BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA CURCUMIN GIẢI PHÓNG TỪ MÀNG BACTERIAL CELLULOSE NẠP THUỐC QUA ĐƯỜNG UỐNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phúc Hưng HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Phúc Hưng, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy TS Nguyễn Xuân Thành, thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN thầy cô Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học chuyển giao công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện thuận lợi nhất, cảm ơn gia đình tồn thể bạn, người thân, bên động viên, giúp đỡ khích lệ em hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Tuyết MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Vật liệu phạm vi nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacterial cellulose (BC) 1.1.1 Cấu trúc màng Bacterial cellulose 1.1.2 Tính chất lý hóa màng S – BC 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành màng BC 1.1.4 Ứng dụng màng BC 1.2 Thuốc curcumin 10 1.2.1 Giới thiệu chung thuốc 10 1.2.2 Tính chất hóa lý curcuminoid 12 1.2.3 Hoạt tính sinh học 13 1.2.4 Hạn chế curcumin 16 1.2.5 Sinh khả dụng curcumin 17 1.2.6 Chống định 18 1.2.7 Tác dụng phụ: 18 1.3 Thuốc tác dụng kéo dài 19 1.4 Phương pháp HPLC 19 1.5 Nghiên cứu in vivo 21 1.6 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Thỏ 28 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 29 2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp bào chế BC-Cur dạng uống 31 2.2.2 Xác định lượng thuốc hấp thu vào màng 32 2.2.3 Chuẩn bị 33 2.2.4 Thiết kế thí nghiệm 34 2.2.5 Phương pháp lấy mẫu 35 2.2.6 Định lượng curcumin huyết tương phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao ( HPLC) 37 2.2.7 Phương pháp xử lý thống kê 42 2.3 Các thông số đánh giá SKD in vivo 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Xác định liều thử liều đối chiếu 46 3.2 Xây dựng quy trình phân tích curcumin huyết tương thỏ 46 3.3 Thẩm định quy trình phân tích curcumin huyết tương thỏ 47 3.3.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký 47 3.3.2 Tính đặc hiệu phương pháp 48 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính phương pháp định lượng 50 3.3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 53 3.3.5 Xác định độ lặp lại phương pháp 53 3.3.6 Xác định độ phương pháp xây dựng 55 3.4 Áp dụng quy trình phân tích lượng curcumin huyết tương thỏ56 3.5 Tính thơng số dược động học BC - Curcumin Curcumin nguyên chất 58 KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 75 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A xylinum Acetobacter xylinum BC Bacterial cellulose CNM Cao nấm men Cur Curcumin cs cộng ĐHSP Đại học Sư phạm FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ HPLC Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao OD Mật độ quang phổ Nxb Nhà xuất TDKD Tác dụng kéo dài rpm Tốc độ quay 100 vòng/phút DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến suất sản xuất màng BC Bảng 2.1 Khối lượng thể giai đoạn tuổi 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 54 Bảng 3.5 Nồng độ Curcumin huyết tương sau uống thuốc thử 57 Bảng 3.6 Nồng độ Curcumin huyết tương sau uống thuốc đối chứng 58 Bảng 3.7 Các thông số dược động học thỏ sau uống BC – cur uống curcumin nguyên chất 58 Bảng 3.8 Các thông số dược động học sau uống BC – cur uống cur nguyên chất 59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cellulose thực vật BC Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo curcumin 11 Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceto-enol