BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÚY NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA CURCUMIN GIẢI PHÓNG TỪ MÀNG BACTERIAL CELLULOSE NẠP THUỐC DÙNG QUA DA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phúc Hưng HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Phúc Hưng, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn tới TS Nguyễn Xuân Thành thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, thầy cô Viện Nghiên cứu khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành luận văn Một lần em xin cảm ơn giúp đỡ thầy cô, cảm ơn gia đình tồn thể bạn, người thân, bên động viên, giúp đỡ khích lệ em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thúy LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn thực hướng dẫn TS Nguyễn Phúc Hưng Kết nghiên cứu không chép khơng trùng với luận văn Những trích dẫn, kết nghiên cứu có luận văn lấy từ cơng bố thức có ghi rõ ràng Nếu sai tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thúy MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu 4.Vật liệu phạm vi nghiên cứu 5.Phương pháp nghiên cứu Dự kiến đóng góp đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacterial Cellulose (bc) 1.1.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.2 Cấu trúc BC 1.1.3 Tính chất BC 1.1.4 Các ứng dụng BC Y học 1.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu giải phóng thuốc qua da 10 1.2 Thuốc Curcumin 13 1.2.1 Công thức 13 1.2.2 Một số tính chất hóa lý curcumin 14 1.2.3 Hoạt tính sinh học curcumin 15 1.2.4 Tính khả dụng sinh học curcumin 16 1.2.5 Dược động học curcumin 17 1.2.6 Tình hình nghiên cứu cur giới Việt Nam 19 1.3 Phương pháp HPLC 21 1.4.1 Khái niệm 21 1.4.2 Đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học in vivo 22 1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 25 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 25 2.1.3 Thỏ 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Thiết kế thí nghiệm 26 2.2.2 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu 27 2.2.3 Các điều kiện phân tích 28 2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 Xây dựng quy trình phân tích curcumin huyết tương thỏ 34 3.1.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 34 3.1.2 Xử lý mẫu phân tích 34 3.2 Thẩm định quy trình phân tích curcumin huyết tương thỏ 35 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính phương pháp định lượng 37 3.2.4 Xác định độ lặp lại phương pháp 41 3.2.5 Xác định độ phương pháp xây dựng 42 3.2.7 Quy trình phân tíchcurcumin huyết tương thỏ 44 3.3 Áp dụng quy trình phân tích lượng curcumin huyết tương thỏ 44 3.3.1 Định lượng Curcumin huyết tương thỏ sau dán BC nạp thuốc bôi dung dịch cur 44 3.3.2 Các thông số dược động học cur 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 55 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Acetobacter xylinum A xylinum AUC Diện tch đường cong nồng độ- thời gian BC Bacterial cellulose Cl Độ thải Cmax Nồng độ cực đại HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao LLOQ Giơí hạn dịnh lượng LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình RSD Độ lệch chuẩn tương đối rpm Vòng/ phút SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng T1/2 Thời gian bán thải Tmax Thời gian nồng độ cực đại Vd Thể tích phân bố DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các thơng số hố lý thành phần curcuminoid 15 Bảng 3.1 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống 38 Bảng 3.2 Tương quan nồng độ diện tích píc chuẩn Curcumin 40 Bảng 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tch píc chuẩn Curcumin 41 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 42 Bảng 3.5 Nồng độ Curcumin huyết tương thỏ sau dán BC nạp thuốc 44 Bảng 3.6 Nồng độ Curcumin huyết tương thỏ sau bôi dung dịch cur 45 Bảng 3.7 Các thông số dược động học thỏ sau đắp BC – cur bôi cur 47 Bảng 3.8 Các thông số dược động học sau đắp BC – cur bôi cur 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Cellulose vi khuẩn(x 20 000 lần) Hình 1.2 Cellulose thực vật(x 200 lần) Hình 1.3 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng 11 Hình 1.4 Cấu trúc thành phần curcuminoid [10] 14 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích píc chuẩn Curcumin 40 Hình 3.2 Đường cong nồng độ thuốc theo thời gian huyết tương thỏ sau đắp BC Cur bôi Cur 46 Bảng 3.7 Các thông số dược động học thỏ sau đắp BC – cur bơi cur Cmax(µg/ml) Tmax (h) Thử Đối chiếu Thử TB 0.2019 0.0360 1.5 ±SD ±0.0933 ±0.0044 ±0 ±0.7071 ±0.2688 ±0.0486 STT Đối chiếu AUC0-24(µg.giờ/ml) AUC0-∞(µg.h/ml) Thử Đối chiếu Thử 0.9763 0.1048 1.0477 Đối chiếu 0.1887 ±0.2819 ±0.1326 Bảng 3.8 Các thông số dược động học sau đắp BC – cur bôi cur STT λz(1/h) AUMC0-∞(µg.giờ ) MRT(h) Thử Đối chiếu Thử Đối chiếu Thử Đối chiếu TB 0.1065 0.1540 10.8560 4.0564 9.9419 7.0586 ±SD ±0.0067 ±0.0607 ±2.3560 ±1.5448 ±0.4068 ±3.5855 So sánh sinh khả dụng tương đối chế phẩm thử đối chiếu Theo công thứ phần 2.2.4.7 0.9763 S x100%= K0 931% D t n g1 đ ố0 i = KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thực tồn q trình nghiên cứu, mục têu luận văn giải rút kết luận sau:  Đánh giá sinh khả dụng in vivo cur giải phóng từ màng BC – cur dùng qua da, so sánh với liều đối chiếu 78,737 mg  Màng BC- cur có khả giải phóng kéo dài  Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng cur huyết tương thỏ với giới hạn định lượng phù hợp; khoảng tuyến tính; độ độ lặp lại đạt yêu cầu phương pháp định lượng sinh học; hiệu suất trình xử lý cao Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sinh khả dụng in vivo màng BC – cur với số lượng mẫu lớn định hướng bào chế loại thuốc dùng qua da TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr 1429-1433 [2] Bộ y tế (2006), Dược lâm sàng, Nhà xuất y học, tr 24-35 [3] Đinh Văn Bình, Nguyễn Xuân Trạch Nguyễn Thị Tú, (2007) Giáo trình chăn nuôi dê thỏ, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, trang 74 – 81 [4] Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly, “Chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longa) xây dựng liệu chuẩn curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu”, tạp chí dược học 8/2011 [5] Vũ Thị Huỳnh Hân, “Nghiên cứu bào chế thuốc dán thấm qua da scopolamine 1,5 mg”, Luận án tiến sĩ dược học, đại học y dược Thành phố Hồ Chí Minh [6] Phạm Thị Minh Huệ, Bùi Văn Thuấn, Đặng Việt Hùng, “Nghiên cứu bào chế phytosome curcumin”, Tạp chí dược họcSố: 467 - Tháng 3/2015 Trang 14-18 [7] Tạ Mạnh Hùng (2006), Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học viên ® nang Cefaclor Stada 250 sản xuất Việt Nam, Luận văn thạc sĩ Dược học, Trường đại học Dược Hà Nội [8] Nguyễn Thị Kim Ngoan, Đinh Thị Kim Nhung (2016), “Ảnh hưởng điều kiện mơi trường tới q trình tạo màng BC từ tảo xoắn Spirulina”,Kỉ yếu hội thảo nghiên cứu khoa học sinh viên cán trẻ trường đại học sư phạm toàn quốc [9] Đinh thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, “Trần Như Quỳnh, Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trị bỏng”,tạp chí Khoa học Công nghệ 50(4) (2012) 453-462 [10] Giang Thị Sơn cộng sự, “Nghiên cứu thành phần hóa học tách curcumin từ củ nghệ miền Bắc (curcuma longa L.)”, trường đại học dược Hà Nội [11] Bùi Thanh Tùng, Phan Kế Sơn, Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Thanh Hải, “Curcumin PEG hóa triển vọng ứng dụng”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Y Dược, Tập 32, Số (2016) 1-11 [12] Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ acetobactor xylinum”, đề tài cấp bộ, Bộ Y tế - Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh [13] Trân Anh Vũ, Lê Quan Nghiệm, Nguyễn Thị