XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

66 1 0
  • Loading ...
1/66 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 26/02/2019, 14:32

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TỐNG TRẦN THẢO LY Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 12 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.NGUYỄN QUỐC BÌNH TỐNG TRẦN THẢO LY KS.TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Tháng 12 / 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết xin cảm ơn ba mẹ sinh nuôi nấng, dạy dỗ đến trưởng thành ngày hôm Ba mẹ người động viên giúp đỡ lúc khó khăn học tập Và cảm ơn thành viên gia đình động lực cho cố gắng sống Em xin chân thành cảm ơn đến: Thầy PGS.TS Lê Đình Đơn trưởng mơn Cơng nghệ sinh học tạo kiện cho em thực đề tài Và thầy cô môn truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường Ban giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM giúp đỡ tạo kiện cho em thực đề tài trung tâm TS Nguyễn Quốc Bình KS Trần Thị Thanh Hương tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình thực đề tài Các anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM chia động viên lúc em gặp khó khăn nhiệt tình giúp đỡ em Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 Tống Trần Thảo Ly i TÓM TẮT Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus loại vi khuẩn nguy hiểm, tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Việt Nam nước giới Việc kiểm soát diện vi khuẩn thực phẩm cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Trong nghiên cứu này, thiết kế chọn lọc cặp mồi đặc hiệu cho chủng vi khuẩn mục tiêu Các cặp mồi chọn cho kết đặc hiệu 100% với loài vi khuẩn mục tiêu, khơng có tượng bắt cặp chéo với loại vi khuẩn khác Quy trình định lượng vi khuẩn mục tiêu kỹ thuật real-time PCR thiết lập thành công với độ nhạy phản ứng 3-10 cfu/ 25g mẫu thực phẩm (R2= 0.998), độ tin cậy đạt 90% Kết định lượng tương đồng so với phương pháp đếm tế bào đĩa thạch Tuy nhiên, so với phương pháp nuôi cấy truyền thống, định lượng vi sinh vật phương pháp real-time PCR cho kết xác cao rút ngắn thời gian xét nghiệm Tồn q trình định lượng vi khuẩn kỹ thuật real-time PCR khoảng 30 so với thời gian 5-7 ngày sử dụng phương pháp truyền thống Kết nghiên cứu sở khoa học để phát triển kit real-time PCR dùng xét nghiệm an toàn thực phẩm vừa đáp ứng yêu cầu độ nhạy, độ xác cao, có thời gian xét nghiệm nhanh phương pháp ni cấy truyền thống Từ khóa: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR ii SUMMARY Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus are dangerous bacteria, is the main cause of food poisoning in Vietnam and countries around the world The control of the presence of bacteria in food is necessary to ensure food safety and protect the health of consumers In this study, we have designed and selected the specific mồis for each target bacteria The mồi pairs were selected for specificity 100% results with target bacteria, not the phenomenon of cross-pairing with other bacteria Process quantify target bacteria by real-time PCR technique was also successfully established with a sensitivity reaction is 3-10 cfu / 25g food sample (R2 = 0.998), reliability of over 90% The results of this real-time PCR technique similar to cell counts on agar plates However, quantitative microorganisms methods by real-time PCR is exactly and rapidly The results of this study will be the scientific basis for developing real-time PCR kit used in food safety testing Key words: Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus, real-time PCR iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Việt Nam 2.2 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến 2.2.1 Vi khuẩn Salmonella 2.2.2 Vi khuẩn Shigella 2.2.3 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 2.3 Một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm 2.3.