BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ADENOSINE LY TRÍCH TỪ HỆ SỢI NẤM Cordyceps sinensis Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TRẦN CƠNG SƠN Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ADENOSINE LY TRÍCH TỪ HỆ SỢI NẤM Cordyceps sinensis Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ THỊ DIỆU TRANG TRẦN CÔNG SƠN ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG Tháng 6/2013 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập trường Toàn thể quý Thầy Cô môn Công nghệ Sinh học nhiệt tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học Viện Cơng nghệ Sinh học Mơi trường tạo điều kiện sở vật chất trang thiết bị suốt trình thực đề tài TS Lê Thị Diệu Trang, ThS Phùng Võ Cẩm Hồng trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp ThS Lê Văn Huy, ThS Nguyễn Thanh Điền tận tình giúp đỡ để tơi vượt qua khó khăn q trình thực đề tài Tập thể lớp DH09SH hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt năm, đặc biệt bạn Nguyễn Thị Ngọc Anh, Lê Phước Thọ, Nguyễn Thị Trường Giang chia sẻ khó khăn giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Con xin tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ người thân gia đình ln chỗ dựa vững chắc, động viên, khuyến khích tạo điều kiện để học tập tốt Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Sinh viên thực Trần Cơng Sơn i TĨM TẮT Nấm C sinensis (Đơng Trùng Hạ Thảo) ngồi tự nhiên ngày khan khai thác mức người, đó, việc ni cấy nấm mơi trường nhân tạo cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu dược liệu Để đánh giá chất lượng nấm C sinensis nuôi cấy môi trường nhân tạo, người ta dựa vào hàm lượng hoạt chất sinh học quý nucleoside thường sử dụng adenosine, chất có tác dụng dự trữ lượng, điều hòa hoạt động sinh lý hệ thống thần kinh trung ương cải thiện tuần hoàn ngoại biên Đề tài “Tối ưu hóa quy trình phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm Cordyceps sinensis” thực nhằm xây dựng quy trình chuẩn để phân tích hàm lượng adenosine sản phẩm C sinensis, ứng dụng để kiểm soát chất lượng nấm thị trường dược liệu Mẫu C sinensisđược thu nhận từ việc nuôi cấy sợi nấm môi trường lỏng bao gồm thành phần:glucose 40 g/l, yeast extract 10 g/l, pepton g/l, KH2PO4 g/l, MgSO4 0,5 g/l Sau 26 ngày nuôi cấy, sinh khối sợi nấm thu nhận sấy khô 400C Phương pháp phân tích adenosine sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao với đầu dò hấp thụ tử ngoại (High Performance Liquid Chromatography – Ultra Violet – HPLC – UV), cột Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 150 x 4,6 mm 5µ Thí nghiệm tối ưu hóa quy trình phân tích khảo sát hiệu việc ly trích adenosine dung mơi khác kết hợp đánh sóng siêu âm thời gian khác Song song với quy trình ly trích, việc tối ưu hóa chương trình phân tích hệ thống HPLC thực Kết nuôi cấy sợi nấm môi trường lỏng thu sinh khối tươi 35 g/l môi trường Đường chuẩn xây dựng từ nồng độ chuẩn có độ tuyến tính cao (R2 = 0,9996) Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích adenosine ly trích dung mơi khác thời gian đánh sóng siêu âm phút trung bình từ 103,4% đến 110,4%, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút 90,7% - 111,1%, điều phù hợp với khoảng khuyến cáo FDA nên dùng để phân tích adenosine Kết phân tích, cho thấy thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút với dung mơi ethanol 50% cho hàm lượng adenosine cao 1643,88(µg/g) khác biệt có ý nghĩa với dung mơi khác (P = 0,01) ii SUMMARY The natural fungus C