curcumin 13 Hình 2.1 Sơ đồ trình xử lý màng BC 32 Hình 2.2 Sơ đồ trình xử lý màng BC 36 Hình 2.3 Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương trắng 36 Hình 2.4 Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương sau dùng chế phẩm chứa curcumin37 Hình 2.5 DTDĐC đồ thị nồng độ máu 43 Hình 2.6 DTDĐC theo quy tắc hình thang 43 Hình 2.7 Đồ thị nồng độ máu chế phẩm A B 44 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích píc chuẩn Curcumin 53 Hình 3.2 Đường cong nồng độ thuốc theo thời gian nhóm thỏ thí nghiệm 57 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Curcumin chất quý có củ nghệ vàng, curcumin y học công nhận có nhiều tác dụng, chống oxy hóa, giải độc bảo vệ gan, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ngăn chặn tình trạng suy nhược suy giảm miễn dịch kéo dài Curcumin giúp thể phòng ngừa chống ung thư [3] Curcumin chất có triển vọng lớn điều trị viêm gan B, C nhiễm HIV [10,11] Theo quan điểm nhà khoa học, số lớn nghiên cứu cho thấy curcumin có tác dụng tốt cho não, notron, giảm stress, trầm cảm, trạng thái lo âu Curcumin tan nước môi trường axit, nên việc hấp thu chất thể thấp, đặc biệt dùng qua đường uống [26, 46] Việc nghiên cứu bào chế loại thuốc giải phóng kéo dài giúp trì nồng độ dược chất máu vùng điều trị Giảm dao động nồng độ thuốc máu (tránh tượng đỉnh - đáy) giảm tác dụng không mong muốn thuốc Giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh giảm nhiều phiền phức tránh quên thuốc, bỏ thuốc, thức dậy đêm để uống thuốc,… Vì vậy, đảm bảo tuân thủ điều trị người bệnh với người bị bệnh mạn tính kinh niên phải điều trị dài ngày (như bệnh cao huyết áp, đái tháo đường, ) Nâng cao sinh khả dụng thuốc thuốc hấp thu đặn, triệt để Trong nhiều trường hợp tập trung nồng độ thuốc cao nơi cần điều trị, phát huy tối đa tác dụng thuốc Giảm lượng thuốc dùng cho đợt điều trị, giá thành liều cao giá thành cho liệu trình điều trị lại giảm Uống đường ưa thích truyền thống để phân phối thuốc So với đường tiêm hệ thống phân phối thuốc qua đường miệng có nhiều lợi bao gồm an tồn nhất, đơn giản, tiện lợi, [78] Suzuki M, Nakamura T, Iyoki S, Fujiwara A, Watanabe Y, Mohri K, et al Elucidation of antiallergic activities of curcumin-related compounds with a special reference to their anti-oxidative activites Biological and Pharmaceutical Bulletin 28(8) (2005) 1438 [79][79] Stanislaw Bielecki, Alina Krystynowies Marianna, Turkiewies, Halina Kalinowska (1981), "Bacterial cellulose", Technical University of Ldz, Stefanowskieg, Poland, 901-924 [80] Stankovic, I., 2004 Curcumin: Chemical and Technical Assessment (CTA) JECFA, Rome, p [81] Steinbuchel A (2005), “Polysacharide and polyamide in the food industry”, 5(1), 187 – 200 [82] Strimpakos, A.S and Sharma, R.A., 2008 Curcumin: preventve and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials Antioxidants & redox signaling, 10(3): p 511-546 [83] Swarbrick J (1991), Preclinical drug dispositon, Marcel Dekker, Inc., New York, pp 31-68 [84] Thanh Xuan Nguyen et al (2014), “Chitosan – coated nano – liposomes for the oral delivery of berberin hydrochloride”, J.Mater.Chem.B, 2, 7149 – 7159 [85] Tønnesen H H., Másson M., Loftsson T (2002), "Studies of curcumin and curcuminoids XXVII Cyclodextrin complexation: solubility, chemical and photochemical stability", Internatonal Journal of Pharmaceutics, 244(1), pp 127-135 [86] Toyosaki H., Kojima Y., Tsuchida T., Hoshino K., Yamada Y., Yoshinaga F (1995), “The characterization of an acetic acid bacterium useful for producing bacterial cellulose on