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.2 Phương pháp Real-time PCR 10 2.3.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật real-time PCR dùng màu huỳnh quang chèn 11 2.3.2.2 Phân tích tổng quát phản ứng real-time PCR 12 2.3.2.3 Tính lập lại phản ứng real-time PCR 13 2.4 Tình hình nghiên cứu nước 13 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 iv 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu 15 3.2.1 Vi khuẩn 15 3.2.2 Vật liệu hóa chất dùng phản ứng Real-time PCR 15 3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 16 3.3 Dụng cụ thiết bị 17 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Thiết kế mồi đặc hiệu 19 3.4.2 Phương pháp trích ly DNA vi khuẩn 21 3.4.3 Xây dựng quy trình phản ứng real-time PCR 22 3.4.3.1 Sàng lọc mồi tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi 22 3.4.3.2 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 24 3.4.3.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 24 3.4.4 So sánh với phương pháp truyền thống 30 3.4.4.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30 3.4.4.2 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn dịch nuôi cấy 30 3.4.4.3 Phương pháp gây nhiễm khuẩn nhân tạo vào mẫu thực phẩm 31 3.4.5 Thực phản ứng real-time PCR 31 3.4.5.1 Chương trình real-time PCR 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết thiết kế mồi sở lí thuyết 33 4.2 Kết xây dựng quy trình phản ứng Real-time PCR 33 4.2.1 Sàng lọc tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi (Ta) 33 4.2.2 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi 36 4.2.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 40 4.2.3.1 Kết PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu 39 4.2.3.2 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả nạp 39 4.2.3.3 Kết PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp 40 4.2.3.4 Kết dựng đường chuẩn 43 v 4.3 Kết định lượng sau gây nhiễm thực nghiệm realtime PCR 48 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AOAC : Association of Official Agriculture Chemists BAM: Bacteriological Analytical Manual BC: Bacillus CDC: Centers for Disease Control and Prevention CT: Chu kì ngưỡng OD : optical density Gen ial: invasive-associated locus Gen invA: invasion gen Gen ipaH: invasion plasmid antigen Lis: Listeria PCR: Polymerase Chain Reaction TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam Sal: Salmonella Shi: Shigella STEC : Shiga Toxin-Producing Escherichia coli V: Vibrio parahaemolyticus vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp Bảng 3.1 Thành phần phản ứng real-time PCR 23 Bảng 3.2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR 23 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR (sử dụng Pfu polymerase) 26 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối 27 Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng real-time PCR dựng đường chuẩn 30 Bảng 4.1 Các cặp mồi thiết kế thực phản ứng PCR 33 Bảng 4.