sinensis (winter worm, summer grass) becomes exhausted due to overexploitation by humans, so the cultured fungus in syntheticmedia is necessary in order to meet the pharmaceutical needs Quality assessment of cultured C sinensisfungus was based on the content of special bioactive substances such as nucleosides including adenosine, that effects energy storage, regulates physiological activity of the central nervous system and improves peripheral circulation Thesis“Optimization of analysis process for adenosine extracted from C sinensis mycelia”was carried out to build a standard procedure for analyzing amount of adenosine in C sinensis products, that can be applied to control quality of this fungus in the pharmaceutical material market C sinensis samples were collected from the cultured mycelia in liquid mediumconsisted of: glucose 40 g/l, yeast extract 10 g/l, peptone g/l, KH2PO4 g/l, MgSO4 0,5 g/l After 26 days of incubation, mycelia were collected and dried at 400C Adenosine analysis was performed with thehigh performance liquid chromatography system using ultraviolet absorbance detector (HPLC – UV), Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 150 x 4.6 mm 5μ column Optimization processexamined the effect of adenosineextractedby different solvents combined with ultrasonication in different time In parallel with the extraction process, the optimization of analysis program of the HPLC system was also implemented Results showed fresh biomass of mycelia cultured in liquid medium was 35 g/l medium Calibration curve was built from the standard concentrations had high linearity (R2 = 0,9996) The recovery of adenosine extracted by different solvents with minutes sonicationwas average from 103,4% to 110,4%, while that with 15minutes sonication was 90,7% – 111,1%, this is in range of FDA recommendations and could be used to analyze adenosine The analysis results revealed thatthe ultrasonication time of 15 minutes with 50% ethanol solvent obtained highest amount of adenosine1643,88 (µg/g), significant difference with other solvents (P = 0,01) Keywords: HPLC, adenosine, Cordyceps sinensis, mycelia, optimization, solvent, untrasound iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Cordyceps sinensis 2.1.1 Nguồn gốc Cordyceps sinensis 2.1.2 Mô tả Cordyceps sinensis 2.1.3 Thành phần hóa học Cordyceps sinensis 2.1.4 Công dụng Cordyceps sinensis 2.2 Các nucleoside Cordyceps 2.3 Giới thiệu adenosine 2.3.1 Nguồn gốc hình thành adenosine 2.3.2 Vai trò adenosine 2.4 Phương pháp phân tích adenosine 2.4.1 Giới thiệu phương pháp sắc ký 2.4.1.1 Lịch sử phương pháp sắc ký 2.4.1.2 Nguyên tăc phương pháp sắc ký 2.4.1.3 Phân loại phương pháp sắc ký 10 2.4.2 Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) 11 2.4.2.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng cao áp 11 2.4.2.2 Các phận HPLC 12 iv 2.4.2.3 Pha tĩnh HPLC 13 2.4.2.4 Pha động HPLC 14 2.4.2.5 Tối ưu hóa quy trình 15 2.5 Các nghiên cứu adenosine nước 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.2 Vật liệu thí nghiệm 17 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 17 3.2.3 Hóa chất 17 3.3 Phương pháp tiến hành 18 3.3.1 Tăng sinh khối nấm Cordyceps sinensis môi trường lỏng 18 3.3.1.1 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis môi trường PGA 18 3.3.1.2 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensistrong môi trường lỏng 18 3.3.2 Quy trình chạy máy HPLC 19 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn adenosine 19 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng dung môi, thời gian ly trích adenosine 20 3.3.5 Phân tích liệu tính tốn kết 22 3.3.5.1 Nồng độ adenosine từ đường chuẩn 22 3.3.5.2 Nồng độ adenosine thực tế mẫu 22 3.3.5.3 Hiệu suất thu hồi 23 3.4 Phân tích số liệu xử lý kết 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis môi trường lỏng 24 4.1.1 Nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis môi trường PGA 24 4.1.2 Tăng sinh nấm Cordyceps sinensis môi trường lỏng 25 4.2 Xây dựng đường chuẩn adenosine 26 4.3 Xác định hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu 28 4.4 Ảnh hưởng dung môi thời gian đánh sóng siêu âm 29 4.4.1 Định tính adenosine mẫu phân tích 29 4.4.2 Định lượng adenosine mẫu phân tích 33 4.5 Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm 35 v Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN: Acetonitrile ADP: Adenosine Diphosphate AMP: Adenosine Monophosphate API: Active Pharmaceutical Ingredient ATP: Adenosine Triphosphate CE : Capillary Electrophoresis CNS: Central Nervous System ĐTHT: Đông Trùng Hạ THảo FDA: Food and Drug Administration GC: Gas Chromatography HEAA: Hydroxy – Etyl – Adenosine – Analogs HPLC – DAD: High Performance Liquid Chromatography – Photodiode Array Spectrophotometer HPLC – UV: High Performance Liquid Chromatography – Untra Violet LC/ESI–MS: Liquid Chromatography Electrospray Ionization - Mass Spectrometry LOD: Limits Of Detection LOQ: Limits Of Quantitation PC: Paper Chromatography PGA: Potato Glucose Agar TLC: Thin Layer Chromatography vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1Các loại pha động pha tĩnh sử dụng kỹ thuật sắc ký 10 Bảng 2.2 Tóm tắt cấu hình sắc ký khác 11 Bảng 2.3 Các loại cột HPLC dùng kỹ thuật sắc ký khác 14 Bảng 3.1 Xây dựng nồng độ adenosine từ dung dịch gốc1138,5 ppm 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng dung môi thời gian ly trích adenosine 20 Bảng 4.1 Tốc độ lan tơ nấm C sinensis môi trường PGA 24 Bảng 4.2Phương trình đường chuẩn theo nồng độ diện tích peak adenosine 27 Bảng 4.3Hiệu suất thu hồi quy trình ly trích adenosine 28 Bảng 4.4Hiệu suất thu hồi nghiên cứu phân tích adenosine 28 Bảng 4.5Ảnh hưởng thời gian đánh sóng siêu âm dung mơi 33 Bảng 4.6 Nồng độ adenosine nghiên cứu nấm C.sinensis 34 viii Hình 4.4 Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis, ly trích mẫu nước cất thời gian đánh sóng siêu âm phút (a) dung dịch chuẩn; (b) mẫu ly trích nước cất thời gian đánh sóng siêu âm phút Quan sát sắc ký đồ hình 4.4của chuẩn adenosine mẫu nấm C sinensis sử dụng dung môi nước cất để ly trích adenosinevới thời gian đánh sóng siêu âm phút thấy rằng, thời gian lưu adenosine khoảng 19,5 phút với diện tích peak adenosine chuẩn adenosine có mẫu 373 1429 mAU Hình 4.5Sắc ký đồcủa mẫu nấm C sinensis,ly trích mẫu nước cất thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút (a) dung dịch chuẩn; (b)mẫu ly trích nước cất thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Từ hình 4.5, nhận thấy thời gian lưu adenosine mẫu nấm C sinensis sử dụng dung mơi ly trích nước cất với thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút khoảng 21,9 phút, đó, thời gian lưu chuẩn có thay đổi 21,1 phút Diện tích peak adenosine xác định sắc ký đồ chuẩn adenosine mẫu nấm 728 1363 mAU 30 Hình 4.6 Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis, ly trích mẫu ethanol 30% (a) thời gian đánh sóng siêu âm phút; (b) thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis, sử