổ sung 6,0 mg/L Ki 26 Hình 4.9 Mơ sẹo môi trường tạo phôi bổ sung 0,0 mg/L Ki 26 Hình 4.10 Mặt cắt mơ sẹo môi trường bổ sung 5,0 mg/L Ki 27 Hình 4.11 Mặt cắt mơ sẹo môi trường bổ sung 4,0 mg/L Ki 27 Hình 4.12 Mặt cắt mơ sẹo môi trường bổ sung 6,0 mg/L Ki 27 Hình 4.13 Mặt cắt mơ sẹo mơi trường bổ sung 3,0 mg/L BA 27 Hình 4.14 Protoplast quan sát vật kính 10X 29 viii nấm khuẩn vườn ươm, mặc khác tiêu có khả chịu đựng chất khử trùng nồng độ nhỏ 1: Qua bảng 4.1 ta thấy giảm nồng độ javel từ 1: xuống 1: tỷ lệ mẫu đạt sống tăng lên đáng kể (từ 22 – 42%) Điều chứng tỏ tỷ lệ mẫu đạt tỷ lệ mẫu sống bị ảnh hưởng nhiều nồng độ javel Mặt khác, nồng độ javel, tỷ lệ mẫu đạt sống có khác biệt đáng kể nghiệm thức xử lý thời gian khác nhau.Khi thời gian xử lý lâu tỷ lệ mẫu sống tỷ lệ mẫu không nhiễm giảm nồng độ javel ảnh hưởng đến mẫu cấy, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào bên mẫu Vì chứng tỏ, thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu sống Như vậy, nồng độ javel 1: thời gian xử lý 20 phút thích hợp để khử trùng mẫu tiêu a b Hình 4.1 Mẫu tiêu mơi trường MS nghiệm thức KT5 (a) Sau tuần ni cấy, (b) Sau tuần ni cấy 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ BA 2,4-D lên tạo sẹo từ tiêu Bảng 4.2 Thời gian xuất mô sẹo từ mô tiêu Nghiệm thức ST0 ST1 ST2 ST3 ST4 Ngày sau cấy - 16 24 14 19 (-) Không có xuất sẹo 23 Theo kết bảng 4.2 ta thấy nghiệm thức ST3 bổ sung mg/L BA mg/L 2,4-D, mô sẹo xuất sớm vào ngày thứ 14 Còn mơi trường bổ sung mg/L BA 0,5 mg/L 2,4-D (nghiệm thức ST2), mô sẹo xuất trễ vào ngày thứ 24 Các nghiệm thức lại ST1, ST4 mơ sẹo xuất trễ nghiệm thức ST3 từ – ngày Tuy nghiệm thức ST1, ST4 xuất sẹo sau nghiệm thức ST3 phát triển mô sẹo hai nghiệm thức tốt phát triển mô sẹo nghiệm thức ST3 Mô sẹo nghiệm thức ST1 phát triển tốt so với mô sẹo nghiệm thức khác Nghiệm thức ST2 mô sẹo xuất trễ mà phát triển mô sẹo không tốt Nghiệm thức ST0 bổ sung hàm lượng BA 2,4-D nên quan sát thấy khơng có xuất mơ sẹo Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy tăng hàm lượng 2,4-D kết hợp với tăng hàm lượng BA mơi trường ni cấy mơ sẹo xuất sớm Nếu nồng độ BA, nghiệm thức có nồng độ 2,4-D cao q trình hình thành mơ sẹo sớm Ngược lại, nồng độ 2,4-D, nghiệm thức có nồng độ BA cao mơ sẹo xuất sớm Bảng 4.3 Tỷ lệ tạo sẹo nghiệm thức Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/L) Nồng độ 2,4-D (mg/L) Tỷ lệ tạo sẹo sau 30 ngày (%) Trọng lượng sẹo sau 60 ngày (g) ST0 0,0 0,0 - 0,19 ± 0,01a ST1 3,0 1,0 84,5d 1,10 ± 0,09e ST2 3,0 0,5 42,2a 0,50 ± 0,02b ST3 5,0 1,0 60,0b 0,74 ± 0,03c ST4 5,0 0,5 73,3c 0,93 ± 0,02d 29,5 0,33 CV Trong cột, giá trị trung bình có ký tự theo sau khơng giống có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức P ≤ 0,01 (-) Khơng có xuất sẹo Theo bảng 4.3 ta thấy tỷ lệ tạo sẹo trọng lượng sẹo nghiệm thức ST1 (bổ sung mg/L BA mg/L 2,4-D) cao với 84,45% 1,103 g, khác biệt 24 có ý nghĩa mặt thống kê so với nghiệm thức khác Cũng nghiệm thức này, mơ sẹo phát triển tốt q trình nuôi cấy Mặc khác, tỷ lệ tạo sẹo trọng lượng sẹo nghiệm thức ST4 (bổ sung mg/L BA 0,5 mg/L 2,4-D) không cao nghiệm thức ST1 mô sẹo nghiệm thức ST4 phát triển tốt có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với nghiệm thức ST0, ST2, ST3; với tỷ lệ tạo sẹo 73,33% trọng lượng sẹo 0,934 g Nghiệm thức ST3 (bổ sung mg/L BA mg/L 2,4-D) cho tỷ lệ tạo sẹo trọng lượng sẹo cao 60% 0,739 g Ở nghiệm thức ST2 (bổ sung mg/L BA 0,5 mg/L 2,4-D) tỷ lệ tạo sẹo (42,22%) trọng lượng sẹo (0,502 g) Sự phát triển mô sẹo nghiệm thức khơng tốt Còn nghiệm