Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬBài 2: Pha đệm điện diCác loại nồng độ thường được sử dụng trong sinh học phân tử: µgml, mM, µM, UµL…Tính nồng độ các hóa chất trong TBE 1x:Số mol Tris base = 1.08121.14 x 1000 ≈ 8.92 mmolNồng độ mol của Tris base = 8.92(0.1 ) = 89.2 mMSố mol acid boric = 0.5561.83 x 1000 ≈ 8.90 mmolNồng độ mol của acid boric = 8.900.1 = 89 mM Bài 3: Biến nạpGiải thích các bước:STTTiến hànhGiải thích mục đích1Lấy ống tế bào khả biến từ tủ 80oC, đặt vào hộp đá, ủ 510 phút cho hỗn hợp trong ống thành dạng lỏng.Hỗn hợp ở dạng lỏng mới pha trộn được ở các bước tiếp theo.2Để 40µL tế bào khả biến vào ống 1.5mL và bổ sung 2µL plasmid, trộn đều bằng cách đập nhẹ vào thành ống, để trong đá 10 phút.Tăng khả năng gặp nhau của plasmid và các tế bào khả biến.3Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC, ủ 1 phút, nhanh chóng chuyển ngay lại hộp đá để 12 phút Sốc nhiệt cho màng tế bào dãn ra để các plasmid đi vào tế bào4Bổ sung 950 µL LB lỏng, giữ ở trạng thái tĩnh trong 15 phút ở 37oC sau đó lắc trong 30 phút.Để tế bào ổn định lại.5Hút 50 µL dung dịch tế bào cho vào đĩa LB có bổ sung ampicilin, nhanh chóng gạt đều dung dịch tế bào trên mặt thành.Pha loãng dung dịch tế bào khả biến ban đầu 5000 lần, lấy 50 µl trải trên đĩa LB không có ampicilin.Chuyển các đĩa vào tủ ấm nuôi cấy qua đêm.Nuôi cấy vi khuẩn để đánh giá hiệu quả biến nạp. Bài 4: Tách plasmidSTTTiến hànhGiải thích tác dụng1Cho 1.5ml môi trường nuôi cấy qua đêm vào ống eppendorf, ly tâm 10000rpm 5’ – 4oC. Bỏ phần dịch nổi, để cặn tế bào khô.Thu tế bào để làm thí nghiệm2Hòa cặn trong 100µL Sol I → vortex → ủ nhiệt độ phòng 5 phút.Phá vỡ màng tế bào giải phóng các thành phần trong tế bào, EDTA ức chế hoạt động của các kim loại hóa trị II là coenzym của các enzym thủy phân nhờ đó bảo vệ DNA.3Thêm 200µL Sol II → đảo 3 lần, ủ trên đá 3 phút.Sol II có tác dụng tạo pH biến tính DNA sợi đôi thành sợi đơn.Đảo 3 lần để các sợi đôi tách hẳnỦ đá 3 phút để tránh Sol II kết tủa làm đứt gãy plasmid.4Thêm 150 µL Sol III → đảo 5 lần, ủ trên đá 5 phút. Tạo môi trường hồi tính ổn định lại DNA, các DNA plasmid có kích thước nhỏ hơn hồi tính nhanh hơn, còn DNA của vi khuẩn kích thước lớn hồi tính chậm nên kết tủa cùng SDS.5Ly tâm 12000rpm – 4oC – 10 phút → thu dịch trong được 400µL.Cặn là DNA của vi khuẩn nên không thu.6Bổ sung 1 thể tích phenol: chloroform:isoamyl (25:24:1) → vortexKết tủa protein7Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5 phút → thu dịch trong được 300µL.Loại bỏ protein8Thêm 0.6 thể tích isopropanol → đảo 35 lần, ủ nhiệt độ phòng 17 phútKết tủa các chuỗi acid nucleic tỷ trọng cao, các mảnh acid nucleic tỷ trọng thấp không bị kết tủa.9Ly tâm 12000rpm– 4oC – 15 phút → bỏ dịch nổiLoại bỏ các mảnh DNA tỷ trọng thấp trong dịch nổi10Bổ sung EtOH 70% lạnhLoại bỏ NaOH, SDS, CH3COOK 11Ly tâm 12000rpm– 4oC – 5 phút → bỏ dịch nổi, để khô tủa.Bỏ dịch EtOH chứa tạp chấtCác phương pháp tách plasmid khác:Phương pháp đun sôi.Phương pháp dựa vào Lithium. Bài 5: Xác định nồng độ DNAKết quả:NhómNồng độ(ngµL)A260A280A260 A2802.1261252,2525,232,072.2159331,8815,42,072.3218643,7420,852,12.4139327,8613,62,05Nhận xét:Nồng độ DNA cao hơn hai tổ 2.2 và 2.4 nhờ thu được nhiều dung dịch hơn ở bước 7 nhưng tại bước 5 chỉ thu được 400µL dung dịch nên thấp hơn tổ 2.1Tỷ lệ A260 A280 là 2,1, cao nhất trong cả 4 tổ, tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,82,0 là đạt yêu cầu nên kết quả chưa đạt, có thể do DNA bị biến tính, đứt gãy, phân hủy một phần. Bài 6 : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.Để xử lý không hoàn toàn plasmid có thể giảm lượng enzym EcoRI vàhoặc giảm thời gian ủ.Để xử lý hoàn toàn plasmid có thể tăng lượng EcoRI vàhoặc tăng thời gian ủ.Bài 7 : PCR phân đoạn gen đặc hiệu.Vai trò của các thành phần trong phản ứng PCR:Thành phầnVai tròNồng độH2OMôi trường cho phản ứng xảy ra.Đệm 10X(MgCl2 20mM)Cân bằng pH cho hoạt động của enzym Taq polymerase.Ion Mg2+ là cofactor của enzym Taq polymerase.2 mMdNTP (2mM)Gồm 4 loại nucleotide là nguyên liệu để tổng hợp DNA215 mMM13F (10µM)Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào.23 µMM13R (10µM)Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào.23 µMTaq polymerase (2UµL)Xúc tác tổng hợp DNA có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.115 UµLDNA khuônKhuôn tổng hợp sợi bổ sungµgµLTính nồng độ DNA khuôn: Nồng độ DNA ở bài 5 là: 2186 µgµLLấy 3 µL DNA ở bài 5 chuyển sang phản ứng tách plasmid ở bài 6 và lấy sản phẩm pha loãng 2 lần thực hiện phản ứng PCR ở bài 7 nhưng kết quả điện di ở bài 9 cho thấy phản ứng không xảy ra hoàn toàn nên không thể tính chính xác lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR được. Bài 8: MULTIPLEX PCRThành phầnThể tích (µL)Nồng độH2O6Đệm 10X(MgCl2 20mM)1,52 mMdNTP (2mM)1215 mMMồi F1 (10µM)123 µMMồi R1 (10µM)123 µMMồi F2 (10µM)123 µMMồi R2 (10µM)123 µMTaq polymerase (2UµL)0,5115 UµLDNA khuôn2Tổng thể tích 15Tính nồng độ DNA khuôn: tương tự như bài 7 không thể tính chính xác được.Bài 9: Điện di các sản phẩm DNA trên gel AgrasoeThành phần và tác dụng của dye điện di:+ Glycerol : có tỷ trọng lớn kéo sản phẩm DNA xuống giếng nếu không DNA sẽ lơ lửng trên buffer mà không xuống được giếng.+ Chất chỉ thị màu (thường dùng Bromophenol Blue) di chuyển cùng với DNA để ta quan sát được quá trình điện di đã đi đến vị trí nào.