Chung, “Nghiên cứu xây dựng công thức quy trình bào chế kem thuốc từ dương cam cúc di thực nghệ”, Tạp chí Dược học số 6/2009 (số 398) trang 15-18 Tài liệu tiếng anh [14] A Asai and T Miyazawa, "Occurrence of orally administered curcuminoid asglucuronide and glucuronide/sulfate conjugates in rat plasma," Life Sci, vol 67,pp.2785-93,2000 [15] Alejandra Margarita Arévalo Gallegos, Sonia Herrera Carrera, Roberto Parra,Tajalli Keshavarz,b and Hafiz M N Iqbal , Bacterial Cellulose: A Sustainable Source to Develop Value-Added Products – A Review, peerreviewed review artcle [16] Almeida I.F et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatbility study”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutcs, 86(3), 332-336 [17].Amin MCIM et al.(2012), “Synthesis and characterization of thermo and pH-responsive bacterial cellulose/acrylic acid hydrogels for drug delivery” Carbohydr Polym ,88,465–473 [18] Amita H Patel L and Riddhi M Dave (2015), “Formulation anh evaluation of sustained release in situ ophthalmic gel of neomycin sulphate”, Bulletn of Pharmaceutical Research;5(1):1-5 [19] Armando JD et al (2014),”Do bacterial cellulose membranes have potential in drug-delivery systems”, Expert Opin [20] Bhavana V et al.(2016) , Study on the drug loading and release potential of bacterial cellulose, Cellulose Chem Technol, 50 (2), 219223 [21] Blanchard C et al (2015), “Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Actvity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC,02083-15 [22] Choi Y et al.(2004), “Preparation and characterization of acrylic acidtreated bacterial cellulose cation-exchange membrane”, J Chem Technol Biotechnol, 79,79–84 [23] C Ireson, S Orr, D J Jones, R Verschoyle, C K Lim, J L Luo, L Howells,S Plummer, R Jukes, M Williams, W P Steward, and A Gescher,"Characterization of metabolites of the chemopreventve agent curcumin inhuman and rat hepatocytes and in the rat in vivo, and evaluation of their abilityto inhibit phorbol ester-induced prostaglandin E2 production," Cancer Res, vol.61,pp.1058-64,2001 [24] Czaja W., Young D.J., Kawecki M., Browm R.M (2007) “The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications” [25] Commitee for proprietary medicinal products – CPMP (2001), Note for guidance on the investigation of biovailability and bioequivalence, p.3-4 [26] C R Ireson, D J Jones, S Orr, M W Coughtrie, D J Boocock, M L Williams, P B Farmer, W P Steward, and A J Gescher, "Metabolism of thecancer chemopreventive agent curcumin in human and rat intestine," CancerEpidem Biomar, vol 11, pp 105-11, 2002 [27].D Suresh and K Srinivasan, "Tissue distribution & elimination of capsaicin, piperine & curcumin following oral intake in rats," Indian J Med Res, vol.131,pp.682-91,2010 [28] Food and Durg Administration (FDA)- CDER- CVM (2001), Guidance for industry bioanlytcal method validation, p 4-7 [29] Food and Durg Administration industry-bioavailability and CDER (2000), bioequivalence Guidance studies for for orally administered durg product- general consideration, p.3-4 [30] G Garcea, D J Jones, R Singh, A R Dennison, P B Farmer, R A Sharma,W P Steward, A J Gescher, and D P Berry, "Detection of curcumin anditsmetabolites in hepatic tissue and portal blood of patients following oraladministration,"BrJCancer,vol.90,pp.1011-5,2004 [31] G Shoba, D Joy, T Joseph, M Majeed, R Rajendran, and P S Srinivas,"Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals andhuman volunteers," Planta Med, vol 64, pp 353-6, 1998 [32] H Moghim; B Shahmir; Afshin Zarghi ; Enhancement of percutaneous absorption of curcumin (turmeric pigment) by ethanol ; Article 21, Volume 3, Supplement 2, Autumn 2004, Page 8-9 [33] K Maiti, K Mukherjee, A Gantait, B P Saha, and P K Mukherjee, "Curcumin-phospholipid complex: Preparation, therapeutic evaluaton andpharmacokinetic study in rats," Int J Pharm, vol 330, pp 155-63, 2007 [34] K Y Yang, L C Lin, T Y Tseng, S C Wang, and T H Tsai, "Oral bioavailability of curcumin in rat and the herbal analysis from Curcuma longaby LC-MS/MS," J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, vol 853, pp.183-9,2007 [35] Luan J et al (2012), “Impregnaton of silver sulfadiazine into bacterial cellulose for antimicrobial and biocompatible wound dressing”, Biomed Mater, 7, ID 065006 [36] Janusz Blasiak, Andrzej Trzeciak, Ewa Malecka-Panas, Józef Drzewoski, Teresa Iwanienko, Irena Szumiel, and Maria Wojewodzka, DNA Damage and Repair in Human Lymphocytes and Gastric Mucosa Cells Exposed to Chromium and Curcumin, Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 19:19-31 (1999) [37] J Kucinska-Lipka, I Gubanska, H Janik, Bacterial cellulose in the field of wound healing and regenerative medicine ofskin: recent trends and future prospectives, Polym Bull (2015) 72:2399-2419 [38] M H Pan, T M Huang, and J K Lin, "Biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice," Drug Metab Dispos, vol 27,pp.486-94,1999 [39] Muhammad MA et al (2014), “A review of bacterial cellulose-based drug delivery systems:their biochemistry, current approaches and future prospects”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 66, pp 1047–1061 [40] Pandey M et al (2012), “Accelerated preparation of novel bacterial cellulose/acrylamide-based hydrogel by microwave irradiation”, Int J PolymMater, 62, 402–405 [41] Pinto R.J.B et al (2009), “Antbacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279 – 2289 [42] Ramona-Daniela Pavaloiu et al (2014), “Controlled release of amoxicillin from bacterial cellulose membranes”,Cent Eur J Chem, 12(9),962-967 [43] Satshbabu B K, Shurtinag R., Sandeep V R (2010), “Formulation and evaluation of floating drug delivery system of famotidine”, Indian J Pharm Sci, 72(6), 738 – 744 [44] Silva N.H.C.S et al (2014), “Topical cafeine delivery using biocellulose membranes: a potential innovative system for cellulite treatment”, Cellulose, 21, 665- 674 [45].Silva N.H.C.S et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as transdermal delivery systems for diclofenac: in vitro dissolution and permeation studies”, Carbohydr Polym, 106, 264-269 [46] Siu-Wan Ip, “Induction of apoptotc death by curcumin in human tongue squamous cell carcinoma SCC-4 cell is mediated through endoplasmic reticulum stress and mitochondria-dependent pathways”, cell Biochem Funt 2011; 29: 641-650 [47] Suk Fun Chin, K.Swaminathan Iyer, Martin Saunders, Tim G.St.Pierre, Craig Buckley, Mark Paskevicius, and Colin L.Raston, “Encapsulation and Sustained Release of Curcumin using Superparamagnetic Silica Reservoirs” [48] Trovatti E et al (2011), “Biocellulose membranes as supports for dermal release of lidocaine”, Biomacromolecules,12,4162 - 4168 [49] V Ravindranath and N Chandrasekhara, "Metabolism of curcumin— studieswith [3H] curcumin," Toxicology, vol 22, pp 337-44, 1981 [50] Wei B et al (2011), “ Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym , 84, 533–538 PHỤ LỤC 1.Một số hình ảnh làm thí nghiệm thỏ Hình ảnh làm máy HPLC Sắc kí đồ ... Bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sinh khả dụng invivo curcumin giải phóng từ màng Bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da Nhiệm vụ nghiên cứu - Làm... Kim - Dụng cụ khác như: tẩm cồn, ống chứa herparin… Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu sinh khả dụng invivo curcumin giải phóng từ màng Bacterial cellulose nạp thuốc dùng qua da Địa điểm nghiên cứu. .. tế curcumin đạt 2-3 % [16] Màng BC có khả thay đổi khả giải phóng, chưa có đề tài nghiên cứu hệ BC nạp curcumin nên chọn đề tài: Nghiên cứu sinh khả dụng invivo curcumin giải phóng từ màng Bacterial