dụng dung mơi ly trích ethanol 30%, thời gian đánh sóng siêu âm phút, peak adenosine có thời gian lưu 21,2 phút với diện tích peak 1255 mAU đó, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút, peak adenosine xuất phút 21,6 với diện tích peak 1278 mAU Hình 4.7Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis, ly trích mẫu ethanol 50% (a) thời gian đánh sóng siêu âm phút; (b) thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Adenosine ly trích ethanol 50% kết hợp với thời gian đánh sóng siêu phút 15 phút xuất sắc ký đồ thời gian lưu 21 phút với diện tích peak adenosine xác định sắc ký đồ 1296 mAU 1368 mAU 31 Hình 4.8Sắc ký đồcủa mẫu nấm C sinensis,ly trích mẫu methanol 60% (a) thời gian đánh sóng siêu âm phút; (b) thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Quan sát hình 4.8, nhận thấy thời gian lưu adenosine mẫu nấm C sinensis sử dụng dung mơi ly trích methanol 60% với thời gian đánh sóng siêu âm phút khoảng 21,5 phút, đó, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút peak adenosinexuất phút thứ 22,6 Diện tích peak xác định sắc ký đồ adenosine mẫu nấm C sinensis hai thời gian đánh sóng siêu âm phút 15 phút với dung mơi ly trích methanol 60% 1234 1024 mAU Hình 4.9Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis,ly trích mẫu methanol 90% (a) thời gian đánh sóng siêu âm phút; (b) thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Quan sát hình 4.9, sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis ly trích methanol 90% nhận thấy xuất peak adenosine thời gian đánh sóng siêu âm phút 22,1 phút với diện tích peak 1338 mAU, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút, peak adenosine xuất phút thứ 22,4 với diện tích 1189 mAU 32 4.4.2 Định lượng adenosine mẫu phân tích Bảng 4.5 Ảnh hưởng thời gian đánh sóng siêu âm dung mơi đến hiệu ly trích adenosine Nghiệm thức Hàm lượng adenosine mẫu phân tích (µg/g) NT1 1417,95b NT2 1355,09bc NT3 1303,59cd NT4 1261,16d NT5 1270,24cd NT6 1298,13cd NT7 1316,23cd NT8 1643,88a NT9 1340,98bcd NT10 1360,65bc Trong cột, giá trị có kí tự khơng có khác biệt vềmặt thốngkê mức (P = 0,01) Qua kết khảo sát thời gian đánh sóng siêu âm phút, thấy hiệu ly trích adenosine mẫu nấm C sinensis bằngnước cất cho nồng độ adenosine cao 1417,95 µg/g, khác biệt có ý nghĩa so với dung mơi lại bảng 4.5 (P = 0,01).Nghiên cứu Guo ctv (2005) chorằng số lượng chất lượng nucleoside có sợi nấm Cordyceps cao mẫu ly trích nước.Việc sử dụng dung môi nước không cho hiệu ly trích tốt mà tiết kiệm chi phí Khảo sát ảnh hưởng dung mơi với thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút đến hiệu ly trích adenosine nhận thấy, việc sử dụng dung môi ethanol 50% tốt nhất, với nồng độ adenosine 1643,88 µg/g, khác biệt có ý nghĩa với dung môi khác bảng4.5 Kết khảo sát thời gian đánh sóng siêu âm khác nhau, nhận thấy nồng độ adenosine dung môi ly trích nước cất suy giảm đáng kể, có ý nghĩa mặt thống kê (P = 0,01) Nồng độ adenosine ly trích dung mơi khác hầu hết tăng từ thời gian đánh sóng siêu âm phút đến thời gian đánh sóng siêu âm 15 33 phút, cao ethanol 50%, tăng từ 1303,59µg/g lên 1643,88µg/g, có khác biệt mặt thống kê (P = 0,01) Điều giải thích rằng, hiệu ly trích dung mơi nước cất cao thời gian đánh sóng siêu âm phút, sau lại suy giảm thời gian đánh sóng 15 phút ảnh hưởng mạnh sóng siêu âm cường độ cao làm phân hủy hợp chất adenosine thành adenine (Kieszling ctv, 2004).Sự gia tăng nồng độ adenosine dung mơi ly trích khác đặc biệt ethanol 