thức ST0 khơng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng nên khơng có khả tạo sẹo trọng lượng cân trọng lượng mẫu cấy Như vậy, từ kết bảng 4.3 cho thấy tất nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng có khả tạo sẹo Cụ thể bổ sung nồng độ BA kết hợp với 2,4-D Nhưng tỷ lệ tạo sẹo trọng lượng sẹo nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Hình 4.2 Mơ sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + mg/L 2,4-D sau 60 ngày ni cấy Hình 4.3 Mô sẹo môi trường bổ sung mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D sau 60 ngày nuôi cấy 25 Hình 4.4 Mơ sẹo mơi trường bổ sung mg/L BA + mg/L 2,4-D sau 60 ngày nuôi cấy 4.3 Hình 4.5 Mơ sẹo mơi trường bổ sung mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D sau 60 ngày ni cấy Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng nồng độ BA Ki đến tạo phôi từ mô sẹo tiêu Sự hình thành phơi vơ tính phụ thuộc vào việc mô cấy chứa tế bào có sẵn chương trình biểu gene sinh phơi Nếu mơ cấy có tế bào cần có kích thích phân chia tế bào đủ để hình thành phơi Ngược lại, mô cấy tế bào phân hóa khơng khả sinh phơi mơ cấy cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp cảm ứng auxin suốt trình để tái lập trình vào đường sinh phôi Sự chuyển vị từ tế bào mô sẹo sang trạng thái sinh phôi kèm với thay đổi xếp vi ống từ định hướng ngẫu nhiên để xếp thành hàng thẳng song song với (Dương Tấn Nhựt, 2007) Thí nghiệm thực 30 ngày, sau 30 ngày nuôi cấy mô sẹo môi trường cảm ứng cho thấy tất nghiệm thức mơ sẹo bị hóa nâu Sự hóa nâu mô sẹo mẫu cấy tiết phenol Tuy nhiên, hóa nâu mô sẹo nghiệm thức không giống 26 Sự hóa nâu nghiệm thức PT2 (bổ sung 1,0 mg/L BA 5,0 mg/L Ki) nhất, mẫu cấy sống phát triển Còn nghiệm thức PT0 (chỉ có bổ sung 1,0 mg/l BA) có hóa nâu nhiều nên tất mẫu bị chết Hình 4.6 Mơ sẹo môi trường bổ sung 5,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.7 Mơ sẹo mơi trường sung 4,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.8 Mơ sẹo mơi trường bổ sung 6,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.9 Mơ sẹo mơi trường bổ sung 0,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Do quan sát chưa thấy phát sinh phôi nên tiến hành giải phẫu mô sẹo cấy môi trường cảm ứng tạo phôi để quan sát hình thái tế bào 27 Hình 4.10 Mặt cắt mô sẹo môi trường bổ sung 5,0 mg/L Ki + 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.11 Mặt cắt mô sẹo môi trường bổ sung 4,0 mg/L Ki + 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.12 Mặt cắt mô sẹo môi trường bổ sung 6,0 mg/L Ki + 1,0 mg/L BA sau 30 ngày Hình 4.13 Mặt cắt mơ sẹo mơi trường bổ sung 3,0 mg/L BA + 1,0 mg/L 2,4-D sau 60 ngày Sau quan sát mặt cắt mô sẹo ta thấy, môi trường bổ sung 5,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA đa số tế bào có thay đổi so với tế bào chưa cảm ứng tạo phôi (ở môi trường tạo sẹo bổ sung 3,0 mg/L BA mg/L 2,4-D) Các tế bào có đồng đều, nhân tế bào phân chia nằm sát vách tế bào; số tế bào có kéo dài Ở môi trường bổ sung 6,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA, tế bào có thay đổi hình thái so với tế bào chưa cảm ứng tạo phơi Tế bào phình to, có kéo dài, tương đối đồng đều, nhân tế bào đậm đặc chưa tiến phía vách tế bào 28 Ở môi trường bổ sung 4,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA, ta thấy tế bào có thay đổi hình thái so với tế bào chưa cảm ứng tạo phôi Tế bào to, kéo dài, nhân tế bào phân chia Theo Dương Tấn Nhựt (2007) tế bào có khả sinh phơi tế bào có kích thước lớn, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng mạnh mẽ, tăng thể tích tế bào chất, nhân hạch nhân to đậm màu,… Như vậy, tất mơi trường có bổ sung từ 4,0 mg/L đến 6,0 mg/L Ki kết hợp với với 1,0 mg/L BA có cảm ứng phát sinh phơi thơng qua biến đổi tế bào 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng dung dịch enzyme đến phân tách protoplast giống tiêu Protoplast sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu tính chất vật lý màng sinh chất đến nghiên cứu nhập bào hấp thu phần tử, bào quan sinh vật Mặc khác, sử dụng protoplast cho phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thu nhận bào quan đại phân tử mà không gặp phải biến dạng hư hỏng Bên cạnh đó, tính chất màng sinh chất chịu dung hợp hình thành tế bào lai Chính vậy, giai đoạn phân tách protoplast quan trọng nhằm tạo nguyên liệu ban đầu cho nghiên cứu Bảng 4.4 Kết phân tách protoplast Nghiệm thức Số lượng protoplast phân tách (x 104) RT1 RT2 RT3 1,22 (-) Khơng có phân tách protoplast Từ kết bảng 4.4 ta thấy, nghiệm thức RT3 có phân tách protoplast số lượng hạn chế Còn nghiệm thức RT1 RT2 khơng có phân tách protoplast Ở nghiệm thức RT1 khơng có phân tách protoplast nồng độ dung dịch enzyme (1% cellulase 0,25% pectinase) chưa đủ để phân hủy tế bào khỏi mô Còn nghiệm thức RT2, tăng nồng độ dung dịch enzyme lên 1% 29 cellulase 0,5% pectinase mà khơng có phân tách protoplast Tuy nhiên, RT3 có nồng độ dung dịch enzyme với RT2 có phân tách protoplast Điều cho thấy ảnh hưởng việc lắc học lên phân tách protoplast nồng độ dung dịch enzyme, RT3 đặt máy lắc với tốc độ 40 vòng/phút RT2 khơng đặt máy lắc Mặc dù RT3 có phân tách protoplast số lượng hạn chế Điều nồng độ dung dịch enzyme chưa đủ để phân hủy tế bào khỏi mô protoplast bị phá hủy Protoplast bị phá hủy dung dịch không ly tâm sau 24 ủ mà trữ qua đêm Mặt khác, chưa thực thường xuyên nên thao tác kỹ thuật Điều ảnh hưởng đến hiệu suất phân tách protoplast Ngồi ra, chi phí enzyme đắt nên khơng thể thực nhiều lần nhiều nồng độ dung dịch enzyme khác Hình 4.14 Protoplast quan sát vật kính 10X 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thực nghiệm có số kết luận sau: − Nồng độ javel 1: thời gian khử trùng 20 phút thích hợp cho việc khử trùng mẫu tiêu − Mơi trường thích hợp để tạo sẹo từ tiêu môi trường MS bổ sung mg/L BA mg/L 2,4-D − Môi trường cho cảm ứng phát sinh phôi môi trường MS bổ sung từ 4,0 mg/L đến 6,0 mg/L Ki 1,0 mg/L BA − Protoplast phân tách dung dịch enzyme chứa 1% cellulase 0,5% pectine, ủ 26oC 24 máy lắc với tốc độ 40 vòng /phút 5.2 Đề nghị Để hồn thiện quy trình phân tách protoplast tạo phơi vơ tính Piper colubrinum, đưa số đề nghị sau: − Tiếp tục nghiên cứu hình thành phơi vơ tính tiêu Piper colubrinum L − Tiếp tục thực phân tách protoplast − Khảo sát mơi trường thích hợp để nuôi cấy protoplast 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Thị Dung 2003 Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Định 2005 Nghiên cứu nhân giống vơ tính tiêu (Piper nigrum) phương pháp ni cấy mơ Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Lê Văn Hồng 2007 Giáo trình Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Đà Nẵng Dương Công Kiên 2002 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên 2002 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh Dương Tấn Nhựt 2007 Công nghệ Sinh học thực vật Nhà xuất Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Tơ Thị Nhã Trầm 2007 Khảo sát ảnh hưởng dịch nấm Phytophthora sp tác nhân hóa lý đến sinh trưởng khả tạo đột biến tiêu (Piper nigrum L.) ni cấy mơ Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI Abdullah Khatri, Muhammad Uar Dahot, Imtiaz Ahmed Khan & Ghulam Shah NizamaniI 2010 An Efficient Method of Protoplast Isolation in banana (Musa spp.) Pak J Bot., 42: 1267 – 1271 Ajith Anand and Chaluvadi Srinivasa Rao 2000 A rapid in vitro propagation protocol for Piper barberi gamble, a critically endangered plant In vitro cell Dev Biol – plant 36: 61 – 64 10 A Yusuf, R.K Tyagi & S.K Malik 2001 Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from leaf segments of Piper colubrinum Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 255 – 258 11 Kamnoon Kanchanapooma, Saowarath Jantarob & Duangkae Rakchadb 2001 Isolation and Fusion of Protoplasts from Mesophyll Cells of Dendrobium Pompadour Science Asia 27: 29 – 34 12 Mehmet BABAOĞLU 2000 Protoplast Isolation in Lupin (Lupinus mutabilis Sweet): Determination of Optimum Explant Sources and Isolation Conditions Turk J Bot 24: 177 – 185 13 Resmi Paul, P C Rajendran and Lissamma Joseph 2007 Comparative Study of protoplast isolation in Piper nigrum L and Piper colubrium Link Recent trends in horticultural biotechnology Keshavachadran, P.A Nazeem D Girija, P S John & K V Peter Jai Bharat Printing Press, Delhi, pp: 391 – 394 14 R Ramakrishnan Nair and S Dutta Gupta 2006 High – frequency plant regeneration through cyclic secondary somatic embryogenesis in black pepper ( Piper nigrum L.) Plant Cell Rept 24: 699 – 707 32 15 Z Zhang, L Zhao, Z Chen and X Zheng 2008 Successful microprogation protocol of Piper methysticum Biologia planttarum 52: 110 – 112 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 16 Saji Menon and Vibha Tyagi Birla Institute of Scientific Research, Statue circle, Jaipur (Rajasthan), India Preparation of Metabolically Competent Protoplasts http://www.molecularstation.com/botany/protoplast-isolationprotocol/ 33 PHỤ LỤC Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm vơ mẫu – tỷ lệ mẫu đạt Nghiệm thức KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 Lần 40 50 20 50 70 60 Tỷ lệ mẫu đạt (%) Lần Lần 40 50 60 50 40 60 80 80 60 70 Trung bình 43,3 53,3 33,3 56,7 76,7 63,3 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm vơ mẫu – tỷ lệ mẫu đạt số liệu bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3444.44 688.889 13.78 0.0001 Within groups 600.0 12 50.0 Total (Corr.) 4044.44 17 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm vơ mẫu – tỷ lệ mẫu đạt kết bảng Multiple Range Tests for TLS by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups KT3 33.3333 X KT1 43.3333 XX KT2 53.3333 XX KT4 56.6667 X KT6 63.3333 X KT5 76.6667 X Contrast Difference +/- Limits KT1 - KT2 -10.0 12.5794 KT1 - KT3 10.0 12.5794 KT1 - KT4 *-13.3333 12.5794 KT1 - KT5 *-33.3333 12.5794 KT1 - KT6 *-20.0 12.5794 KT2 - KT3 *20.0 12.5794 KT2 - KT4 -3.33333 12.5794 KT2 - KT5 *-23.3333 12.5794 KT2 - KT6 -10.0 12.5794 KT3 - KT4 *-23.3333 12.5794 KT3 - KT5 *-43.3333 12.5794 KT3 - KT6 *-30.0 12.5794 KT4 - KT5 *-20.0 12.5794 KT4 - KT6 -6.66667 12.5794 KT5 - KT6 *13.3333 12.5794 * denotes a statistically significant difference Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm vô mẫu – tỷ lệ mẫu sống Nghiệm thức KT1 KT2 KT3 KT4 KT5 KT6 Lần 33,3 43,3 20,0 50,0 70,0 43,3 Tỷ lệ mẫu sống (%) Lần 40,0 53.3 40,0 53,3 70,0 43,3 Lần 50,0 50,0 36,7 53,3 80,0 56,7 Trung bình 41,1 48,9 32,2 52,2 73,3 47,8 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm vơ mẫu – tỷ lệ mẫu sống số liệu bảng Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2841.89 568.378 11.09 0.0004 Within groups 615.007 12 