BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SPP PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG ĐỂ KÉO DÀI THỜI GIAN BẢO QUẢN BÁNH MÌ Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS Huỳnh Phương Quyên TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thái Thiên Dung MSSV: 1311100223 Lớp: 13DSH01 TP.Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Học viên thực luận văn Nguyễn Thái Thiên Dung LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô trường Đại học Công Nghệ TP HCM nhiệt tình dạy dỡ, trùn đạt kiến thức cũng niềm đam mê nghiên cứu khoa học cho sinh viên suốt thời gian học tập Để hoàn thành đồ án “Sử dụng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống để kéo dài thời gian bảo quản bánh mì” suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức em gặp phải khơng lần khó khăn nhơ có quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình ThS Huỳnh Phương Quyên TS Nguyễn Hồi Hương, Giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, kiến thức kỹ cần thiết Cơ trùn dạy mà em đạt thành ngày hôm Em xin chân thành cảm ơn Cô Em xin cảm ơn Thầy, Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe Cám ơn bạn đại học khóa 2013 – 2017 em khóa 2015 – 2019 trường Đại học Cơng nghệ TP HCM, bên cạnh giúp đỡ suốt trình làm đồ án tại truờng Cuối cùng, từ tận đáy lòng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình ln dành tình u thương cho con, ủng hộ, động viên tạo niềm tin để vững bước đường chọn TP.HCM, ngày 05 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực đồ án Nguyễn Thái Thiên Dung Đ án tốt nghiệ p MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục tiêu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Kết đạt đề tài Kết cấu đồ án Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu chung .5 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 1.1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 1.1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men – trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 10 1.1.2 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic 12 1.1.2.1 Quá trình trao đổi chất 12 1.1.2.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 13 1.1.3 Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 14 1.2 Tổng quan nấm mốc 15 1.2.1 Đặc điểm 16 1.2.2 Độc tố nấm tiết 16 1.2.3 Tác hại nấm 17 i Đ án tốt nghiệ p 1.2.4 1.3 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm 17 Tổng quan cơng nghệ sản xuất bánh mì 18 1.3.1 Giới thiệu chung 18 1.3.2 Quy trình làm bánh mì 19 1.3.3 Ảnh hưởng vi sinh vật đến việc bảo quản bánh mì 23 1.3.4 Vai trò nấm men lên men bánh mì 24 1.4 Tổng quan bột chua 25 1.4.1 Đặc tính bột chua 25 1.4.2 Các loại hợp chất hương liệu bột chua 26 1.4.3 Ảnh hưởng phản ứng Maillard Caramel hóa hương vị bánh mì 27 1.4.4 Con đường trao đổi chất vi khuẩn LAB bột chua 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Địa điểm nghiên cứu 31 2.2 Thời gian thực 31 2.3 Vật liệu nghiên cứu 31 2.3.1 Giống vi sinh vật 31 2.3.2 Hố chất mơi trường sử dụng 31 2.3.2.1 Hoá chất 31 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy 31 2.4 Thiết bị dụng cụ 32 2.4.1 Thiết bị 32 2.4.2 Dụng cụ 32 2.5 Phương pháp luận 32 2.6 Phương pháp nghiên cứu 33 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.6.2 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp 34 2.6.2.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh lý, sinh hóa 34 2.6.2.2 Khả sinh acid 37 ii Đ án tốt nghiệ p 2.6.2.4 Khảo sát khả kháng nấm A.niger Lactobacillus spp in vitro 38 2.6.3 Xây dựng đường chuẩn 41 2.6.3.1 Lactobacillus spp 41 2.6.3.2 Nấm mốc Aspergillus niger 44 2.6.4 Khảo sát khả đối kháng nấm A.niger đồng lên men bánh mì vi khuẩn LAB với nấm men 47 2.6.5 Khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 50 2.6.5.