BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1211100167 : LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Lưu Đại Kim Phượng i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ Cám ơn bố mẹ khơng quản khó khăn ni dưỡng ngày, dạy cho điều hay lẽ phải Bố mẹ chỗ dựa vững con, nguồn động viên to lớn cho vấp ngã động lực để tiếp tục phấn đấu công việc sống Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn tồn thể q Thầy Cơ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, tồn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập trường Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hương – Trường môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, người đáng kính, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp thông tin kiến thức thật hữu ích cho em suốt q trình thực đồ án Em xin cảm ơn Thầy Cơ phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm đồ án Xin chân thành cảm ơn bạn học lớp 12DSH gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ đóng góp ý kiến cho em suốt bốn năm đại học Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp TP.HCM, tháng năm 2016 SVTH: Lưu Đại Kim Phượng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH x MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu .2 2.1 Ngoài nước 2.2 Trong nước 3 Mục tiêu nghiên cứu .3 Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .4 6.1 Phương pháp luận 6.2 Phương pháp xử lý số liệu Kết đạt đề tài Kết cấu đồ án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm .6 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật 1.1.3.2 Tác hại nấm gây cho thực vật 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc thực phẩm 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1 Giới thiệu chung 1.2.1.2 Khái niệm 10 1.2.1.3 Đặc tính chung 12 1.2.1.4 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu 14 1.2.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 24 1.2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 24 1.2.2.2 Qúa trình trao đổi chất 26 1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 31 1.2.3 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 32 1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R Fennema et al 2004) 32 1.2.3.2 Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R Fennema et al 2004) 33 1.2.3.3 Định danh vi sinh vật theo phương pháp đại 37 1.2.4 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic .38 1.2.4.1 Sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic 38 1.2.4.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 40 1.2.5 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 40 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Địa điểm nghiên cứu 46 2.2 Thời gian thực 46 2.3 Vật liệu 46 2.3.1 Thiết bị dụng cụ 46 2.3.2 Hóa chất 46 2.3.3 Giống nấm .50 2.4 Phương pháp luận 50 2.5 Phương pháp thí nghiệm 53 Đồ án tốt nghiệp 2.5.1 Thu thập mẫu 53 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 53 2.5.2.1 Tăng sinh 53 2.5.2.2 Phân lập 53 2.5.3 Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic 55 2.5.3.1 Nhuộm Gram 55 Kết quả: 55 2.5.3.2 Nhuộm bào tử 55 2.5.3.3 Thử nghiệm Catalase 56 2.5.3.4 Thử nghiệm khả sinh acid 56 2.5.3.5 Thử nghiệm khả di động 57 2.5.3.6 Thử nghiệm khả lên men đường khả sinh khí 57 2.6 Xác định hàm lượng acid tổng 58 2.7 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng Lactobacillus sp với nấm bệnh .59 2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic bảo quản hạt 63 2.8.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 63 2.8.2 Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm 65 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66 3.1 Kết phân lập 66 3.2 Định danh chủng phân lập 68 3.2.1 Thử nghiệm Catalase 68 3.2.2 Nhuộm Gram 69 3.2.3 Thử nghiệm khả di động phương pháp thạch mềm 76 3.2.4 Nhuộm bào tử 77 3.2.5 Thử nghiệm kiểm tra khả lên men đường khả sinh khí 79 3.3 Xác định Hàm lượng acid tổng 83 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic phương pháp khuếch tán 86 3.5 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn phân lập bảo quản hạt .92 3.5.