agitation culture: the proposal of Acetobacter xylinum subsp Sucrofermentans subsp Nov.”, Gen Appl Microbiol., 41, 307 – 314 [87] T Phan, P See, S Lee, SY.Chan, Protective effects of curcumin against oxidative damage on skin cells in vitro: its implicaton for wound healing, J-Trauma 51, 927-931, 2001 [88] Wan, Y Z., Luo, H., He, F., Liang, H., Huang, Y., & Li, X L 2009 “Mechanical, moisture absorpton, and biodegradation behaviours of bacterial cellulose fibre - reinforced starch biocomposites”, Composites Science and Technology 69(7 – 8), 1212 – 1217 [89] Wang X M., Zhang Q Z., Yang Q Z., et al (2012), "Validated HPLC– MS/MS method for simultaneous determination of curcumin and piperine in human plasma", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11(4), pp 621-629 [90] W.-F Chen, S.-L Deng, B Zhou, L Yang, Z.-L Liu, Curcumin and its analogues as potent inhibitors of low density lipoprotein oxidaton: possible H-atom involvement abstraction from the phenolic groups and of the 4-hydroxy-3- methoxyphenyl groups, 40, 526-535, 2006 [91] Wippermann, J., Schumann, D., Klemm, D., Kosmehl, H., Salehi Gelani, S., & Wahlers, T 2009 “Preliminary Results of Small Arterial Substitute Performed with a New Cylindrical Biomaterial Composed of Bacterial Cellulose” European Journal of Vascular and Endovascular Surgery 37(5), 592 – 596 [92] www.docstoc.com/docs/40771870/Bacterial-Cellulose [93] Yang K Y., Lin L., Tseng T., et al (2007), "Oral bioavailability of curcumin in rat and the herbal analysis from Curcuma longa by LC-MS/MS", Journal of Chromatography B, 853, pp 183-189 [94] Vandamme E.J, De Baets S., Vambaelen A., Joris K (1998), “Improved production of bacterial cellulose and its application potential”,Polymer Degradation and Stability, 59, 93 – 99 [95] Vareed S K., Kakarala M., Ruffin M T., et al (2008), "Pharmacokinetcs of curcumin conjugate metabolites in healthy human subjects", Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 17(6), pp 1411-1417 [96] Yoshinaga F., Tonuochi N., Wanatabe K (1997), “Research progress in production of bacterial cellulose by aeraton and agitation culture and its application as a new industrial material”, Biosci.Biotechnol.Biochem, 61, 219 – 224 [97] Zhu X, Zhang Z, Qi X, Xing J (2014), “Preparation of multiple-unit floating-bioadhesive cooperatve minitablets for improving the oral bioavailability ofCurcumin in rats”, Drug Deliv, 21(6), 459-L66 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết thẩm định phương pháp định lượng PHỤ LỤC Một số kết lấy mẫu xử lí mẫu huyết tương PHỤ LỤC Một số kết định lượng Curcumin huyết tương thỏ 75 Phụ lục 1: Thẩm định phương pháp định lượng Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng Sắc kí đồ mẫu huyết tương có curcumin 76 Phụ lục 2: Phương pháp lấy mẫu xử lí mẫu huyết tương 77 78 Phụ lục 3: Một số kết định lượng Curcumin huyết tương thỏ Mẫu 153 79 80 Mẫu 167: 81 82 83 Mẫu 117: 84 Mẫu 169: 85 ... Curcumin giải phóng từ màng bacterial cellulose nạp thuốc qua đường uống Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo curcumin giải phóng từ hệ Bacterial cellulose nạp thuốc, định hướng sử dụng. .. tinh khiết có khả giải phóng kéo dài tốt in vitro - Thuốc Curcumin dạng tinh khiết 96% có nguồn gốc từ Ấn Độ  Phạm vi nghiên cứu: Sinh khả dụng in vivo curcumin giải phóng từ hệ BC – curcumin. .. tế curcumin đạt 2-3% Với hi vọng khả nạp Curcumin màng BC giải phóng Curcumin kéo dài, đồng thời kiểm định lại kết đạt nghiên cứu in vitro chọn đề tài: Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo Curcumin