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho Salmonella, Shigella, V parahaemolyticus 38 Bảng 4.3 Kết đo OD mẫu plasmid chứng dương 43 Bảng 4.4 Kết dựng đường chuẩn cho real-time PCR định lượng Salmonella 43 Bảng 4.5 Kết định lượng Salmonella từ canh khuẩn 44 Bảng 4.6 Kết dựng đường chuẩn Shigella cho phản ứng real-time PCR 45 Bảng 4.7 Kết định lượng Shigella từ canh khuẩn 46 Bảng 4.8 Kết dựng đường chuẩn Vibrio parahaemolyticus cho realtime PCR 46 Bảng 4.9 Kết định lượng V parahaemolyticus từ canh khuẩn 47 Bảng 4.10 Kết phát vi khuẩn 48 viii 4.2.3 Dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 4.2.3.1 Kết PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu Khuếch đại đoạn gen mục tiêu đủ lượng để sử dụng làm nguyên liệu để nối vào plasmid pJET1.2 tạo plasmid chứng dương, phản ứng PCR với chu kì khuếch đại nhỏ (30 chu kì) Lúc sản phẩm PCR giai đoạn tăng theo pha log nên sản phẩm tốt Ít có sản phẩm phụ Nhưng tiến hành điện di để thu sản phẩm kích thước mong muốn tránh đoạn chèn khơng đặc hiệu Thu sản phẩm DNA có kích thước mong muốn (Sal_inva1 284 bp, Shi_ipaH 610 bp, V_toxR 370 bp) 284bp L 370bp 610bp Hình 4.11: Kết điện di để thu DNA từ gel 1: Sal_invA1, 2: V_toxR, 3: Shi_ipaH, L: thang 1Kb plus 4.2.3.2 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α khả nạp Plasmid tái tổ hợp mang gen mục tiêu trãi lên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh ampicillin Ampicilin chất giúp chọn lọc tế bào biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp có plasmid gắn đoạn gen vào biểu khả kháng ampicilin, plasmid tự nối vòng sản sinh độc tố giết chết tế bào chủ Kết cho thấy đĩa mọc khuẩn lạc Đĩa đối chứng âm (tế bào E.coli DH5α khả nạp) khuẩn lạc Như sơ bộ, chúng tơi thu tế bào chứa plasmid Tuy nhiên plasmid gì, phải plasmid chứa đoạn gen mục tiêu khơng? Để biết chúng tơi tiến hành sàng lọc khuẩn lạc phương pháp PCR với hai cặp trình tự mồi (mồi plasmid mồi đoạn gen) để xác định xác dòng tế bào E.coli chứa plasmid chứng dương 40 Hình 4.12 Kết chọn lọc dòng tế bào E.coli DH5α biến nạp môi trường LB-amp a) plasmid tái tổ hợp Shi_ipaH, b) plasmid tái tổ hợp Sal_invA1 c) plasmid tái tổ hợp V_toxR, d) mẫu âm tế bào khả nạp E.coli DH5α 4.2.3.3 Kết PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang đoạn gen mục tiêu a) Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi vector pJET1.2 Hình 4.13 Kết sàng lọc dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng dương đoạn gen Sal- invA1 với cặp mồi vector pJET1.2 41 Hình 4.14 Kết sàng lọc dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng dương đoạn gen Shi- ipaH với cặp mồi vector pJET1.2 Hình 4.15 Kết sàng lọc dòng tế bào Ecoli DH5α chứa plasmid chứng dương đoạn gen V-toxR với cặp mồi vector pJET1.2 Kích thước sản phẩm PCR với cặp mồi pJET 1.2 Sal_invA1 khuẩn lạc cho sản phẩm khơng kích thước, Shi_ipaH khuẩn lạc 3, 7, khơng đúng, khuẩn lạc lại tiếp tục thu DNA tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.kích thước, V_toxR khuẩn lạc khơng kích thước loại bỏ Sau kiểm tra với cặp mồi pJET 1.2 chọn khuẩn lạc kích thước mong muốn, tiếp tục thu DNA kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu riêng cho chủng 42 b) Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu E.Dh5 (+) (-) L 284bp Hình 4.16 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Sal_invA1 E.Dh5 (+) (-) L 610bp Hình 4.17 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi Shi_ipaH E.Dh5 (+) (-) L 370bp Hình 4.18 Kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi V_toxR Kết điện di cho thấy cặp mồi không bắt cặp với DNA vi khuẩn E.coli DH5α, mẫu âm khơng lên band sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu thu được, có band điện di kích thước mong muốn chứng tỏ khuẩn lạc chứa plasmid có đoạn chèn đặc hiệu Sal_invA1 khuẩn lạc vị trí 2, 3, 5, có plasmid chứng dương đoạn chèn gen invA1 Shi_ipaH V_toxR tất khuẩn lạc kiểm tra có plasmid chứng dương với đoạn chèn đặc hiệu cho gen 43 4.2.3.4 Kết dựng đường chuẩn Bảng 4.3 Kết đo OD mẫu plasmid chứng dương Tên mẫu Số copy µl mẫu DNA µg/ml p.Sal_invA1 (284bp) 3258(bp) p.Shi_ipaH (610bp) 3584(bp) p.V_toxR (370bp) 3344(bp) 0,932 1,399 0,843 1,058 3,01 x 108 2,522 1,997 2,342 2,287 5,91 x 108 1,497 1,722 1,381 1,533 4,25 x 108 Để thuận tiện cho việc tính tốn mẫu plasmid chứng dương pha loãng nồng độ x 10n để pha loãng tới hạn, nồng độ cuối lại copy µl mẫu  Kết định lượng Salmonella Hình 4.18 cho thấy kết dựng đường chuẩn quy trình real-time PCR định lượng Salmonella cho hiệu khuếch đại 91,6% R2 = 0,995, tương quan chặt chẽ Kết định lượng cho thấy phát tế bào vi khuẩn chu kì 36,42 (Bảng 4.4 ) Bảng 4.4 Kết dựng đường chuẩn real-time PCR định lượng chủng Salmonella Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Neg Ctrl-1 Neg Ctrl-1 105 104 103 102 101 100 N/A N/A 17,8 20,81 25,38 29,55 32,19 36,42 N/A N/A 44 Hình 4.19 Kết so sánh định lượng real-time PCR phương pháp đếm khuẩn lạc Từ đường chuẩn có tiến hành định lượng Salmonella mẫu canh khuẩn Kết cho thấy phát mức 1,3 tế bào, vào khoảng chu kì 36,25 Kết tương đồng với kết định lượng phương pháp nuôi cấy truyền thống (Bảng 4.5 ) Bảng 4.5 Kết định lượng Salmonella từ canh khuẩn Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Đếm khuẩn lạc 3,51*102 2,04*102 1,19*102 1,84*10 1,3 Số Ct 27,96 28,24 29,31 31,93 36,25 Real-time 3,5*102 200 100 18 1,4 45  Kết định lượng Shigella Hình 4.19 cho thấy kết dựng đường chuẩn quy trình real-time PCR định lượng Shigella cho hiệu khuếch đại 89,7% R2 =0,9914 tương quan chặt chẽ Kết định lượng cho thấy phát tế bào vi khuẩn chu kì 41,47 (Bảng 4.6) Bảng 4.6 Kết dựng đường chuẩn Shigella cho phản ứng real-time PCR Std-1 Std-2 Std-3 Std-4 Std-5 Neg Ctrl-1 Neg Ctrl-1 104 103 102 101 100 N/A N/A 20,3 26,77 31,72 35,26 41,47 N/A N/A Hình 4.20 Kết dựng đường chuẩn real-time PCR cho vi khuẩn Shigella Từ đường chuẩn có tiến hành định lượng Salmonella mẫu canh khuẩn kết cho thấy phát mức 2,6 tế bào, vào khoảng chu kì 46 39,65 Kết tương đồng với kết định lượng phương pháp nuôi cấy truyền thống (Bảng 4.7) Bảng 4.7 Kết định lượng Shigella từ canh khuẩn Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Đếm khuẩn lạc 3,16*102 2,42*102 1,35*102 1,78*10 2,5 Số Ct 28,15 30,43 31,12 35,78 39,65 Real-time 3,2*102 245 137 18 2,6  Kết định lượng Vibrio parahaemolyticus Hình 4.20 cho thấy kết dựng đường chuẩn quy trình real-time PCR định lượng Vibrio parahaemolyticus cho hiệu khuếch đại 87,19% R2 =0,9998 tương quan chặt chẽ Kết định lượng cho thấy phát tế bào vi khuẩn chu kì 40,7 (Bảng 4.8) Bảng 4.8 Kết dựng đường chuẩn Vibrio parahaemolyticus real-time PCR Std1 105 18,3 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Neg Ctrl-1 Neg Ctrl-1 104 103 102 101 100 N/A N/A 22,63 27,26 31,41 36,2 40,7 N/A N/A 47 Hình 4.21 Kết Real-time PCR dựng đường chuẩn cho Vibrio parahaemolyticus Từ đường chuẩn có tiến hành định lượng Salmonella mẫu canh khuẩn kết cho thấy phát mức tế bào, vào khoảng chu kì 38,95 Kết tương đồng với kết định lượng phương pháp nuôi cấy truyền thống (Bảng 4.9 ) Bảng 4.9 Kết định lượng V parahaemolyticus từ canh khuẩn Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Đếm khuẩn lạc 3,48*102 2,78*102 1,56*102 1,68*10 1.9 Số Ct 28,37 30,49 31,26 34,67 38,95 Real-time 3,5*102 283 150 17 