+ EDTA: liên kết với các nhóm kim loại hóa trị II để tránh ảnh hưởng đến quá trình điện di, bảo vệ DNA.Thang chuẩn (marker) là một tập hợp các đoạn DNA đã biết trước kích thước do nhà sản xuất cung cấp, có nồng độ đủ cao để thấy được trên gel agarose khi điện di. Tác dụng: ước lượng được kích thước của DNA bằng mắt thường nhờ so sánh với vị trí của băng DNA tương ứng với marker.Bài 10: Phân tích kết quảBài 3 : Biến nạp: Số khuẩn lạc thu được:+ Đĩa có ampicillin: do gạt không đều và phần trung tâm mọc quá dày nên không thể đếm chính xác số lượng khuẩn lạc. Ước tính có khoảng 5000 khuẩn lạc.+ Đĩa không có ampicillin: 819 khuẩn lạc.Hiệu suất biến nạp = 5000(819 ×5000) ×100 ≈ 0,122%.So sánh kết quả biến nạp với các tổ trong nhóm:+ Số khuẩn lạc mọc trong môi trường không có ampicilin lớn nhất nhưng số khuẩn lạc trong môi trường có ampicillin lại ít hơn tổ 1 và tổ 2 có thể do các tổ còn lại để que gạt nóng (trong trường hợp mọc ít) hoặc nhiễm khuẩn đĩa làm vi khuẩn chết.+ Hiệu suất thấp hơn tổ 1 và tổ 2 nhưng do lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường bình thường lớn nên hiệu suất biến nạp như vậy có thể coi là đạt.Ảnh điện di: Bài 4: Tách plasmid.Ảnh điện di có 2 băng, băng đi xa hơn là dạng siêu xoắn của plasmid, băng đi ngắn hơn là các mảnh plasmid bị đứt gãy thành mạch thẳng do plasmid có ở dạng siêu xoắn có kích thước gọn đi được nhanh hơn dạng mạch thẳng bị đứt gãy.Đánh giá kết quả tách plasmid tốt hay không dựa vào băng dạng siêu xoắn phải đậm rõ nét, băng dạng đứt gãy mạch thẳng mờ, ngắn. Kết quả điện di của tổ: băng dạng siêu xoắn khá đậm nhưng băng dạng đứt gãy mạch thẳng cũng đậm và dài có thể do trong quá trình vận chuyển, pha trộn làm đứt gãy plasmid, còn sót lại enzym nuclease cắt plasmid, lẫn các mảnh DNA của vi khuẩn.Các bài 6,7,8 do không có thông tin về marker nên không xác định được kích thước DNA.Bài 6: Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn.Sau khi điện di thu được 2 băng: một băng sắc nét đi xa hơn là DNA dạng vòng, băng còn lại là DNA dạng mạch thẳng.Kết quả như vậy cho thấy phản ứng xử lý không hoàn toàn do vẫn còn plasmid dạng vòng.Bài 7: PCR nhân đoạn gen đặc hiệuMẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm DNA, mẫu kiểm tra lên 1 băng mờ.Kết quả PCR lên băng mờ, không rõ có thể do nồng độ DNA sau phản ứng PCR thấp do DNA khuôn là kết quả từ bài 6 phản ứng xử lý không hoàn toàn, tra mẫu vào giếng không chính xác làm mẫu trôi ra ngoài.Bài 8: Multiplex PCRMẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm khuẩn, mẫu kiểm tra lên 2 băng mờ.Kết quả PCR lên đủ 2 băng cho thấy phản ứng PCR phản ứng tốt với hai cặp mồi nhưng hiệu quả chưa cao do thu được nồng độ DNA nhỏ khiến băng mờ hoặc tra DNA vào giếng chưa chính xác. Bài 9: Điện diSo với các tổ còn lại trong nhóm, tổ có hình ảnh điện di tốt hơn ở chứng âm không lên băng (tổ 2 chứng âm lên băng) và phản ứng PCR đặc hiệu hơn giúp lên băng chính xác (ở các nhóm còn lại multiplex PCR không lên băng, PCR đặc hiệu lên 2 băng có thể do bị nhiễm khuẩn), nhưng băng còn mờ chưa rõ nét và trong tách plasmid chưa xảy ra hoàn toàn.