51.2506 Total (Corr.) 3456.9 17 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm vô mẫu – tỷ lệ mẫu đạt kết bảng Multiple Range Tests for TLSO by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups KT3 32.2233 X KT1 41.11 XX KT6 47.7767 X KT2 48.8867 X KT4 52.22 X KT5 73.3333 X Contrast Difference +/- Limits KT1 - KT2 -7.77667 12.7358 KT1 - KT3 8.88667 12.7358 KT1 - KT4 -11.11 12.7358 KT1 - KT5 *-32.2233 12.7358 KT1 - KT6 -6.66667 12.7358 KT2 - KT3 *16.6633 12.7358 KT2 - KT4 -3.33333 12.7358 KT2 - KT5 *-24.4467 12.7358 KT2 - KT6 1.11 12.7358 KT3 - KT4 *-19.9967 12.7358 KT3 - KT5 *-41.11 12.7358 KT3 - KT6 *-15.5533 12.7358 KT4 - KT5 *-21.1133 12.7358 KT4 - KT6 4.44333 12.7358 KT5 - KT6 *25.5567 12.7358 * denotes a statistically significant difference Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm tạo sẹo Nghiệm thức ST0 ST1 ST2 ST3 ST4 Lần 00,0 80,0 40,0 60,0 66,7 Tỷ lệ tạo sẹo (%) Lần 00,0 86,7 40,0 66,7 80,0 Lần 00,0 86,7 46,7 53,3 73,3 Trung bình 00,0 84,5 42,2 60,0 73,3 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm tạo sẹo số liệu bảng Analysis of Variance -Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -Between groups 2974.18 991.394 33.44 0.0001 Within groups 237.141 29.6426 -Total (Corr.) 3211.32 11 Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tạo sẹo kết bảng Multiple Range Tests for TLTS by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups ST2 42.2233 X ST3 60.0 X ST4 73.3333 X ST1 84.4467 X Contrast Difference +/- Limits ST1 - ST2 *42.2233 10.2512 ST1 - ST3 *24.4467 10.2512 ST1 - ST4 *11.1133 10.2512 ST2 - ST3 *-17.7767 10.2512 ST2 - ST4 *-31.11 10.2512 ST3 - ST4 *-13.3333 10.2512 -* denotes a statistically significant difference Bảng 10 Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm tạo sẹo – trọng lượng sẹo Nghiệm thức ST0 ST1 ST2 ST3 ST4 Khối lượng sẹo (g) Lần Lần Lần 0,179 0,208 0,186 0,984 1,279 1,045 0,507 0,539 0,459 0,796 0,727 0,694 0,963 0,911 0,927 Trung bình 0,19 1,10 0,50 0,74 0,93 Bảng 11 Bảng ANOVA thí nghiệm tạo sẹo – trọng lượng sẹo số liệu bảng 10 Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.54942 0.387355 65.61 0.0000 Within groups 0.059038 10 0.0059038 Total (Corr.) 1.60846 14 Bảng 12 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm tạo sẹo – trọng lượng sẹo kết bảng 11 Multiple Range Tests for KLS by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups ST0 0.191 X ST2 0.501667 X ST3 0.739 X ST4 0.933667 X ST1 1.10267 X Contrast Difference +/- Limits ST0 - ST1 *-0.911667 0.139786 ST0 - ST2 *-0.310667 0.139786 ST0 - ST3 *-0.548 0.139786 ST0 - ST4 *-0.742667 0.139786 ST1 - ST2 *0.601 0.139786 ST1 - ST3 *0.363667 0.139786 ST1 - ST4 *0.169 0.139786 ST2 - ST3 *-0.237333 0.139786 ST2 - ST4 *-0.432 0.139786 ST3 - ST4 *-0.194667 0.139786 * denotes a statistically significant difference ... PROTOPLAST VÀ TẠO PHƠI VƠ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU (Piper colubrinum L.) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN VŨ PHONG HUỲNH THANH KHOA Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Con thành kính ghi ơn Mẹ anh chị gia đình... Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Chân thành cảm ơn Tháng 07 năm 2010 Huỳnh Thanh Khoa i TÓM TẮT Đặc tính kháng bệnh chết nhanh tiêu Piper colubrinum L nghiên cứu để ứng dụng... protoplast (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Khi tạo protoplast, nhà khoa học cho thấy khả vơ lớn nghiên cứu sản xuất Các nhà khoa học sử dụng protoplast đối tượng sinh học công tác lai giống Hồn