BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ NHẬT LỆ Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 6/2013 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TÔN TRANG ÁNH NGUYỄN THỊ NHẬT LỆ KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM Tháng 06/2013 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Cô Tôn Trang Ánh cô Tô Thị Nhã Trầm tận tình hướng dẫn, giúp đỡ nhiều động viên, nhắc nhở suốt thời gian làm đề tài Các bạn Lê Thị Ngân Hà, Huỳnh Phước toàn thể lớp DH09SH động viên giúp đỡ lúc tơi khó khăn Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người bên con, cho niềm tin nghị lực để vượt qua khó khăn Nguyễn Thị Nhật Lệ iii TÓM TẮT Cây cỏ (Stevia rebaudiana Bertoni) (chất làm tự nhiên) thuộc họ Cúc sử dụng để thay chất làm nhân tạo cho bệnh nhân tiểu đường Thông thường, trồng hạt cắt cành, tỷ lệ khả phát triển hạt giống thấp Nghiên cứu phát sinh mô sẹo từ mẫu cỏ làm nguyên liệu tiền đề cho nghiên cứu nhằm ứng dụng vào sản xuất sinh khối thu nhận hợp chất thứ cấp quý có Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mẫu khảo sát phát sinh chồi cỏ (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro” tiến hành Các đoạn thân mẫu khử trùng bề mặt HgCl2 0,1% phút sau rửa lại lần với nước cất Bề mặt mẫu khử trùng nuôi cấy môi trường Murashige Skoog (MS) với nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác 2,4 - D kinetin kết hợp với 2,4 - D Mô sẹo phát sinh hiệu mảnh nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 - D kết hợp với mg/l kinetin sau tuần nuôi cấy Mô sẹo cấy truyền môi trường MS có bổ sung mg/l BA kết hợp với mg/l NAA cho khả nhân chồi cao Cảm ứng hình thành chồi từ đoạn thân cao môi trường MS bổ sung BA Giảm nồng độ BA thúc đẩy trình nhân chồi Số lượng chồi tối đa tăng lên nhanh chóng thu mơi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA sau tuần nuôi cấy iv SUMMARY Stevia rebaudiana Bertoni (natural sweetener) belongs to Asteraceae family and can be used as substitute of artificial sweeteners for diabetic patients Conventionally, it is cultivated by seeds or stem cutting, but seed viability rate is poor Study the callus incurred from leaf samples of the Stevia rebaudiana Bertoni, as materials and the premise for the research to apply in biomass production receive for secondary compounds in plants Therefore, the thesis “Research callus formation from leaf samples and shoots generation of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro” were achieved Nodal segments and leaf explants were surface sterilized with 0.1% HgCl2 for minutes followed by rinsing them five times with double distilled water Surface sterilized leaf explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium with different concentrations of plant hormone like 2,4 - D and kinetin in combination with 2.4 - D Leaf - derived callus was efficiently induced when leaf segments were cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/l 2.4 - D and mg/l kinetin after weeks The above callus was sub - cultured on MS medium with mg/l BA and mg/l NAA for the highest shoot multiplication The induction of multiple shoots from nodal segments was the highest in MS medium supplemented with BA Decreasing BA concentration promoted shoot multiplication The maximum number of proliferated shoots was obtained on MS medium supplement with 0.1 mg/l BA after weeks Key words: Stevia rebaudiana Bertoni, callus formation, shoots v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cỏ (Stevia rebaudianna Bertoni) 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm 2.2.2 Các kỹ thuật dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1 Nuôi cấy phôi 2.2.2.2 Nuôi cấy mô quan tách rời 2.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh 2.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn 2.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn 2.2.2.6 Nuôi cấy protoplast 2.2.3 Tầm quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.4 Một số thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3 Nhân giống vơ tính in vitro 2.3.1 Sinh sản vơ tính hữu tính 2.3.2 Mục đích nhân giống in vitro vi 2.3.2.1 Ưu điểm vi nhân giống 2.3.2.2 Hạn chế vi nhân giống 10 2.3.3 Các bước nhân giống vơ tính in vitro 11 2.3.4 Vai trò chất kích thích sinh trưởng tái sinh in vitro 12 2.3.4.1 Đặc tính auxin 12 2.3.4.2 Đặc tính cytokinin 12 2.3.5 Hệ thống hình thành chồi 13 2.3.5.1 Nhân giống thông qua giai đoạn callus 13 2.3.5.2 Tạo chồi bất định 14 2.3.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 14 2.3.6.1 Mẫu nuôi cấy 14 2.3.6.2 Môi trường nuôi cấy 15 2.3.6.3 Tính bất định mặt di truyền 16 2.3.6.4 Mẫu đưa vào nuôi cấy 16 2.3.6.5 Việc sản xuất chất gây độc từ mẫu 16 2.3.6.6 Hiện tượng thủy tinh thể 17 2.4 Nhân giống 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng HgCl2 0,1% NaOCl 25% tới khử trùng mẫu cỏ 20 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến hình thành mơ sẹo sau tuần ni cấy 21 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng 2,4 – D kinetin đến hình thành mô sẹo sau tuần nuôi cấy 22 vii 3.3.4 Khảo sát tạo chồi từ mô sẹo 23 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả nhân chồi từ đốt thân 24 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thời gian chất khử trùng thích hợp mẫu cấy cỏ 25 4.2 Ảnh hưởng 2,4 - D đến hình thành mơ sẹo từ mẫu sau tuần nuôi cấy 27 4.4 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA đến khả tạo chồi mô sẹo 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 - D 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyladenin BAP 6-benzylaminopurine HgCl2 Thủy ngân clorua IAA 3-indol-acetic acid IBA Indol-3-butyric acid Kinetin N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine MS Môi trường Murashige Skoog (1962) NAA Naphthalene acetic acid ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng HgCl2 NaOCl đến khử trùng mẫu cỏ .20 Bảng 3.2 Nồng độ 2,4 - D bổ sung vào môi trường phát sinh sẹo 21 Bảng 3.4 Sự kết hợp BA NAA môi trường tạo chồi từ mô sẹo 23 Bảng 3.5 Nồng độ BA bổ sung vào môi trường tạo chồi từ đốt thân 24 Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian chất khử trùng đến mẫu cỏ .25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng 2,4 - D đến hình thành mơ sẹo sau tuần ni cấy 27 Bảng 4.3 Ảnh hưởng 2,4 - D kinetin đến hình thành mơ sẹo trọng lượng tươi mẫu cấy 28 Bảng 4.4 Cảm ứng phát sinh chồi từ mô sẹo 30 Bảng 4.5 Số lượng chồi tạo thành từ đốt thân loại môi trường .32  x B A C c Hình 4.3 Mơ sẹo môi trường bổ sung 2,4 – D kinetin A: Môi trường 2,4 – D 2,0 mg/l kinetin 1,0 mg/l; B: Môi trường 2,4 – D 0,5 mg/l kinetin 1,0 mg/l; C: Môi trường 2,4 – D 1,0 mg/l kinetin 1,0 mg/l Chất kích thích sinh trưởng 2,4 – D thường sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng tạo mô sẹo, huyền phù tế bào thay IBA NAA để kích thích phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Thật vậy, việc sử dụng kết hợp nồng độ 2,4 – D nồng độ kinetin tác động tới khả hình thành mơ sẹo có hiệu quả, tỷ lệ mẫu tạo sẹo có khác biệt nghiệm thức thí nghiệm Sau 25 – 30 ngày ni cấy, mặt cảm ứng tạo mơ sẹo 100% mẫu cấy có phản ứng tốt với mơi trường có bổ sung 2,4 – D cytokinin nồng độ khác nhau, mơ sẹo cảm ứng hình thành vết cắt xung quanh mép cỏ Quan sát phát sinh sẹo mẫu cấy thời gian khảo sát, mơ sẹo hình thành sớm mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D mg/l kinetin với tỷ lệ 83,3% sau 20 ngày nuôi cấy Các nghiệm thức khác cho thời gian cảm ứng mô sẹo chậm 25 30 ngày nuôi cấy, tỷ lệ mẫu tạo sẹo thấp (29,2%) nghiệm thức K6 với nồng độ 2,4 – D mg/l 1mg/l kinetin, mơ sẹo khơng có khả phát sinh chồi Dễ dàng phân biệt chúng nhờ vào hình thái xốp có màu trắng Trong tăng trưởng mơ sẹo phát sinh hình thái từ mơ sẹo phụ thuộc nhiều vào loại nồng độ chất kích thích sinh trưởng diện mơi trường ni cấy Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mơ sẹo dạng bở giảm nồng độ auxin mơ sẹo có dạng nốt ( Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Mơ sẹo hình thành từ mẫu cấy mơi trường có bổ sung nồng độ 2,4 – D thấp chắc, có màu vàng xanh Trên mơi trường có nồng độ 2,4 – D tăng cao mẫu chuyển 29 dần từ màu trắng xanh sang màu trắng xốp Việc sử dụng 2,4 – D với nồng độ cao (> 0,5 mg/l) vào mơi trường ni cấy có tác động xấu đến hình thành mơ sẹo Từ thấy rằng, có khả nồng độ cao 2,4 – D gây độc cho mẫu cấy in vitro non chất 2,4 – D dioxit Vì mơ sẹo có khả phát sinh chồi nghiệm thức K2 bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D mg/l kinetin sử dụng cho thí nghiệm tạo chồi từ mơ sẹo Việc sử dụng kết hợp auxin cytokinin có tác dụng tích cực đến phát sinh mô sẹo từ mẫu cỏ đặc biệt thể rõ rệt qua kết trọng lượng tươi mẫu cấy,trọng lượng tươi mô sẹo tỷ lệ thuận với khả tạo sẹo mẫu Kết tăng sinh trọng lượng tươi mô sẹo cao (0,76 g) nghiệm thức K2 có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D mg/l kinetin, thấp nghiệm thức K6 có bổ sung 0,5 mg/l mg/l (0,05 g) Như nồng độ 2,4 – D tăng lên (0,75 mg/l – mg/l) làm giảm khả tăng sinh mô sẹo, mô sẹo xốp Nguyên nhân dẫn đến khác biệt trọng lượng tươi mô sẹo vai trò 2,4 – D kinetin thay đổi thay đổi nồng độ 2,4 – D Ở nồng độ 0,5 mg/l 2,4 – D kích thích 2,4 – D kinetin cao nhất, 2,4 – D kích thích tăng trưởng kéo dài tế bào 4.4 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA đến khả tạo chồi mô sẹo Bảng 4.4 Cảm ứng phát sinh chồi từ mô sẹo Nghiệm thức Chất điều hòa sinh trưởng Số lượng chồi BA (mg/l) NAA (mg/l) C1 0,1 0,03d ± 0,06 C2 0,2 0,20cd ± 0,12 C3 0,5 0,50b ± 0,20 C4 1,0 1,30a ± 0,17 C5 1,5 0,40bc ± 0,12 CV (%) 28,28 Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với P < 0,05 30 Hình 4.4 Sự hình thành chồi từ mô sẹo cỏ Tác động auxin cytokinin tương tác với nhau, tỷ lệ auxin cytokinin nghiêng phía cytokinin thường kích thích tạo chồi Ngồi có tác động đến q trình phát sinh chồi thơng qua kiếm sốt q trình sinh tổng hợp loại protein liên quan đến nhân tố tăng trưởng khác auxin, ethylen, thiamin Khi thêm cytokinin ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy làm thay đổi gradient hormone mẫu, đồng thời thiết lập gradient hormone Điều giúp phá vỡ trạng thái ngủ kích thích phát triển chồi (Miller Skoog, 1955) Cytokinin nhóm phenyl urea dẫn xuất denine Cytokinin chủ yếu liên quan tới phân chia tế bào, cảm ứng hình thành phơi Đối với cảm ứng tạo phôi, cảm ứng mô sẹo phản ứng rễ đòi hỏi tỷ lệ auxin cao cytokinin ngược lại (Sathyanarayana Varghese, 2007) Tỷ lệ cân cytokinin có sẵn mơi trường auxin môi trường nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến trình phát sinh chồi (Trần Văn Minh, 2003) Dựa vào nghiên cứu hình thành chồi báo cáo Sairkar cộng (2009) với kết tạo chồi tốt nồng độ BA mg/l kết hợp với mg/l NAA Ở thí nghiệm này, nồng độ BA giảm xuống mg/l nhằm tránh biến dị xảy nuôi cấy nồng độ cytokinin cao Kết thí nghiệm tạo chồi từ mơ sẹo cho thấy số lượng chồi lớn (1,30 chồi) tạo thành nghiệm thức C4 với mg/l BA mg/l NAA, nồng độ NAA tăng (1,5 mg/l) số lượng chồi giảm 0,4 chồi; số lượng chồi thấp (0,03 chồi) tạo thành nghiệm thức C1 với mg/l BA 0,1 mg/l NAA Qua quan sát cho thấy nồng độ NAA tăng, số lượng chồi tạo thành nhiều nhiên đến mức định nồng độ auxin tăng ngưỡng (1,5 mg/l) ức chế khả tạo chồi bất định tăng sinh mẫu Kết khẳng định vai trò cytokinin auxin q trình biệt hóa khác 31 Ngun nhân tượng thân cỏ có sẵn hàm lượng auxin nội sinh (IAA) định, có kết hợp auxin ngoại sinh nội sinh Khi sử dụng NAA nồng độ mg/l cảm ứng hình thành chồi bất định BA NAA cao 4.5 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tạo chồi từ thân cỏ Bảng 4.5 Số lượng chồi tạo thành từ đốt thân loại môi trường Nghiệm thức BA (mg/l) Số lượng chồi Chiều cao chồi (cm) B1 0,1 5,8a ± 0,50 3,1a ± 0,15 B2 0,2 5,1a ± 0,75 2,6b ± 0,40 B3 0,3 3,9b ± 0,17 2,1c ± 0,40 B4 0,5 3,4b ± 0,51 1,7cd ± 0,25 B5 0,7 3,1b ± 0,17 1,6cd ± 0,12 B6 1,0 1,8c ± 0,50 1,2d ± 0,12 14,27 15,52 CV (%) Trong cột, giá trị trung bình theo sau chữ khơng kí tự có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với P < 0,05 A B Hình 4.5 Chồi tạo thành từ đốt thân cỏ sau 28 ngày A: Môi trường chứa 0,1 mg/l BA; B: Môi trường chứa 0,5 mg/l BA Nhiều nghiên cứu trực tiếp cho thấy vai trò IAA nội sinh ảnh hưởng đến kéo dài phát triển mô (Bialek cộng sự, 1983; Ortuno cộng sự, 1990) Đặc biệt Law Davies (1990) tìm thấy mối liên hệ mật thiết hàm lượng IAA nội sinh kéo dài thân giống Đậu, khác chiều cao Do đó, kết cho auxin điều khiển sinh trưởng thân nguyên 32 vẹn (Yang cộng sự, 1993) Cleland (1995) chứng minh mối liên hệ mật thiết auxin sinh trưởng chồi ảnh hưởng mạnh mẽ đến kích thích kéo dài đốt thân Yang cộng (1993) chứng minh phát triển thân Đậu Hà Lan điều khiển GA3 auxin Sự tái sinh chồi phụ thuộc vào thành phần môi trường khoáng dinh dưỡng, sucrose, vitamin liên kết auxin cytokinin Tương tự kết nghiên cứu ảnh hưởng khác nồng độ BA tới khả nhân chồi từ đọan thân cỏ Sairkar cộng (2009) Các đoạn thân ni cấy mơi trường MS có bổ sung BA với nồng độ khác (0,1 – 1,0 mg/l) nhằm kích thích tái sinh kéo dài chồi Kết sau 14 ngày nuôi cấy, tất nghiệm thức có bổ sung BA mẫu cấy có khả tạo chồi, số lượng chồi tạo tỷ lệ thuận với chiều cao chồi Ở môi trường bổ sung 0,1 mg/l BA, chồi hình thành với số lượng cao (5,8 chồi) với chiều dài trung bình 3,1 cm Qua kết bảng 4.4 thấy nồng độ BA tăng cao khả tạo chồi giảm, môi trường bổ sung 0,5 mg/l BA cho số lượng chồi 3,4 chồi với chiều cao trung bình 1,7 cm; nồng độ mg/l BA số lượng chồi tạo thành thấp (1,8 chồi ) với chiều cao trung bình 1,2 cm Mơi trường tạo chồi từ đốt thân cỏ cho kết tốt mơi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 0,1 mg/l Khi bổ sung BA vào mơi trường ni cấy BA có khả kích thích tạo nhiều chồi lại khơng có khả kích thích kéo dài chồi, BA có tác dụng phá vỡ miên trạng chồi kích thích hoạt động chồi bên (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy tiên, 2002) Trong môi trường nuôi cấy, cytokinin cần cho phân chia tế bào phân hóa chồi từ mơ sẹo từ quan, tăng cường phát sinh chồi phụ Qua kết từ thí nghiệm cho thấy nồng độ BA cao khơng khơng thúc đẩy mà kìm hãm phát sinh chồi Điều lượng cytokinin nội sinh cao mẫu cấy đủ để cảm ứng trình phát sinh chồi; cỏ cỏ sẵn lượng auxin (IAA), BA có sẵn môi trường kết hợp với auxin nội sinh vừa có tác dụng phát sinh chồi vừa kéo dài chồi 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chế độ khử trùng thích hợp với mẫu mẫu thân cỏ khử cồn 70o 30 giây 0,1% HgCl2 phút Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D kết hợp với mg/l kinetin môi trường tối ưu cho cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy cỏ nghiên cứu Mơi trường MS có bổ sung mg/l BA mg/l NAA mơi trường thích hợp cho việc tạo chồi bất định sau tuần nuôi cấy Quá trình hình thành chồi từ đốt thân đạt số lượng cao mơi trường có bổ sung 0,1 mg/l BA sau tuần nuôi cấy 5.2 Đề nghị Khảo sát khả tạo sẹo với vật liệu khác cỏ (thân, cuống lá, rễ) Khảo sát kích cỡ mẫu cấy cách đặt mẫu vào môi trường ảnh hưởng đến phát sinh phát triển mô sẹo Tiếp tục khảo sát mơi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng phù hợp cho trình nhân nhanh chồi tạo rễ chồi cỏ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên 2006 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Văn Minh 2003 Công nghệ sinh học thực vật Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Dương Tấn Nhựt 2007 Cơng nghệ sinh học Tập Nhà xuất nông nghiệp Bùi Trang Việt 2000 Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu nước ngồi Ferreura C M., Handro W 1988 Micropropagation of Stevia rebaudiana through leaf exlpants from adult plants Planta Med., 54 : 57 – 160 Mizutani K O, Tanaka 2002 Use of Stevia rebaudiana sweeteners in Japan In: Stevia, The Genus Stevia Madicinal and aromatic plants industrial profiles Taylor and Francis: London and New York, 19 : 178 - 195 Nepovim A, Vanek T 1998 In vitro propagation of Stevia rebaudiana plants using multiple shoot culture Planta Med., 64 : 589 – 593 Patil V., Ashwini KS, Reddy PC, Purushotham MG, Prasad TG, Udaykuma M 1996 In vitro multiplication of Stevia rebaudiana Curr Science 70 : 960 Pratibha Gupta, Satyawati Sharma, Sanjay Saxena 2010 Callusing in Stevia rebaudiana (Natural Sweetener) for Steviol Glycoside Production International Journal of Agricultural and Biological Sciences, : 2010 10 Sairkar P., Chandravanshi M K., Shukla N P., Mehrotra N N 2009 Mass production of an economically important medicinal plant Stevia rebaudiana using in vitro propagation techniques Planta Med., : 266 – 270 11 Yomazaki, T., H E Flores 1991 Exemination of steviol glucosides production by hairy root and shoot cultures of Stevia rebaudiana Journal Natural products, 54 : 986 - 992 35 PHỤ LỤC Bảng Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm chế độ khử trùng mẫu Nghiệm Lần lặp lại thức Trung bình Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ sống sống sống sống N1 11,1 5,6 5,6 5,6 11,1 11,1 9,3 7,4 N2 11,1 5,6 16,7 5,6 22,2 16,7 16,7 9,3 N3 33,3 5,6 27,8 0,0 38,9 5,6 33,3 3,7 H1 44,4 33,3 33,3 33,3 38,9 33,3 38,9 33,3 H2 60,0 55,5 66,7 55,5 83,3 66,7 70,0 59,2 H3 83,3 27.8 100,0 16,7 83,3 11,1 88,9 18,5 Bảng Bảng ANOVA tỷ lệ thí nghiệm khử trùng mẫu số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob Between Within 12 14322.293 2864.459 678.619 56.552 50.652 0.0000 Total 17 15000.911 Coefficient of Variation = 17.56% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ mẫu nhiễm thí nghiệm khử trùng mẫu số liệu Bảng Duncan's Multiple Range Test LSD value = 13.38 s_ = 4.342 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 9.270 D Mean = 16.67 D Mean = 33.33 C Mean = 38.87 C Mean = 70.00 B Mean = 88.87 70.00 38.87 33.33 16.67 36 A B C C D Mean = 88.87 A Mean = 9.270 D Bảng Bảng ANOVA tỷ lệ sống thí nghiệm khử trùng mẫu số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 6700.182 1340.036 45.828 0.0000 Within 12 350.883 29.240 Total 17 7051.065 Coefficient of Variation = 24.67% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng tỷ lệ mẫu nhiễm thí nghiệm khử trùng mẫu số liệu Bảng Duncan's Multiple Range Test LSD value = 9.620 s_ = 3.122 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7.430 9.290 3.730 33.30 59.23 18.53 D CD D B A C Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 4= 6= 2= 1= 3= 59.23 A 33.30 B 18.53 C 9.290 CD 7.430 D 3.730 D Bảng Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm bổ sung 2,4 – D môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo Nghiệm thức S1 S2 S3 S4 S5 S6 50,0 75,0 50,0 37,5 25,0 25,0 Lần lặp lại 62,5 62,5 37,5 50,0 37,5 12,5 Trung bình 62,5 75,0 50,0 37,5 25,0 25,0 58,3 70,8 45,8 41,7 29,2 20,8 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung 2,4 – D môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob 37 Between Within 12 5069.444 1013.889 625.000 52.083 19.467 0.0000 Total 17 5694.444 Coefficient of Variation = 16.24% Bảng Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung 2,4 – D môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo số liệu Bảng Duncan's Multiple Range Test LSD value = 12.84 s_ = 4.167 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 58.33 AB Mean = 70.83 A Mean = 45.83 BC Mean = 70.83 A Mean = 58.33 AB Mean = 45.83 BC Mean = 41.68 CD Mean = 41.68 CD Mean = 29.17 DE Mean = Mean = 20.83 E 29.17 Mean = 20.83 DE E Bảng Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình K1 75,0 62,5 62,5 66,7 K2 87,5 75,0 87,5 83,3 K3 62,5 37,5 50,0 50,0 K4 37,5 50,0 50,0 45,8 K5 37,5 37,5 25,0 33,3 K6 25,0 37,5 25,0 29,2 Bảng 10 Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo số liệu Bảng ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob 38 Between Within 12 6319.444 1263.889 833.333 69.444 18.200 0.0000 Total 17 7152.778 Coefficient of Variation = 16.22% Bảng 11 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo sẹo số liệu Bảng Least Significant Difference Test LSD value = 14.82 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= at alpha = 0.050 Ranked Order 66.67 83.33 50.00 45.83 33.33 Mean = 29.17 B Mean = 83.33 A A Mean = 66.67 B C Mean = 50.00 C CD Mean = 45.83 CD DE Mean = 33.33 DE E Mean = 29.17 E Bảng 12 Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS trọng lượng tươi mô sẹo Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình K1 0,54 0,63 0,56 0,58 K2 0,88 0,67 0,73 0,76 K3 0,32 0,21 0,30 0,28 K4 0,23 0,20 0,15 0,19 K5 0,08 0,08 0,09 0,08 K6 0,03 0,06 0,07 0,05 Bảng 13 Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS trọng lượng tươi mô sẹo số liệu Bảng 12 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob Between 1.213 0.243 74.792 0.0000 39 Within 12 0.039 0.003 Total 17 1.252 Coefficient of Variation = 17.59% Bảng 14 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung 2,4 – D kết hợp với kinetin môi trường MS trọng lượng tươi mô sẹo số liệu Bảng 12 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.09744 s_ = 0.03162 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.5800 B Mean = 0.7600 A Mean = 0.7600 A Mean = 0.5800 B Mean = 0.2800 C Mean = 0.2800 C Mean = 0.1900 C Mean = 0.1900 C Mean = 0.08000 D Mean = 0.08000 D Mean = 0.05000 D Mean = 0.05000 D Bảng 15 Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm bổ sung BA kết hợp với NAA môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ mô sẹo Nghiệm thức Lần lặp lại 0,00 0,30 0,50 1,50 0,30 0,10 0,30 0,70 1,20 0,50 C1 C2 C3 C4 C5 Trung bình 0,00 0,10 0,30 1,20 0,50 0,03 0,20 0,50 1,30 0,40 Bảng 16 Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung BA kết hợp với NAA môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ mô sẹo số liệu Bảng 15 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob Between Within 2.800 0.700 10 0.200 0.020 35.000 0.0000 - 40 Total 14 3.000 Coefficient of Variation = 28.28% Bảng 17 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung BA kết hợp với NAA môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ mô sẹo số liệu Bảng 15 Least Significant Difference Test LSD value = 0.2573 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.03000 D Mean = 1.300 A Mean = 0.2300 CD Mean = 0.5000 B Mean = 0.5000 B Mean = 0.4300 BC Mean = 1.300 A Mean = 0.2300 CD Mean = 0.4300 BC Mean = 0.03000 D Bảng 18 Số liệu dùng cho xử lí thống kê thí nghiệm bổ sung BA môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đốt thân chiều dài trung bình chồi Nghiệm Lần lặp lại thức Trung bình Chiều Số Chiều Số Chiều Số Chiều Số dài lượng dài lượng dài lượng dài lượng chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi chồi B1 3,2 6,3 3,1 5,7 2,9 5,3 3,1 5,8 B2 3,0 4,7 2,5 4,7 2,2 6,0 2,6 5,1 B3 2,5 4,0 2,0 3,7 1,7 4,0 2,1 3,9 B4 2,0 4,0 1,7 3,3 1,5 3,0 1,7 3,4 B5 1,5 3,3 1,7 3,0 1,7 3,0 1,6 3,1 B6 1,3 2,3 1,1 1,7 1,3 1,3 1,2 1,8 Bảng 19 Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung BA mơi trường MS chiều cao trung bình chồi số liệu Bảng 18 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob Between 6.725 1.345 18.341 41 0.0000 Within 12 0.880 0.073 Total 17 7.605 Coefficient of Variation = 13.21% Bảng 20 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung BA môi trường MS chiều dài trung bình chồi số liệu Bảng 18 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.4807 s_ = 0.1560 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 3.070 A Mean = 3.070 A Mean = 2.570 B Mean = 2.570 B Mean = 2.070 C Mean = 2.070 C Mean = 1.730 CD Mean = 1.730 CD Mean = 1.630 CD Mean = 1.630 CD Mean = 1.230 D Mean = 1.230 D Bảng 21 Bảng ANOVA thí nghiệm bổ sung BA mơi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đốt thân số liệu Bảng 18 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Mean Squares Square F-value Prob Between Within 12 31.198 6.240 2.787 0.232 26.869 0.0000 Total 17 33.985 Coefficient of Variation = 12.52% Bảng 22 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm bổ sung BA môi trường MS tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đốt thân số liệu Bảng 18 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.8569 s_ = 0.2781 at alpha = 0.050 Original Order Mean = 5.770 A Ranked Order Mean = 5.770 A 42 Mean = 5.130 A Mean = 5.130 A Mean = 3.900 B Mean = 3.900 B Mean = 3.430 B Mean = 3.430 B Mean = 3.100 B Mean = 3.100 B Mean = 1.770 C Mean = 1.770 C 43 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia. .. thích sinh trưởng lên khả phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu sau tuần nuôi cấy Khảo sát khả phát sinh chồi từ mô sẹo khả tạo chồi từ đốt thân cỏ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cỏ (Stevia. .. sản xuất sinh khối thu nhận hợp chất thứ cấp quý có Do đó, đề tài Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mẫu khảo sát phát sinh chồi cỏ (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro tiến hành Các đoạn thân mẫu khử