BÁO CÁO THỰC TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ Bài 2: Pha đệm điện di - Các loại nồng độ thường sử dụng sinh học phân tử: µg/ml, mM, µM, U/µL… - Tính nồng độ hóa chất TBE 1x: Số mol Tris base = x 1000 8.92 mmol Nồng độ mol Tris base = = 89.2 mM Số mol acid boric = x 1000 8.90 mmol Nồng độ mol acid boric = = 89 mM Bài 3: Biến nạp Giải thích bước: ST T Tiến hành Giải thích mục đích Lấy ống tế bào khả biến từ tủ -80oC, đặt vào hộp đá, ủ 5-10 phút cho hỗn hợp ống thành dạng lỏng Để 40µL tế bào khả biến vào ống 1.5mL bổ sung 2µL plasmid, trộn cách đập nhẹ vào thành ống, để đá 10 phút Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC, ủ phút, nhanh chóng chuyển lại hộp đá để 1-2 phút Bổ sung 950 µL LB lỏng, giữ trạng thái tĩnh 15 phút 37oC sau lắc 30 phút Hút 50 µL dung dịch tế bào cho vào đĩa LB có bổ sung ampicilin, nhanh chóng gạt dung dịch tế bào mặt thành Pha loãng dung dịch tế bào khả biến ban đầu 5000 lần, lấy 50 µl trải đĩa LB khơng có ampicilin Chuyển đĩa vào tủ ấm nuôi cấy qua đêm Hỗn hợp dạng lỏng pha trộn bước Tăng khả gặp plasmid tế bào khả biến Sốc nhiệt cho màng tế bào dãn để plasmid vào tế bào Để tế bào ổn định lại Nuôi cấy vi khuẩn để đánh giá hiệu biến nạp Bài 4: Tách plasmid ST Tiến hành T Cho 1.5ml môi trường nuôi cấy qua đêm vào ống eppendorf, ly tâm 10000rpm- 5’ – 4oC Bỏ phần dịch nổi, để cặn tế bào khơ Hòa cặn 100µL Sol I → vortex → ủ nhiệt độ phòng phút Giải thích tác dụng Thu tế bào để làm thí nghiệm Phá vỡ màng tế bào giải phóng thành phần tế bào, EDTA ức chế hoạt động kim loại hóa trị II coenzym enzym thủy phân nhờ bảo vệ DNA Thêm 200µL Sol II → đảo - Sol II có tác dụng tạo pH biến lần, ủ đá phút tính DNA sợi đơi thành sợi đơn - Đảo lần để sợi đôi tách hẳn - Ủ đá phút để tránh Sol II kết tủa làm đứt gãy plasmid Thêm 150 µL Sol III → đảo Tạo mơi trường hồi tính ổn định lại lần, ủ đá phút DNA, DNA plasmid có kích thước nhỏ hồi tính nhanh hơn, DNA vi khuẩn kích thước lớn hồi tính chậm nên kết tủa SDS o Ly tâm 12000rpm – C – 10 Cặn DNA vi khuẩn nên khơng phút → thu dịch thu 400µL Bổ sung thể tích phenol: Kết tủa protein chloroform:isoamyl (25:24:1) → vortex Ly tâm 12000rpm– 4oC – Loại bỏ protein phút → thu dịch 300µL Thêm 0.6 thể tích isopropanol → đảo 3-5 lần, ủ nhiệt độ phòng 17 phút Ly tâm 12000rpm– 4oC – 15 phút → bỏ dịch 10 Bổ sung EtOH 70% lạnh 11 Ly tâm 12000rpm– 4oC – phút → bỏ dịch nổi, để khô tủa Kết tủa chuỗi