BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Hoàng Quân Sinh viên thực MSSV: 1311100026 : Nguyễn Thị Thanh Hằng Lớp: 13DSH01 TP Hồ Chí Minh, năm 2017 LƠI CẢM ƠN Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện hỗ trợ trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt gửi lời cám ơn đến tất thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm tạo điều kiện tốt dạy bảo truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hồn thành khóa học cùa Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM ThS Nguyễn Hoàng Quân tận tình hướng dẫn bảo kiến thức cho em suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn toàn thể anh chị làm việc Trung tâm bạn sinh viên làm đề tài Trung tâm giúp đỡ em suốt trình làm đề tài Con xin cám ơn ba mẹ có cơng sinh thành nuôi dưỡng khôn lớn Cám ơn anh chị em người thân gia đình bạn bè bên cạnh giúp đỡ cổ vũ tinh thần cho em Em xin chân thành cảm ơn Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2017 Sinh viện thực Nguyễn Thị Thanh Hằng MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Ý nghĩa đề tài .1 Đôi tương va pham vi nghiên cưu Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Kết đạt Bố cục đồ án .3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Các giai đoạn quy trình nhân giống in vitro 1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ thực vật .9 1.2 Giới thiệu chi Stachys .17 1.3 Giới thiệu sùng thảo (Stachys affinis) 19 1.3.1 Phân loại .19 1.3.2 Đặc điểm sinh học công dụng 19 1.3.4 Thành phần hóa học .21 1.3.5 Giá trị dinh dưỡng 22 1.4 Một số nghiên cứu chi Stachys 23 1.4.1 Kháng viêm giảm đau 24 1.4.2 Chống oxy hóa .24 1.4.3 Chống lo âu 25 1.4.4 Kháng khuẩn .26 1.5 Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys 27 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 29 2.2 Vật liệu phương pháp 29 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 29 2.2.3 Môi trường nghiên cứu .30 2.2.4 Điều kiện phòng ni cấy 30 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 30 2.3 Nội dung nghiên cứu 30 2.4 Phương pháp nghiên cứu .31 2.4.1 Pha môi trường nuôi cấy 31 2.4.2 Các thao tác phòng cấy 32 2.4.3 Bố trí thí nghiệm 32 2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả nhân chồi từ đoạn thân sùng thảo 32 2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng IBA đến trình tạo rễ sùng thảo .33 2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng gía thể đến sinh trưởng sùng thảo vườn ươm 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả nhân chồi từ đoạn thân sùng thảo 37 3.2 Ảnh hưởng IBA đến trình tạo rễ sùng thảo 42 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Tài liệu Tiếng Việt 53 Tài liệu Tiếng Anh 53 PHỤ LỤC Phu luc A: Thành phần môi trường MS Phụ lục B: Quy trình nhân giống sùng thảo (Stachys affinis) Phụ lục C: Bảng số liệu xử lí thống kệ phần mềm SAS 9.4 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây sùng thảo 19 Hình 1.2 Củ sùng thảo 20 Hình 3.1 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả nhân chồi từ đoạn thân sùng thảo sau tuần nuôi cấy .39 Hình 3.2 Ảnh hưởng IBA đến trình rễ sùng thảo sau tuần nuôi cấy 46 Hình 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng .51 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nồng độ thời gian sử dụng số chất khử trùng 10 Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả nhân chồi .33 Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng IBA đến trình tạo rễ 34 Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm 35 Bảng 3.1 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả nhân chồi từ đoạn thân sùng thảo sau tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến trình tạo rễ sùng thảo sau tuần nuôi cấy 43 Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng .48 ii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau tuần nuôi cấy .39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả nhân chồi từ đoạn thân sùng thảo sau tuần nuôi cấy .39 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng IBA đến trình tạo rễ sùng thảo sau tuần nuôi cấy .44 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau tuần trồng .49 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T Trichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid BA Benzyl Adenine CNSH Công Nghệ Sinh Học ĐC Đối chứng GA Gibberellin IAA 3-Indole acetic acid IBA 3-Indole butyric acid MS Murashige – Skoog NAA Napthalene Acetic Acid PhG Phenylpropanoid Glycosides TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam có tiềm lớn tài nguyên dược liệu, số 12.000 loài thực vật Việt Nam có gần 4.000 lồi có cơng dụng làm thuốc với vùng phân bố rộng khắp nước, có nhiều loài dược liệu xếp vào loài quý giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thơng