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng 92 3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng sản phẩm: 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT FDA Fructose-bisphosphate aldolase ATP Adenosin triphosphat LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales DNA Deoxyribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic acid MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar DMSO Dimethyl sulfoxide Bacillus sb Bacillus subtilis E coli Escherichia coli vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus 14 Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler Weiss, 1986) 17 Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus 19 Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc 22 Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus 23 Bảng 1.6 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 42 Bảng 1.7 Phân lập vi khuẩn lactic với khả ức chế độc tố sinh trưởng nấm mốc nấm men 43 Bảng 1.8 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel cộng sự, 1995) 44 Bảng 2.1: Kí hiệu nguồn phân lập 53 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu chủng vi khuẩn phân lập 68 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc kính hiển vi x4 hình thái vi khuẩn kính hiển vi x100 73 Bảng 3.3: Kết thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 81 Bảng 3.4: %Acid lactic 17 chủng vi khuẩn phân lập 83 Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả sinh acid giá trị OD chủng phân lập từ Nem chua 84 Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả sinh acid giá trị OD chủng phân lập từ Cơm mẻ 85 Bảng 3.7: Phân nhóm chủng vi khuẩn lactic 85 Bảng 3.8: Tổng khả kháng nấm chủng vi khuẩn 89 Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả kháng nấm chủng phân lập từ Nem chua 90 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả kháng nấm chủng phân lập từ Cơm mẻ 91 Bảng 3.11: Kí hiệu thành phần thí nghiệm 92 Bảng 3.12: Khả kháng nấm Nghiệm thức – Canh trường nuôi cấy Nghiệm thức – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng đậu phộng 93 Bảng 3.13: Kết kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliform 97 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D Xử lí số liệu theo phần mềm SAS 9.1 Tỉ lệ kháng nhóm VK Lactic phân lập từ Nem chua vớ i nấm: DN3: VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels DN3 12 Values LN1-5 LN2-12 LN2-17 LN2-19 LN2-2 LN2-3 LN2-5 LN2-7 LN3-2 LN3-5 LN3-7 LN4-2 Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Model 11 Squares 114.5545333 Mean Square F Value Pr > F 10.4140485 5.16 0.000 Error 24 48.4678667 Corrected Total 35 163.0224000 R-Square 0.702692 Source DF DN3 11 Coeff Var Root MSE 10.41854 1.421089 Anova SS 114.5545333 16 2.019494 VONGUCCHE Mean 13.64000 Mean Square F Value Pr > F 10.4140485 5.16 0.000 Đồ án tốt nghiệp VONG UC CHE NAM DN3 15:01 Thursday, August 2, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 24 2.019494 2.06390 Least Signifcant Difference 2.3948 Means with the same letter are not signifcantly different t Grouping Mean A N DN3 15.833 LN4-2 15.610 LN1-5 15.223 LN2-2 15.057 LN217 14.957 LN3-2 14.337 LN2-7 14.167 LN2-5 13.000 LN219 A A A B A B A B A B A B A B A B A C B A C A C B D B D B D E C D E C C 17 Đồ án tốt nghiệp F D E F D E F D E F E F E C 12.110 LN3-7 11.777 LN3-5 11.110 LN2-12 F F 10.500 LN2-3 Tiến hành chạy phần mền SAS 9.1 với chủng nấm lại CĐP1, CĐP2, ĐN2, HCP2 Tỉ lệ kháng nhóm VK Lactic phân lập từ Cơm m ẻ vớ i nấm: CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 37 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CDP1 Values LC1-1 LC3-3 LC3-4 LC6-5 LC7-7 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 38 The ANOVA Procedure Dependent Variable: VONGUCCHE Sum of Source DF Model Squares 58.58802667 Mean Square F Value Pr > F 14.64700667 6.15 0.009 Error 10 23.81893333 Corrected Total 14 82.40696000 R-Square Coeff Var 18 Root MSE 2.3818933 VONGUCCHE Mean 0.710960 Đồ án tốt nghiệp 12.41224 19 1.543338 12.43400 Đồ án tốt nghiệp Source DF CDP1 Anova SS 58.58802667 Mean Square F Value Pr > F 14.64700667 6.15 0.009 VONG UC CHE NAM CDP1 15:01 Thursday, August 2, 2016 39 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 2.381893 Critical Value of t 2.22814 Least Signifcant Difference 2.8077 Means with the same letter are not signifcantly different t Grouping Mean N CDP1 A 15.947 LC1-1 B 12.833 LC3-3 11.780 LC3-4 11.610 LC7-7 10.000 LC6-5 B C B C B C B C C Tiến hành chạy phần mền SAS 9.1 với chủng nấm lại CĐP2, ĐN2, ĐN3, HCP2 20 Đồ án tốt nghiệp %Acid lactic 17 chủng vi khuẩn lactic từ nguồn phân lập Nem chua HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CHUNGVIKHUAN 12 LN1-5 LN2-12 LN2-17 LN2-19 LN2-2 LN2-3 LN2-5 LN2-7 LN3-2 LN3-5 LN3-7 LN4-2 Number of Observations Read 36 Number of Observations Used 36 HAM LUONG ACID LACTIC 19:54 Thursday, August 2, 2016 10 The ANOVA Procedure Dependent Variable: ACIDLACTIC Sum of Source DF Model 11 Squares Mean Square 10.17026325 0.92456939 Error 24 0.07038900 Corrected Total 35 10.24065225 R-Square 0.993127 Source DF CHUNGVIKHUAN 11 Coeff Var Root MSE 5.158945 0.054156 Anova SS 10.17026325 HAM LUONG ACID LACTIC F Value 315.24 F Pr > F F Pr > F