50% phút đánh sóng siêu âm đầu tiên, hiệu ly trích khơng cao, hàm lượng adenosine lại mẫu nấm nhiều, nên ta tiếp tục đánh sóng siêu âm để ly trích tiếp hàm lượng adenosine tăng cao Điều phù hợp với kết nghiên cứu Xue ctv (2009) cho việc ly trích dung mơi thời gian đánh sóng siêu âm từ đến 15 phút làm tăng hàm lượng adenosine, không đề cập đến dung môi nước cất.Việc thất thoát adenosine quan sát thời gian đánh sóng siêu âm lớn 15 phút Như vậy, việc sử dụng dung môi nước cất dùng để ly trích adenosine thời gian đánh sóng siêu âm phút cho hàm lượng adenosine cao, mà giúp tiết kiệm thời gian chi phí Tuy nhiên, dung mơi ethanol 50% đánh sóng siêu âm 15 phút cho hàm lượng adenosine cao nhất, thời gian lại lâu so với việc sử dụng dung mơi nước đánh sóng siêu âm phút Do đó, tùy vào mục đích sử dụng, mà việc lựa chọn dung mơi cho thích hợp Bảng 4.6 Nồng độ adenosine nghiên cứu nấm C sinensis Kết nghiên cứu Guo ctv, 2006 Xie ctv, 2010 Kết đề tài Nguồn nấm Cordyceps sinensis Nồng độ adenosine (µg/g) Thanh Hải 93 Tứ Xuyên 124 Tây Tạng 246 Thanh Hải 186,5 Tứ Xuyên 126,1 Tây Tạng 79,6 Hệ sợi nấm C sinensis 1261,16 – 1643,88 Dựa vào bảng 4.6, theo kết nghiên cứu của Guo ctv (2006) hàm lượng adenosine có C sinensis tự nhiên 93µg/g (Thanh Hải), 124 µg/g (Tứ 34 Xuyên) 246µg/g (Tây Tạng) Trong nghiên cứu khác Xie ctv(2010), nguồn nấmC sinensis đem phân tích thu nhận từ tỉnh Thanh Hải, Tứ Xuyên, Tây Tạng với nồng độ adenosine 186,5µg/g, 126,1 µg/g, 79,6 µg/g Nhận xét thấy, nguồn nấm giống nhau, qua nghiên cứu lại cho kết nồng độ adenosine khác nhau, rõ rệt tỉnh Thanh Hải Tây Tạng Nồng độ adenosine nghiên cứu Guo ctv (2006) Tây Tạng gấp khoảng 3,1 lần so với nghiên cứu củaXie ctv(2010) Trong đó, nồng độ adenosine phân tích từ nguồn nấm C sinensisở Thanh Hải theo kết nghiên cứu Xie ctv(2010) lại lớn gấp khoảng lần so với kết nghiên cứu Guo ctv (2006) Nồng độ adenosine phân tích nguồn nấm địa điểm khác cho kết khác Điều điều kiện khí hậu, dinh dưỡng, điều kiện ni cấy môi trường nhân tạo ảnh hưởng đến tổng hợp adenosine.Qua kết phân tích adenosine có sợi nấm nuôi cấy, nhận xét thấy hàm lượng adenosine dao động từ 1261,16 µg/g đến 1643,88µg/g Hàm lượng adenosine có sợi nấm C sinensis cao hẳn so với C sinensis ngồi tự nhiên (Leung ctv, 2006) 4.5Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Nấm C sinensis phục hồi mơi trường PGA, sau ni cấy mơi trường lỏng bao gồm thành phần: KH2PO4: g/l, MgSO4: 0,5 g/l, peptone: g/l, glucose: 40 g/l, yeast extract: 10 g/l Sau 26 ngày nuôi cấy, sinh khối sợi nấm thu nhận sấy khô 400C, nghiền thành bột Qua kết khảo sát ảnh dung mơi thời gian đánh sóng siêu âm, nhận thấy việc ly trích ethanol 50% với thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút cho nồng độ adenosine cao 1643,88µg/g với hiệu suất thu hồi trung bình 90,7%, khác biệt có ý nghĩa so với dung mơi thời gian đánh sóng siêu âm khác (P=0,01) Do đó, việc phân tích adenosine phương pháp HPLC – UV, cột Phenomenex Luna 5µ C18 (2) 150 x 4,6 mm 5µ với pha động gồm 25 mmol/l KH2PO4, 50 ml ACN, 950 ml H2O, tốc độ dòng 0,4 ml/ phút, với việc ly trích mẫu dung môi ethanol 50% với thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút tối ưu cho quy trình phân tích adenosine phạm vi nghiên cứu đề tài 35 Sợi nấm Cordyceps sinensis phục hồi môi trường PGA Tăng sinh khối sợi nấm môi trường lỏng Sợi nấm sấy khô 40oC, nghiền thành bột mịn Bột nấm ly trích với ethanol 50%, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Điều kiện chạy máy