đỏ, Vàng đắng, Hồng liên rơ, Hồng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết điều tra đánh giá số vùng, trồng dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn loại lương thực, thực phẩm (có thể thu nhập 100 triệu đồng/ha) Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 dược liệu loại, Việt Nam tự cung cấp khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ việc sản xuất thuốc nước, khoảng 80 - 85% phải nhập từ nước (chủ yếu nhập từ Trung Quốc) có 1.400 dược liệu nhập có nguồn gốc rõ ràng, so với nhu cầu sử dụng dược liệu Cây sùng thảo loại trồng làm thực phẩm nhiều nơi giới Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp… Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe Các phận chiết xuất từ sùng thảo sử dụng phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao viêm phổi Trung Quốc Các nghiên cứu loài chi nhiều nghiên cứu thành phần hóa học Stachys affinnis chứng minh chúng chứa nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều cơng dụng kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,… Nắm bắt sở khoa học thực tiễn nhu cầu thị trường, nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro sùng thảo (Stachys affinnis) Ý nghĩa đề tài Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A 3.1633 NT2 B 2.3067 NT1 C 1.6333 NT3 D 0.2100 DC d Chiều cao chồi CHIEU CAO CHOI THE ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC A0 A1 A2 A3 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 CHIEU CAO CHOI THE ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAOCHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 9.79136667 3.26378889 Error 0.23820000 0.02977500 Corrected Total 11 10.02956667 109.62 Pr > F F F F NTHUC 112.4428267 28.1107067 23.89 F 54.21 F F 69.09 F F 0.0001 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUCAOCAY Mean 0.882742 6.112110 0.313348 5.126667 Source NTHUC DF Anova SS Mean Square F Value 7.39166667 1.84791667 18.82 CHIEU CAO CAY The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.098187 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 0.8108 Pr > F 0.0001 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N NTHUC 6.1767 NT3 A 5.5733 NT2 C 5.0967 NT1 4.6000 NT4 4.1867 DC A B B B C D C D D Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng sùng thảo giai đoạn vườn ươm a Tỷ lệ sống TY LE SONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC NT1 NT2 NT3 Number of Observations Read Number of Observations Used TY LE SONG The ANOVA Procedure Dependent Variable: TYLESONG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 10509.02782 5254.51391 Error 138.49907 23.08318 Corrected Total 10647.52689 227.63 Pr > F F 5254.51391 227.63 F 232.72 F 5398.65608 F Model 113.5809556 56.7904778 0.0001 Error 5.8890000 0.9815000 Corrected Total 119.4699556 57.86 R-Square Coeff Var Root MSE SOLA Mean 0.950707 5.124640 0.990707 19.33222 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 113.5809556 56.7904778 57.86 0.0001 SO LA The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SOLA Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.9815 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 2.999 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A 23.5467 C2 B 19.5933 C3 C 14.8567 C1 d Chiều cao CHIEU CAO CAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC C1 C2 C3 Number of Observations Read Number of Observations Used CHIEU CAO CAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUCAOCAY Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7.94302222 3.97151111 0.0004 Error 0.65180000 0.10863333 Corrected Total 8.59482222 36.56 R-Square Coeff Var Root MSE SOLA Mean 0.924164 4.938174 0.329596 6.674444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 7.94302222 3.97151111 36.56 0.0004 CHIEU CAO CAY The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUCAOCAY Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.108633 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 0.9977 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A 7.8033 C2 B 6.7167 C3 C 5.5033 C1 Đô an tôt nghiêp 20 Đô an tôt nghiêp 21 ... lục B: Quy trình nhân giống sùng thảo (Stachys affinis) Phụ lục C: Bảng số liệu xử lí thống kệ phần mềm SAS 9.4 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây sùng thảo 19 Hình 1.2 Củ sùng thảo ... quy trình nhân giống in vitro Cho tới việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro áp dụng cho nhiều loại trồng (trên 400 loài) Giáo sư Murashige (1974) chia quy trình nhân giống in vitro làm... nhiều khó khăn việc đưa in vitro trồng tự nhiên Như vậy, bốn giai đoạn quy trình nhân giống in vitro có vai trò định đến khả ứng dụng thành cơng quy trình nhân giống in vitro vào thực tiễn Tuy