acid nucleic tỷ trọng cao, mảnh acid nucleic tỷ trọng thấp không bị kết tủa Loại bỏ mảnh DNA tỷ trọng thấp dịch Loại bỏ NaOH, SDS, CH3COOK Bỏ dịch EtOH chứa tạp chất Các phương pháp tách plasmid khác: - Phương pháp đun sôi - Phương pháp dựa vào Lithium Bài 5: Xác định nồng độ DNA Kết quả: Nhóm 2.1 2.2 2.3 2.4 Nồng độ (ng/µL) 2612 1593 2186 1393 A260 A280 A260/ A280 52,25 31,88 43,74 27,86 25,23 15,4 20,85 13,6 2,07 2,07 2,1 2,05 Nhận xét: Nồng độ DNA cao hai tổ 2.2 2.4 nhờ thu nhiều dung dịch bước bước thu 400µL dung dịch nên thấp tổ 2.1 Tỷ lệ A260/ A280 2,1, cao tổ, tỷ lệ nằm khoảng 1,82,0 đạt yêu cầu nên kết chưa đạt, DNA bị biến tính, đứt gãy, phân hủy phần Bài : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn Để xử lý không hồn tồn plasmid giảm lượng enzym EcoRI và/hoặc giảm thời gian ủ Để xử lý hoàn toàn plasmid tăng lượng EcoRI và/hoặc tăng thời gian ủ Bài : PCR phân đoạn gen đặc hiệu - Vai trò thành phần phản ứng PCR: Thành phần H2O Đệm 10X (MgCl2 20mM) dNTP (2mM) M13F (10µM) M13R (10µM) Taq polymerase (2U/µL) DNA khn Vai trò Môi trường cho phản ứng xảy Cân pH cho hoạt động enzym Taq polymerase Ion Mg2+ cofactor enzym Taq polymerase Gồm loại nucleotide nguyên liệu để tổng hợp DNA Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào Gắn vào sợi DNA khuôn để enzym Taq polymerase bám vào Xúc tác tổng hợp DNA hoạt động nhiệt độ cao Khuôn tổng hợp sợi bổ sung Nồng độ mM 2/15 mM 2/3 µM 2/3 µM 1/15 U/µL µg/µL Tính nồng độ DNA khn: Nồng độ DNA là: 2186 µg/µL Lấy µL DNA chuyển sang phản ứng tách plasmid lấy sản phẩm pha loãng lần thực phản ứng PCR kết điện di cho thấy phản ứng không xảy hồn tồn nên khơng thể tính xác lượng DNA khuôn cho phản ứng PCR Bài 8: MULTIPLEX PCR Thành phần H2O Đệm 10X (MgCl2 20mM) dNTP (2mM) Mồi F1 (10µM) Mồi R1 (10µM) Mồi F2 (10µM) Mồi R2 (10µM) Taq polymerase (2U/µL) DNA khn Tổng thể tích Thể tích (µL) Nồng độ 1,5 mM 1 1 0,5 2/15 mM 2/3 µM 2/3 µM 2/3 µM 2/3 µM 1/15 U/µL 15 Tính nồng độ DNA khn: tương tự - khơng thể tính xác Bài 9: Điện di sản phẩm DNA gel Agrasoe - Thành phần tác dụng dye điện di: + Glycerol : có tỷ trọng lớn kéo sản phẩm DNA xuống giếng không DNA lơ lửng buffer mà không xuống giếng + Chất thị màu (thường dùng Bromophenol Blue) di chuyển với DNA để ta quan sát trình điện di đến vị trí + EDTA: liên kết với nhóm kim loại hóa trị II để tránh ảnh hưởng đến trình điện di, bảo vệ DNA - Thang chuẩn (marker) tập hợp đoạn DNA biết trước kích thước nhà sản xuất cung cấp, có nồng độ đủ cao để thấy gel agarose điện di Tác dụng: ước lượng kích thước DNA mắt thường nhờ so sánh với vị trí băng DNA tương ứng với marker Bài 10: Phân tích kết Bài : Biến nạp: - Số khuẩn lạc thu được: + Đĩa có ampicillin: gạt không phần trung tâm mọc q dày nên khơng thể đếm xác số lượng khuẩn lạc Ước tính có khoảng 5000 khuẩn lạc + Đĩa khơng có ampicillin: 819 khuẩn lạc - Hiệu suất biến nạp = 0,122% - So sánh kết biến nạp với tổ nhóm: + Số khuẩn lạc mọc mơi trường khơng có ampicilin lớn số khuẩn lạc mơi trường có ampicillin lại tổ tổ tổ lại để que gạt nóng (trong trường hợp mọc ít) nhiễm khuẩn đĩa làm vi khuẩn chết + Hiệu suất thấp tổ tổ lượng khuẩn lạc mọc mơi trường bình thường lớn nên hiệu suất biến nạp coi đạt Ảnh điện di: Bài 4: Tách plasmid - Ảnh điện di có băng, băng xa dạng siêu xoắn plasmid, băng ngắn mảnh plasmid bị đứt gãy thành mạch thẳng plasmid có dạng siêu xoắn có kích thước gọn nhanh dạng mạch thẳng bị đứt gãy - Đánh giá kết tách plasmid tốt hay không dựa vào băng dạng siêu xoắn phải đậm rõ nét, băng dạng đứt gãy mạch thẳng mờ, ngắn Kết điện di tổ: băng dạng siêu xoắn đậm băng dạng đứt gãy mạch thẳng đậm dài trình vận chuyển, pha trộn làm đứt gãy plasmid, sót lại enzym nuclease cắt plasmid, lẫn mảnh DNA vi khuẩn Các 6,7,8 khơng có thơng tin marker nên khơng xác định kích thước DNA Bài 6: Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn - Sau điện di thu băng: băng sắc nét xa DNA dạng vòng, băng lại DNA dạng mạch thẳng - Kết cho thấy phản ứng xử lý khơng hồn tồn plasmid dạng vòng Bài 7: PCR nhân đoạn gen đặc hiệu - Mẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm DNA, mẫu kiểm tra lên băng mờ - Kết PCR lên băng mờ, không rõ nồng độ DNA sau phản ứng PCR thấp DNA khuôn kết từ phản ứng xử lý khơng hồn tồn, tra mẫu vào giếng khơng xác làm mẫu trơi ngồi Bài 8: Multiplex PCR - Mẫu đối chứng âm không lên băng chứng tỏ không bị nhiễm khuẩn, mẫu kiểm tra lên băng mờ - Kết PCR lên đủ băng cho thấy phản ứng PCR phản ứng tốt với hai cặp mồi hiệu chưa cao thu nồng độ DNA nhỏ khiến băng mờ tra DNA vào giếng chưa xác Bài 9: Điện di So với tổ lại nhóm, tổ có hình ảnh điện di tốt chứng âm không lên băng (tổ chứng âm lên băng) phản ứng PCR đặc hiệu giúp lên băng xác (ở nhóm lại multiplex PCR không lên băng, PCR đặc hiệu lên băng bị nhiễm khuẩn), băng mờ chưa rõ nét tách plasmid chưa xảy hoàn toàn 10 ... bào giải phóng thành phần tế bào, EDTA ức chế hoạt động kim loại hóa trị II coenzym enzym thủy phân nhờ bảo vệ DNA Thêm 200µL Sol II → đảo - Sol II có tác dụng tạo pH biến lần, ủ đá phút tính... A280 2,1, cao tổ, tỷ lệ nằm khoảng 1,82,0 đạt yêu cầu nên kết chưa đạt, DNA bị biến tính, đứt gãy, phân hủy phần Bài : Xử lý plasmid với enzym cắt giới hạn Để xử lý khơng hồn tồn plasmid giảm lượng... và/hoặc giảm thời gian ủ Để xử lý hồn tồn plasmid tăng lượng EcoRI và/hoặc tăng thời gian ủ Bài : PCR phân đoạn gen đặc hiệu - Vai trò thành phần phản ứng PCR: Thành phần H2O Đệm 10X (MgCl2 20mM) dNTP