tối ưu Tốc độ dòng: 0,4 ml/ phút, thời gian phân tích: 30 phút Pha động: 25 mmol/l KH2PO4, 50 ml ACN, 950 ml H2O Hình 4.10 Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm C sinensis 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Lượng sợi nấm thu từ môi trường lỏng cao 35 g/l môi trường, tạo điều kiện đồng mẫu, đáp ứng nhu cầu phân tích adenosine Xây dựng phương pháp tối ưu cho việc phân tích adenosine với dung mơi ly trích ethanol 50%, thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút cho hàm lượng adenosine cao 1643,88 µg/g, phân tích mẫu hệ thống HPLC với đầu dò UV, tốc độ dòng 0,4 ml/phút, pha động gồm 25 mmol/l KH2PO4, 50 ml ACN, 950 ml H2O, hiệu suất thu hồi phương pháp dao động từ 90,7% - 111,1% 5.2 Đề nghị Vì đề tài chưa khảo sát hệ dung môi khác nên cần nghiên cứu thêm so sánh với quy trình phân tích adenosine hệ thống HPLC – UV xây dựng 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Đái Duy Ban Lưu Tham Mưu 2009 Đông Trùng Hạ Thảo Nhà xuất Y học Hà Nội Trịnh Tam Kiệt 2011 Nấm lớn Việt Nam, tập Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Trang 100 – 101 Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Tiếng nước Ahuja S., and M W Dong 2005 Validation of HPLC methods in pharmaceutical analysis Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC6: 192 – 195 Alam, M N., Szymusiak, Gong, H., King, J., and McGinty.1999 Adenosynergicmodulation of rat basal forebrain neurons during sleep and waking: Neuronalrecording with microdialysis Journal of Physiology 521: 679 – 690 Archer and Martin 1952 The development of partition chromatography Nobel lecture 2: 108 – 112 Basheer R., Strecker R E., Thakkar M M., and McCarley 2004 Adenosine andsleep – wake regulation Progress in Neurobiology 73: 379 – 396 Enzo S., Maria, A., and Luciano 2001 HPLC determination of adenosine in humansynovial fluid Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 24: 1143 – 1146 Fan H., Li S P., Xiang J J., Lai C M., Yang F Q., Gao J L., and Y T Wang 2006 Qualitative and quantitative determination of nucleosides, bases andtheir analogues in natural and cultured Cordyceps by pressurizedliquid extraction and high performance liquidchromatography – electrosprayionization tandem mass spectrometry (HPLC – ESI – MS/MS) Anal Chim 567: 218 – 228 10 FDA 1994 Parameters for validation of hpl chromatographicmethods for drug substance and drug product Reviewer Guidance Validation Of Chromatographic Methods 4: – 11 Gao J L., Leung, K S Y., Wang Y T., Lai C M., Li S P., and L F Hu 2007 Qualitative and quantitative analyses of nucleosides and nucleobases in Ganoderma spp by HPLC – DAD – MS Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 44: 807 – 811 38 12 Gong Y X., Li S P., Lia P., Liu J J., and Y T Wang 2004 Simultaneous determination of six main nucleosides and bases in natural and cultured Cordyceps by capillary electrophoresis Journal of Chromatography A 1055: 215 – 221 13 Guo C., Zhu J., Zhang C., and L J Zhang 1998 Determination of adenosine and 3' – deoxyadenosine in Cordyceps militaris (L.) Link By HPLC J.Chinese 23: 236 – 237 14 Guo F Q., Li A., Huang L F., Liang Y Z., and B M Chen 2006 Identification and determination of nucleosides in Cordyceps sinensis and its substitutes by high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40: 623 – 630 15 Hsu T H., Shiao L H., Hsieh C., and D M Chang 2002 DongChongXiaCao, its counterfeit and mimic, and fermented mycelium of Cordyceps sinensis Food Chem 78: 463 – 469 16 Huang L., Li L., Chen Y., Wang X., and X Zhou 2009 Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp African Journal of Microbiology Research 3: 957 – 961 17 Kieszling, P E., Scriba, G K., Susz, F., Werner, G., Knoth, H., and Hartmann 2004 Development and validation of a high performance liquid chromatography assay and a capillary electrophoresis assay for the analysis of adenosine and the degradation product adenine in infusions Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 36: 535 – 539 18 Leung P H., Zhang Q X., and J Y Wu 2006 Mycelium cultivation, chemical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp fungus isolated from wild Cordyceps sinensis Journal of Applied Microbiology 101: 275 – 283 19 Li S P., Yang F Q., Karl W., and K Tsim 2006 Quality control of Cordyceps sinensis, avalued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41: 1571 – 1584 20 Liu H J., Hu H P., Chu C., LiQ., and P Li 2011 Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits Acta Pharmaceutica Sinica B 1: 189 – 195 21 Olah, M E., Stiles, G L 1992 Adenosine receptors Annual Reviews – Physiology 54: 211 – 225 22 Li S P., Li P., Lai C M., and Y X Gong 2004 Stimultaneous determination of ergosterol, nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurized liquid extraction and high performance liquid chromatography Journal of Chromatography A 1036: 239 – 243 23 William Horwitz 1995 Protocol for the design, conduct and interpretation of method – performance studies Pure and Appl Chem 67: 331 – 343 39 24 Xie J W., Huang L F., Hu W., He Y B., and K P Wong 2010 Analysis of the Main Nucleosides in Cordyceps Sinensis by LC/ESI – MS Molecules 15:305 – 314 25 Xue X F., Zhou J H., Wua L M., Fu L H., and J Zhao 2009 HPLC determination of adenosine in royal jelly Food Chemistry 115: 715 – 719 Tài liệu Internet 26 http://thaobanvuong.com/tin-tuc-dong-trung-ha-thao/12:dong-trung-ha-thao-la-gi Truy nhập 20/01/2013 27 http://www.case.vn/vi-VN/87/88/117/details.case Truy nhập 20/1/2013 28 http://www.impe - qn.org.vn Truy nhập ngày 10/2/2013 29 http://www.vietgioitinh.net/moi-nguoi-cung-khoe/tac-dung-cua-dong-trung-hathao-37692.html Truy nhập 20/5/2013 30 Nguyễn Lân Dũng Đông Trùng Hạ Thảo 2005 http://vietsciences.org 40 PHỤ LỤC Thành phần môi trường PGA bao gồm: - Khoai tây: 200g - Glucose: 20g - Agar: 20g - KH2PO4: 1g - Nước cất: lít Số liệu kết xử lý thống kê Bảng Thơng số q trình chuẩn bị mẫu phân tích HPLC khảo sát ảnh hưởng dung mơi đến hiệu ly trích adenosine thời gian đánh sóng siêu âm phút Tên mẫu SPIKE H2O-5 H2O-5-1 H2O-5-2 H2O-5-3 SPIKE ETHOH 30-5 ETHOH 30-5-1 ETHOH 30-5-2 ETHOH 30-5-3 SPIKE ETHOH 50-5 ETHOH 50-5-1 ETHOH 50-5-2 ETHOH 50-5-3 SPIKE METOH 60-5 METOH 60-5-1 METOH 60-5-2 METOH 60-5-3 SPIKE METOH 90-5 METOH 90-5-1 METOH 90-5-2 METOH 90-5-3 Khối lượng (g) 0,5015 0,502 0,5032 0,5021 0,5016 0,5002 0,5002 0,5002 0,5047 0,5007 0,5006 0,5009 0,5001 0,5007 0,5008 0,5001 0,505 0,501 0,5003 0,501 Thể tích định mức (ml) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Thời gian lưu (phút) 19,453 19,636 19,519 19,545 20,114 21,238 21,333 21,322 20,145 21,003 20,92 21,035 20,553 21,706 21,725 21,534 20,081 22,132 20,655 21,93 Diện tích peak (mAU) 1786,8 1305,1 1429,4 1351,2 1655,8 1255,4 1302,4 1300 1712,2 1317,8 1340,4 1296,5 1617,5 1197,1 1161 1233,8 1634,1 1273,5 1254,6 1224,8 Bảng Thông số q trình chuẩn bị mẫu phân tích HPLC khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu ly trích adenosine thời gian đánh sóng siêu âm 15 phút Tên mẫu SPIKE H2O-15 H2O 15-1 H2O 15-2 H2O 15-3 SPIKE ETHOH 30-15 ETHOH 30-15-1 ETHOH 30-15-2 ETHOH 30-15-3 SPIKE ETHOH 50-15 ETHOH 50-15-1 ETHOH 50-15-2 ETHOH 50-15-3 SPIKE METOH 60-15 METOH 60-15-1 METOH 60-15-2 METOH 60-15-3 SPIKE METOH 90-15 METOH 90-15-1 METOH 90-15-2 METOH 90-15-3 Khối lượng (g) 0,5003 0,5028 0,5009 0,5029 0,506 0,5003 0,5001 0,5006 0,503 0,5011 0,5003 0,501 0,5039 0,5019 0,5011 0,502 0,5113 0,503 0,5012 0,5033 Thể tích định mức (ml) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Thời gian lưu (phút) 20,876 20,636 22,105 21,997 20,297 21,775 20,615 21,641 20,144 20,573 21,087 21,063 20,609 22,646 22,627 20,613 20,355 22,276 22,38 22,395 Diện tích peak (mAU) 1776,5 1308,9 1303,2 1363 1645,5 1237 1293,8 1278,4 1687,9 1400,3 1324,9 1367,8 1637 1241,9 1229 1222,8 1606,9 1301 1261,4 1189,3 Bảng Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu Thời gian đánh sóng phút 15 phút Dung mơi Nước cất Ethanol 30% Ethanol 50% Methanol 60% Methanol 90% Nước cất Ethanol 30% Ethanol 50% Methanol 60% Methanol 90% Hiệu suất thu hồi (%) Lặp 118,5 112,2 110,5 103,4 101,0 115,1 114,4 80,6 97,2 85,7 Lặp 87,9 99,0 104,2 112,3 106,3 116,5 98,5 101,7 100,4 96,8 Lặp 107,2 99,7 116,5 94,4 114,7 101,8 102,8 89,7 101,9 117,0 Trung bình 104,6 103,6 110,4 103,4 107,3 111,1 105,3 90,7 99,9 99,8 Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê ảnh hưởng dung môi thời gian ly trích đến nồng độ adenosine Thời gian đánh sóng phút 15 phút Dung môi Nước cất Ethanol 30% Ethanol 50% Methanol 60% Methanol 90% Nước cất Ethanol 30% Ethanol 50% Methanol 60% Methanol 90% Nồng độ adenosine (µg/g) Lặp 1358,59 1322,08 1303,24 1260,52 1293,12 1280,42 1281,49 1687,28 1352,28 1415,54 Lặp 1487,73 1372,89 1326,41 1221,18 1275,21 1279,54 1342,45 1596,83 1339,99 1376,27 Lặp 1407,53 1370,3 1281,13 1301,77 1242,38 1334,43 1324,74 1647,52 1330,66 1290,13 Trung bình 1417,95 1355,09 1303,59 1261,16 1270,24 1298,13 1316,23 1643,88 1340,98 1360,65 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm ảnh hưởng dung mơi thời gian ly trích đến nống độ adenosine số liệu bảng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 37153.611 37153.611 23.0323 0.0001 Factor B 113605.129 28401.282 17.6065 0.0000 AB 182174.844 45543.711 28.2334 0.0000 -7 Error 20 32262.248 1613.112 -Total 29 365195.832 - Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm ảnh hưởng dung mơi thời gian ly trích đến nống độ adenosine kết bảng Error Mean Square = 1613 Error Degrees of Freedom = 20 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 93.31 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 1418 1355 1304 1261 1270 1298 1316 1644 1341 1361 Ranked Order B BC CD D CD CD CD A BCD BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 1644 1418 1361 1355 1341 1316 1304 1298 1270 1261 A B BC BC BCD CD CD CD CD D ... ngoại biên Đề tài Tối ưu hóa quy trình phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm Cordyceps sinensis thực nhằm xây dựng quy trình chuẩn để phân tích hàm lượng adenosine sản phẩm C sinensis, ứng... đồcủa mẫu nấm C sinensis ,ly trích mẫu methanol 60% 32 Hình 4.9Sắc ký đồ mẫu nấm C sinensis ,ly trích mẫu methanol 90% 32 Hình 4.1 0Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ sợi nấm C sinensis. .. 29 4.4.1 Định tính adenosine mẫu phân tích 29 4.4.2 Định lượng adenosine mẫu phân tích 33 4.5 Quy trình tối ưu phân tích adenosine ly trích từ hệ sợi nấm 35 v Chương KẾT