48 4.3 Kết định lượng real-time PCR chủng vi khuẩn mẫu thực phẩm gây nhiễm thực nghiệm Qua bảng 4.10 cho thấy tất nồng độ gây nhiễm (3, 5, 10, 25 100 tế bào) sau nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus phát từ loại mẫu thực phẩm Trong loại mẫu với nồng độ khơng ni cấy qua đêm khả phát quy trình định lượng real-time PCR Do khuyến cáo nên tiến hành nuôi cấy qua đêm trước tiến hành định lượng vi khuẩn Bảng 4.10 Kết phát vi khuẩn nồng độ 0, 3, 5, 10, 25, 100 tế bào sau nuôi cấy qua đêm 370C (thí nghiệm lặp lại lần) Loại mẫu tế bào tế bào tế bào 10 tế bào 25 tế bào 100 tế bào Thịt heo _ + + + + + Thịt gà _ + + + + + Tôm _ + + + + + Cá bống _ + + + + + Xúc xích _ + + + + + Cải _ + + + + + Từ kết định lượng chứng tỏ hai phương pháp có độ nhạy Real-time PCR tiết kiệm thời gian nhiều, tổng thời gian từ nhận mẫu đến lúc có kết 30 chi phí khoảng 70.000, phương pháp ni cấy truyền thống từ 7-9 ngày chi phí lên tới 200.000 Tóm lại việc xây dựng quy trình real-time PCR để định lượng vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phương án khả thi tiết kiệm thời gian, chuẩn đoán nhanh kịp thời ngăn chặn dịch bệnh xảy Đem lại hiệu an toàn thực phẩm cho người sử dụng, thúc đẩy mạnh mẽ hoạt động xuất nhập đất nước 49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết thúc thời gian nghiên cứu đề tài hồn thành u cầu đề là:  Thiết kế cặp mồi đặc hiệu chủng vi khuẩn mục tiêu  Xây dựng thành cơng quy trình phản ứng real-time PCR, tối ưu chủng vi khuẩn mục tiêu  Quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Gram (-) áp dụng để tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn Gram (-) khác 5.2 Đề nghị Kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi với nhiều chủng vi khuẩn khác kể vi khuẩn có lợi vi khuẩn gây bệnh người để tăng độ tin cậy kết xét nghiệm 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Huỳnh Văn Biết Bài giảng PCR nâng cao 2013 Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Nguyễn Hồng Lộc 2007 Công nghệ DNA tái tổ hợp Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh Trang 67-68 Nguyễn Tiến Dũng Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩmthuật sinh học phân tử 2010 Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Cẩm Ly Phân lập xác định gen độc tố Vibrio parahaemolyticus hải sản tươi sống Nha Trang 2011 Trần Linh Thước Phương pháp Phân tích Vi sinh vật nước, thực phẩmphẩm 2006: Nhà xuất Giáo dục Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu nước CDC Preliminary FoodNet Data on the Incidence of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food -10 States, 2008 Morbidity and Mortality Weekly Report 2009 Fukushima H., Y Tsunomori, and R Seki, Duplex Real-time SYBR Green PCR Assays for Detection of 17 Species of Food- or Waterborne Pathogens in Stools J.Clin Microbiol.,2003 Blackstone G.M., Nordstrom J.L., Vickery M.C., Bowen M.D., Meyer R.F., DePaola A 2003 Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments by real time PCR Journal of Microbiology Methods 10 Fukushima H., Kazunori Katsube, Yoshie Tsunomori, Ryoko Kishi, Junko Atsuta, Yuko Akiba, Comprehensive and Rapid Real-time PCR Analysis of 21 Foodborne Outbreaks 2009, Hindawi Publishing Corporation 11 Kim, J.S., Lee G.G., Park J.S., Jung Y.H., Kwak H.S., Kim S.B., Nam Y.S., Kwon S.T., A Novel Multiplex PCR Assay for Rapid and Simultaneous Detection of Five Pathogenic Bacteria : Escherichia coli 0157:H7, Salmonella, Staphylococcus 51 aureus, Listeria monocytogens, and Vibrio parahaemolyticus Journal