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bở sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 mật độ khác 50 2.6.5.2 Khảo sát mức độ ưa thích màu sắc, độ xốp, mùi vị bánh mì có bở sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường bánh mì có chất bảo quản 52 2.6.5.3 Độ nở bánh mì 54 2.6.5.4 Độ ẩm bánh mì 54 3.1 Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp 55 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào; khảo sát sinh lý, sinh hóa 55 3.1.2 Khả sinh acid 56 3.1.3 Khảo sát khả kháng nấm A.niger Lactobacillus spp in vitro 57 3.2 Xây dựng đường chuẩn 59 3.2.1 Lactobacillus spp 59 3.2.2 Nấm mốc Aspergillus niger 59 3.3 Khảo sát khả đối kháng nấm A.niger vi khuẩn LAB đồng lên men bánh mì với nấm men 60 3.4 Khảo sát ảnh hưởng LAB lên chất lượng bánh mì 63 3.4.1 Đánh giá cảm quan 63 3.4.1.1 Khảo sát mức độ ưa thích sản phẩm bánh mì có bở sung vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 & Lactobacillus sp.C1 mật độ khác 63 Đ án tốt nghiệ p 3.4.1.2 Khảo sát mức độ ưa thích màu sắc, độ xốp, mùi vị bánh mì có bở sung vi khuẩn lactic với bánh mì thường bánh mì có chất bảo quản 66 3.4.2 Đánh giá độ nở 68 3.4.3 Đánh giá độ ẩm 71 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 Kết luận 74 Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Tài liệu tiếng Việt 76 Tài liệu tiếng Anh 77 PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƯỜNG PHỤ LỤC BẢNG MÃ HÓA MẪU THỬ CẢM QUAN .3 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỤ LỤC HÌNH 11 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 18 Đ án tốt nghiệ p DANH MỤC VIẾT TẮT - VSV: Vi sinh vật - LAB: Lactic acid bacteria/Lactobacillales - MRS agar: de Man, Rogosa, Sharpe Agar - MRS broth: de Man, Rogosa, Sharpe Broth - PDA: Potato Dextrose Agar - PDB: Potato Dextrose Broth - SAS: Statistical Analysis Systems Đ án tốt nghiệ p DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 15 Bảng 2.1: Bảng thiết kế thí nghiệm khảo sát khả kháng nấm bánh mì 48 Bảng 3.1: Khảo sát đặc điểm hình thái sinh lý vi khuẩn Lactobacillus spp 55 Bảng 3.2: Độ acid (% TA) chủng Lactobacillus spp 57 Bảng 3.3: Tỉ lệ ức chế vi khuẩn Lactobacillus spp với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 57 Bảng 3.4: Kết mật độ Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 60 Bảng 3.5: Bảng tính mật độ nấm mốc để cảm nhiễm 61 Bảng 3.6: Bảng mật độ / khối lượng cần bổ sung 61 Bảng 3.7: Kết đối kháng nấm mẫu 62 Bảng 3.8: Mức độ ưa thích mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 64 Bảng 3.9: Mức độ ưa thích mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.C1 64 Bảng 3.10: Kết đánh giá cảm quan mức độ ưa thích về tiêu màu sắc, độ xốp, mùi, vị mẫu bánh mì 66 Bảng 3.11: Đánh giá chung về mức độ ưa thích mẫu bánh mì 67 Bảng 3.12: Kết thay đổi chiều cao bề ngang mẫu bánh mì BML5 69 Bảng 3.13: Kết thay đổi chiều cao bề ngang mẫu bánh mì BMC1 69 Bảng 3.14: Kết thay đổi chiều cao bề ngang mẫu bánh mì 70 Bảng 3.15: Đánh giá độ ẩm mẫu bánh mì bổ sung Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 72 Bảng 3.16: Đánh giá độ ẩm mẫu bánh mì vừa nướng xong sau ngày bảo quản 72 Đ án tốt nghiệ p DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Lactobacillus .7 Hình 1.2: Tế bào nấm Aspergillus niger 16 Hình 1.3: Bánh mì thành phẩm 18 Hình 1.4: Quy trình làm bánh mì 20 Hình 1.5: Các đường lên men dị hình bột chua điển hình vi khuẩn sinh acid lactic (được chuyển thể từ Liu người khác năm 2008) 30 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu đề tài 33 Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát đặc điểm sinh lí, sinh hố chủng Lactobacillus spp 34 Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khả sinh acid chủng Lactobacillus spp 37 Hình 2.5: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 39 Hình 2.6: Mơ tả cách đo đường kính vòng ức chế phương pháp vạch đường vi khuẩn 41 Hình 2.7: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn chủng Lactobacillus spp 42 Hình 2.8: Sơ đồ quy trình dựng đường chuẩn nấm mốc A.niger 44 Hình 2.9: Vùng đếm hồng cầu 45 Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thí nghiệm khảo sát khả kháng nấm bánh mì 47 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc MRS agar 56 Hình 3.2: Kết nhuộm Gram 56 Hình 3.3: Đồ thị khảo sát khả kháng nấm A.niger Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 58 Hình 3.4: Đối kháng nấm Aspergillus niger 58 Hình 3.5: Đường chuẩn củng vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 Lactobacillus sp.C1 59 vii Chiều cao DO NO SAU NUONG CAO The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 DO NO SAU NUONG CAO The ANOVA Procedure Dependent Variable: DONO Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Mo del Err 10 or Co Tot 14 rre al 0 R-Square Coeff Var Root MSE DONO Mean 0.941614 6.796419 0.085635 1.260000 Source DF MAU DO NO SAU NUONG CAO Anova SS Mean Square F Value Pr > F 1.18266667 0.29566667 40.32 F MAU 0.39 0.6927 DO AM BML5 SAU NUONG The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 2.563833 Critical Value of Studentized Range 4.33917 Minimum Significant Difference 4.0114 Means with the same letter are not significantly different Tu Gr ke ou A A A A A Lactobacillus sp.C1 MN e M AU B ML B ML B ML DO AM BMC1 SAU NUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9 Number of Observations Read Number of Observations Used DO AM BMC1 SAU NUONG The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOAM Source Mo del Err or Co Tot rre al DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 4 20 R- Co Root D MSE Sq eff O 0.4 2.006957 08 So DF A F Pr urc n > MA 16 2.0 U 07 20 DO AM BMC1 SAU NUONG The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 4.027878 Critical Value of Studentized Range 4.33917 Minimum Significant Difference 5.0279 Means with the same letter are not significantly different Tu Gr ke ou A A A A A Các mẫu bánh mì MN e M AU B M B M B M DO AM SAU KHI NUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 DO AM SAU KHI NUONG Dependet Variabl n Sourc DF Su of e m Sq Mo del Err 10 or Co Tot 14 12 rre al The ANOVA Procedure M F Pr > F ea Va 40.0215 R- Co Root D MSE Sq eff O 0.6 2.098290 52 So DF A F Pr urc n > MA 82 4.0 U 70 02 DO AM SAU KHI NUONG The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for DOAM Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square Number of Means 18 4.37277 Critical Range 3.587 3.764 3.875 3.952 4.009 4.051 4.084 4.110 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping A A B A B A B A B A B A B A B A C B A C B A C B C B C B C B C C C N M AU 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M 23 B M Độ ẩm sau ngày bảo quản Lactobacillus sp.L5 LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BML5-10 BML5-8 BML5-9 Number of Observations Read Number of Observations Used LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOAM So urc Mo del Err or Co Tot rre al DF Su M m ea 15 8 Pr > 01 R- Co Root D MSE Sq eff O 0.7 0.804301 31 So DF A F Pr urc n > MA 10 8.0 U 19 01 LUONG DO AM BML5 GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of Studentized Range Minimum Significant Difference 0.05 0.6469 4.33917 2.015 Means with the same letter are not significantly different Tu Gr ke ou A A B A B B Mean NM AU 4.13 B 93 ML 3.33 B 83 ML 1.53 B 96 ML Lactobacillus sp.C1 LUONG DO AM BMC1 GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BMC1-10 BMC1-8 BMC1-9 Number of Observations Read Number of Observations Used LUONG DO AM BMC1 GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: DOAM Source Mo del Err or Co Tot rre al DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 9 2 00 R- Co Root D MSE Sq eff O 0.8 0.631368 92 So DF A F Pr urc n > MA 19 20 .7 GIAM 4.00SAU BAY NGAY LUONG DOUAM BMC1 The ANOVA Procedure Tukey's Studentized Range (HSD) Test for DOAM Note: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II error rate than REGWQ Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.01 0.398625 Critical Value of Studentized Range 6.33032 Minimum Significant Difference 2.3075 Means with the same letter are not significantly different Tu Gr ke ou A MN e M AU B M A B M C1 B B M A Các mẫu bánh mì LUONG DO AM GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU BMC1 BMCa BML5 BMNa BMTL Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 LUONG DO AM GIAM SAU BAY NGAY The ANOVA Procedure De D pe Source O DF Su M F Pr m ea Va > Model4 25 < 00 Error10 0 Correc Tot 14 ted al R-Square Coeff Var Root MSE DOAM Mean 0.915310 9.308147 Source DF 0.456684 4.906286 Anova SS Mean Square F Value Pr > F MAU 22.54079324 5.63519831 27.02