i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ TRANG SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học tnu.edu.vn/ liệu ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết trình bày luận văn trung thực, đồng ý cán hướng dẫn chưa cơng bố Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Hoàng Thị Trang Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt q trình tơi tiến hành nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Thanh Trà tạo điều kiệ ệm Tơi x Hồng Phú Hiệp thầy, cô Bộ môn Di truyền Sinh học đại, trường Đại học Sư phạm – Đại học Th i Nguyên tạo điều kiện cho tơi q trình tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phòng thí nghiệm Tơi xin tỏ lòng biết ơn tới thầy cô cán khoa Khoa học sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tận tình dạy dỗ, bảo truyền cho niềm đam mê nghiên cứu khoa học Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp nhiệt tình động viên cho tơi thêm động lực hồn thành tốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Trang Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT DANH TẮT vi viii MỤ DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 1.1.1 Cây đậu tương 1.1.2 Đặc điểm hóa sinh đậu tương 1.2 BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 10 1.2.1 Bệnh gỉ sắt 10 1.2.2 Tính chống chịu bệnh tương 12 sắt Số hóa Trung tâm Học liệu gỉ đậu http://www.lrctnu.edu.vn/ tương đậu 1.2.3 .13 đậu tương 1.3 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 17 1.3.1 Chỉ thị hình 17 thái 18 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ 1.3.3.Chỉ thị phân tử 18 1.3.4 Bản đồ QTL 23 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Vật liệu 25 2.1.2 Hóa chất 26 2.1.3 Thiết bị địa điểm nghiên cứu 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu tách chiết DNA tổng số 27 2.2.2 Tuyển chọn tổng hợp cặp mồi SSR cho phân tích mẫu 28 2.2.3 Phản ứng PCR-SSR 30 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 31 2.2.5 Phương pháp phân tích xử lý liệu PCRSSR .31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR 32 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương .32 3.1.2 Kết .33 ằng phản ứng PCR- SSR ỀN CỦA CÁC GIỐ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrctnu.edu.vn/ TƯƠNG KHÁNG BỆ 41 44 KẾT LUẬ 49 Kết luận 49 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Two dimentional electrophoresis - điện di hai chiều ABC ATP - binding cassette AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa dạng chiều dài phân đoạn nhân ASM Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7carboxylic acid S-methyl ester AVRDC Asian Vegetable Research Devlopment Center - Trung tâm phát triển rau màu Châu Á, Đài Loan AUDPC Area Under Disease Progress Curve Bp Base pair cs Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid ĐVT Đơn vị tính EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid EtBr Ethidium bromide FAO Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lương giới ISSR Inter - Simple Sequence Repeat kb Kilo base MAS Marker Assisted Selection – Chỉ thị phân tử PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi tr ùng hợp polymerase QTL Quantitative Trait Loci - Bản đồ locus kiểm sốt tính trạng số lượng RAPD Random Amplified Polymorphism DNA - DNA đa hình nhân ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - đa hình chiều dài Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrctnu.edu.vn/ phân đoạn cắt hạn chế Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ vii SDS Sodium Đoecyl Sulphat SNP Single nucleotide polymorphism SSR Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn giản STSs Sequence Tagged Site TAE Tris – Acetate – EDTA Tris Trioxymetylaminometan XK Xuất USDA Kỳ United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa UPGMA Phương pháp phân nhóm Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ kháng bệnh sắt để đáp ứng cầu ngày cao sản xuất công nghiệp làm thực phẩm cho người, lấy dầu làm thức ăn cho chăn nuôi KẾT LUẬN VÀ Kết luận 1.1 Kết nhân phân đoạn DNA phản ứng PCR-SSR với cặp mồi thu 40 phân đoạn từ hệ gen 12 giống đậu tương khả kháng bệnh gỉ sắt Sct187, Satt431, Satt460 thị SSR (Satt009, Sat_640, tính đa hình 1.2 S giống đậu tương Khoảng cách di truyền c 60% Hai giống DT2000 DT96 kháng bệnh gỉ sắt tốt hệ số tương đồng d Đ thuộc nhóm kháng bệnh gỉ sắt trung ệ số tương đồ 100% Đề nghị 2.1 2.2 Có thể sử dụng giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt xuất làm nguyên liệu lai tạo giống sản 2.3 Có thể sử dụng thơng tin đa dạng di truyền mức DNA làm sở cho việc lai tạo giống, nhiên cần mở rộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật SSR với số lượng mồi giống nghiên cứu nhiều TÀI LIỆU THAM KHẢO T Nguyễn Thị Bình (1990) Nghiên cứu đánh giá khả chống chịu bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi sydow) tập đoàn đậu tương Miền Bắc Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T, Bùi Chí Bửu Bùi Bá Bổng (2001), “Chọn giống nhờ Marker Phân tích QTL”, Viện lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long, tr 44 – 58 Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương Nxb Nông Nghiệp Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2009), “Đánh giá đa dạng di truyền mức độ phân tử số giống đậu tương (Glycine max (L) Merrill) địa phương”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Đại học Thái Nguyên Nguyễn Đăng Khôi (1997), "Các đậu ăn hạt Việt Nam", Tạp chí Sinh học,19:5-10 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Hà Nội Chu Hồng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng Nxb Đại học Thái Nguyên Đinh Thị Ngọc (2008), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn số giống đậu tương địa phương trồng vùng Tây Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên 10 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vignaradiata (L) Wilczek) Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 11 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên 12 Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Nguyễn Văn Thắng, Trần Văn Dương (2003),“Đánh giá tính đa dạng số giống lạc tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt kỹ thuật RAPD” Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 805-809 13 Nguyễn Đức Thuận Nguyễn Thị Lang (2006) “Đánh giá đa dạng di truyền đậu tương phương pháp RAPD marker phân tử”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, kỳ tháng 3/2006: 65-68, 87 14 Vũ Thanh Trà Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương có phản ứng khác với bệnh gỉ sắt thị SSR”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thôn, kỳ tháng 11/2006: 3032, 43 15 Vũ Thanh Trà, Trần Thị chất lượng hạt số giống đậu tương Việt Nam có khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ tháng 10/2006: 33-37 16 Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phương Đoài, Nguyễn Thúy Điệp, Trần Thị Thúy (2010) “Nghiên cứu xác định thị chép có trình tự đơn giản (Marker SSR) nhận dạng số giống lúa Nếp, lúa Nương địa Việt Nam”, T ông nghiệp P ôn, số 153, tr 15-21 17 Vũ Thanh Trà (2012), Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương có khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Sư Phạm-ĐHTN 18 Lê Thị Ngọc Vi Nguyễn Thị Lang (2006) “Nghiên cứu gen kháng bệnh gỉ sắt đậu tương phương pháp phân tử microsatellite”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 9/2006: 36-39 19 Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh (2008), "Đánh giá đa hình DNA số giống khoai tây (Solanumtuberosum L.) kỹ thuật RAPD", Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, số tháng 1/ 2008: 20 -25 T 20 Akkaya M S., Bhagwat A A., & Cregan P B (1992), “Length polymorphism of simple sequence repeat DNA in soybean”, Genetic 132:1131-1139 21 Abe J., Xu H., Suzuki Y., Kanazawa A , & Shimamoto Y (2003), “Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs”, Theor Appl Gener 106: 445-453 22 Brown-Guedira, J.A Thompsonb, R.L Nelsoncand M.L Warburton (2000), “Evaluation of Genetic Diversity of Soybean Introductions and North American Ancestors Using RAPD and SSR Markers”, Crop Science 40:815823 23 Bates L S (1973), “Rapid determinatin of tree protein for water-stress studies”, Plant and Soil, 39, pp 205-207 24 Chen T.H., Murant N (2002), “Enhancement of tolerance of a family of plant dehydrin proteins”, Physiol Plant, pp 795-803 25 Cregan P B., Javik T., Bush A L., Shoemaker R C., Lark K G., Kahler A L., Kaya N., Van Toai T T., Lohnes D G., Chung J.,&Specht J E (1999), “An integrated genetic linkage map of the soybean genome”, Crop Sci.39: 1464-1490 26 Hartman GL, Wang TC & Tschanz AT (1991) “Soybean rust development and the quantitative relationship between rust severity and soybean yield”, Plant Dis 75:596-600 27 Kashi, Y and D G King (2006) “Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolutio”, TRENDS in Genetic 22 (5), 253259 28 Litt M., & Luty J A.(1989), “A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiae muscle actin gene”, Am J.Hum Genet.44(3): 397 -401 29 Lawson, M J and L Zhang (2006), “Distinct pattern of SSR distribution in the Arabidopsis thaliana and rice genome”, Genome Biology (2): R14 30 Morgante, M., M Hanafey, W Powell (2002) “Microsatellites are preferentially asscociated with non repetitive DNA in plant genomes”, Nature Genetic 30, 194-200 31 McCouch, S R., L Teytelman, Y Xu, K B Lobos(2002) “Development and mapping of 2240 new SSR maker for rice (Oryzae sativa L.)”, DNA Research 9, 199-207 32 Nuntapunt M, Surin P & Achavasmit P (1984), “Evaluation of ratereducing rust resistance and tolerance in advanced soybean lines”, Journal of Agriculture Research and Extension (Thailand) 2:15-19 33 Garcia A., Calvo E S., Kiihl R A S., Harada A., Hiromoto D , & Vieira L G (2008), “Molecular Mapping of Soybean Rust (Phakopsora pachyrhizi) Resistance Genes: Discovery of a Novel Locus and Alleles”, Biomedical and Life Sciences 117(4): 545- 553 34 Perez, M A, F.J.Gallego, I.Martinez, P Hidalgo (2001) “Detection, distribution and selection ofmicrosatellites (SSRs) in the genome of yeast Saccharomyces cerevisiae as molecular markers”, mApplied microbiology 33, 461-466 35 Tschanz AT & Tsai BY (1982) “Effect of maturity on soybean rust development”, Soybean Rust Newsl 5:38-4 36 Tschanz AT & Tsai MC (1983) “Evidence of tolerance to soybean rust in soy beans”, Soybean Rust Newsl 6:28-31 37 Tschanz AT & Wang TC (1980) “Soybean rust development and apparent infection rates at five locations in Taiwan”, Prot Ecol 2:247-250 38.Tschanz AT, Wang TC, Cheng YH, Montha N & Chen CM (1985) “International screening trials for soybean rust tolerance”, Soybean Rust Newsl 7:22-25 104 39 Sholihin, & Hautea D M (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map Bioteknologi in Pertanian, 7(1-2): 1761 mungbean using AFLP markers”, Jurnal 40 Silva D C G, Yamanaka N., Brogin R L., Arias C A A., Nepomuceno A L., Mauro A D., Pereira S S., Nogueira L M., Passianotto A L L., & Abdelnoor R V (2008), “Molecula mapping of two loci that confer resistance to Asian rust in soybean.Theor”, Appl Genet 117:57-63 41 Verma D P S., & Shoemaker R C (1996), “Soybean, genetics, molecular biology and biotechnology”, Cab International, pp 37-40 42 Welsh J., & McClelland M (1990), “Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers”, Nucleic Acids Res 18: 72137218 43 Wang K J., & Takahata Y (2007), “A preliminary comparative evaluation of genetic diversity between Chinese and Japanese wild soybean (Glycine soja) germplasm pools using SSR markers”, Genetic Resources and Crop Evolution 44 Yorinori J T., Paiva W M., Frederick R D., Costamilan L M , Bertagnoli P F., Hartman G L., Godoy C V., & Nunes J J.(2005), “Epidemics of soybean rust (Phakopsora pachyrhizi) in Brazil and Paraguay from 2001 to 2003”, Plant Dis.89: 675677 45 Zhou S.,Sauve R., &Thannhauser T W.(2009), “Proteome changes induced by aluminium stress in tomato roots”, JExp Bot.60: 1849- 1857 46 http://soybase.org/ 47 http://www.ca.uky.edu/agcollege/plantpathology/extension/soybean_rust/ pics.html Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrctnu.edu.vn/ 48 http://www.exetersoft ware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html 49 https://www.ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/44233/Fanglin_Lu.pdf ?sequence=1 Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ 50 http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/444627/1/id1291.pdf Số hóa Trung tâm Học liệu tnu.edu.vn/ ... phân tích tính đa dạng di truyền số giống đậu tương có khả kháng bệnh gỉ sắt khác nhau Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá mức độ đa dạng di truyền số giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt khác thị SSR. .. 1.2.1 Bệnh gỉ sắt 10 1.2.2 Tính chống chịu bệnh tương 12 sắt Số hóa Trung tâm Học liệu gỉ đậu http://www.lrctnu.edu.vn/ tương đậu 1.2.3 .13 đậu tương 1.3 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN... ứng khác bệnh gỉ sắt ý nghĩa việc bảo tồn giống có khả kháng bệnh mà có ý nghĩa quan trọng cơng tác chọn tạo giống có chất lượng cao Xuất phát từ lý lựa chọn thực đề tài: Sử dụng thị SSR để phân