of Food Protection, 2007 12 Frankel.G, Lee Riley, Jorge A Giron, Janice Valmassoi, Adam Friedmann, Nancy Strockbine, Stanley Falkow, and Gary K Schoolnik,1990, Detection of Shigella in Feces Using DNA Amplification 13 Fan.L, Paul Roffey, Chris Blanchard, Gu Ken Qin, Development of a Multiplex PCR Method for the Detection of Six Common Foodborne Pathogens Journal of Food and Drug Analysis, 2008 14 Vargas.M, Joaquim Gascon, Maria Teresa Jimenez De Anta1, and Jordi Vila 1999 Prevalence of Shigella Enterotoxins and among Shigella Strains Isolated from Patients with Traveler's Diarrhea Journal of Clinical Microbiology 15 Martinez-Urtaza, J., Antonio Lozano-Leon, Angelo DePaola, Masanori Ishibashi, Kanae Shimada, Mitsuaki Nishibuchi and Ernesto Liebana Characterization of pathogenic Vibrio parahaemolotycus Isolates from Clinical Sources in Spain and Comparison With Asian and North American Pandemic Isolates J Clin Microbiol., 2004 16 McEntire, J., et al., Scientific Status Summary: Becteria Associated with Foodborne Diseases Insitute Of Food Technologists, 2004 17 Nordstrom, J.L., Michael C L Vickery, George M Blackstone, Shelley L Murray, Angelo DePaola Development of a Multiplex Real-time PCR Assay with an Internal Amplification Control for the Detection of Total and Pathogenic Vibrio parahaemolyticus Bacteria in Oysters Appl Environ Microbiol., 2007 18 O'Regan E, McCabe E, Burgess C, McGuinness S, Barry T, Duffy G, Whyte P, Fanning S, Development of a real-time multiplex PCR assay for the detection of multiple Salmonella serotypes in chicken samples BMC Microbiology, 2008 19 Phan,T.T., Phan TT, Khai LT, Ogasawara N, Tam NT, Okatani AT, Akiba M, Hayashidani H, Contamination ò Salmonella in Retail Meats and Shrimps in the Mekong Delta, Vietnam Journal of Food protection, 2005 20 WANG, L., Rapid and simultaneous quantitation of Escherichia coli O157:H Salmonella, and Shigella in ground beef by multiplex real-time PCR and 52 immunomagnetic separation Vol 70 2007, Des Moines, IA, ETATS-UNIS: International Association of Milk, Food and Environment Sanitarians 21 Wang, R.F., W.W Cao, and C.E Cerniglia, A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods Journal of Applied Microbiology, 1997 22 Ward, L.N and A.K Bej, Detection of Vibrio parahaemolyticus in Shellfish by Use of Multiplexed Real-time PCR with TaqMan Fluorescent Probes Appl Environ Microbiol., 2006 23 Yeung, P.S.M and K.J Boor, Epidemiology, Pathogensis, and Prevention of Foodborne Vibrio parahaemolyticus Infections Foodborne Pathogens and Disease, 2004 Tài liệu internet: 24.http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/generuler-1-kbdna-ladder-250-to-10000-bp/ 25.http://www.thermoscientificbio.com/molecular-cloning/clonejet-pcr-cloning-kit/ 53 54 ... TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh vi n thực TS.NGUYỄN... quy trình định lượng chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus mẫu thực phẩm kỹ thuật real-time PCR cần phải trải qua bước: Bước 1: Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn Salmonella,. .. Shigella, Vibrio parahaemolyticus Bước 2: Thiết kế mồi đặc hiệu cho chủng vi khuẩn Salmonella, Shigella, Vibrio parahaemolyticus Bước 3: Xây dựng quy trình real-time PCR phát chủng vi khuẩn: Salmonella,
- Xem thêm -

Xem thêm: XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR , XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN Salmonella, Shigella,Vibrio parahaemolyticus TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay