LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Trần Chi Phúc LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ gia đình ln bên cạnh, cổ vũ, động viên giúp đỡ gặp khó khăn suốt q trình q trình học tập thực Đồ án Em xin cám ơn thầy, thuộc khoa CƠNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MƠI TRƯỜNG, Trường Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tận tình dạy truyền đạt cho em đầy kiến thức suốt trình học tập trường Đặc biêt, em chân thành cám ơn Ts Nguyễn Hồi Hương tận tình giúp đỡ, hướng dẫn truyền đạt cho em nhiều kiến thức suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin cám ơn quý thầy, phụ trách Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƯƠNG, Trường Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt giúp cho em thực hoàn thành Đồ án tốt nghiệp Tơi xin cám ơn giúp đỡ nhiệt tình cộng tất bạn làm việc phòng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học giúp đỡ cho tơi suốt q trình thực Đồ án tốt nghiệp TP Hồ Chi Minh, ngày … tháng … năm 2014 Trần Chí Phúc Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Độc tố nấm mốc 1.2 Độc tố aflatoxin 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu 1.2.2 Tính chất vật lý phân loại 1.2.3 Sự tạo thành aflatoxin nấm mốc 1.2.4 Cơ chế gây độc aflatoxin 1.2.5 Độc tính aflatoxin 1.2.6 Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin 10 1.2.7 Tình hình nhiễm độc aflatoxin 11 1.2.8 Phương pháp phát aflatoxin 12 1.3 Phương pháp khử nhiễm aflatoxin 15 1.3.1 Phương pháp vật lý học 15 1.3.2 Phương pháp hóa học 17 1.3.3 Phương pháp sinh học 18 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian – địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 20 2.2.1 Vật liệu 20 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 20 2.2.3 Môi trường – Hóa chất 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Phương pháp luận 22 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 23 2.3.3 Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ 40 3.1.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm phương pháp đồng nuôi cấy môi trường hỗn hợp 40 3.1.2 Khảo sát khả đối kháng với nấm dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn môi trường hỗn hợp 42 3.2 Phân lập chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai 43 3.2.1 Khảo sát khả đối kháng chủng khuẩn phân lập với nấm mốc môi trường PDA 47 3.2.2 Khảo sát khả ức chế khả sinh aflatoxin chủng khuẩn phân lập với nấm môi trường CCA 48 3.3 Khảo sát sinh hóa chủng khuẩn phân lập 50 3.3.1 Nhuộm bào tử 50 3.3.2 Thử nghiệm Simmon citrate 51 3.3.3 Thử nghiệm catalase 52 3.3.4 Thử nghiệm protease 52 3.3.5 Thử nghiệm chitinase 53 3.3.6 Thử nghiệm lên men carbohydrate 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TĂT A.O.A.C: Association of Analytical Communities CCA: coconut cream agar Ctv: cộng tác viên ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA: Food and Drug Administration HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth ppb: parts per billion TFA: Tryfloacetic acid TLC: Thin layer chromatographi UV: Ultraviolet Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 1.1 Tính chất hóa lý số aflatoxin .5 Bảng 1.2 Một số loài nấm có khả sinh aflatoxin .6 Bảng 1.3 Ảnh hưởng aflatoxin có mặt thức ăn đến biểu bệnh lý vật nuôi Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin số nước theo tiêu chuẩn FDA .10 Bảng 1.5 Những quy định tạm thời cho phép thức ăn chăn nuôi nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi Việt Nam 11 Bảng 1.6 Các phương pháp khử nhiễm aflatoxin đường sinh học 16 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái nguồn gốc chủng vi khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b 51 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1 Cơ chế tác dụng aflatoxin B1 mức tế bào gan Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin 23 Hình 2.2 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ 24 Hình 2.3 Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai 29 Hình 3.1 Kết đối kháng chủng vi khuẩn phân lập môi trường hỗn hợp 41 Hình 3.2 Kết đối kháng nấm dịch tăng sinh mơi trường PDA 44 Hình 3.3 Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê 45 Hình 3.4 Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê 46 Hình 3.5 Kết đối kháng nấm dịch ly tâm canh trường với nấm mốc môi trường PDA 48 Hình 3.6 Kết ức chế phát triển khả tổng hợp aflatoxin nấm mốc dịch ly tâm canh trường vi khuẩn môi trường CCA 49 Hình 3.7 Kết nhuộm bào tử khuẩn CS1b 51 Hình 3.8 Thử nghiệm Simmon citrate CS1b cho kết dương tính 51 Hình 3.9 Thử nghiệm catalase CS1b cho kết dương tính 52 Hình 3.10 Thử nghiệm protease Chủng CS1b cho kết dương tính 52 Hình 3.11 Kết thí nghiệm chintinase Chủng CS1b cho kết âm tính 53 Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dương tính 54 Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính 54 Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính 55 Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề - Mycotoxin hay độc tố nấm mốc nhóm độc chất tự nhiên nấm mốc sản xuất trình phát triển Người ta phát hàng ngàn loại mycotoxin (được sinh chủ yếu nhóm nấm mốc Aspergillus, Penicillium Fusarium), phải kể đến aflatoxin Aflatoxin vừa gây độc cấp tính (ở liều lượng lớn gây chết số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lượng thấp tích tụ gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thối hóa gan thận…) Một số nghiên cứu chứng minh aflatonxin nguyên nhân gây ung thư cho động vật thí nghiệm, nguy hiểm người Nhóm độc tố aflatoxin sinh chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parisiticus Các loài nấm mốc có mặt nhiều số loại lương thực ngơ, lạc… vài loại hạt có chứa dầu Trong điều kiện nhiệt độ độ ẩm tương đối cao nước ta, việc bảo quản nguồn lương thực sau thu hoạch nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi cần thiết Nếu khơng có điều kiện bảo quản thích hợp điều kiện thuận lợi cho xâm nhập phát triển nấm mốc sinh aflatoxin Ngoài việc làm giảm chất lượng dinh dưỡng cho lương thực ngun liệu làm thức ăn chăn ni, mà gây tích tụ độc tố nguồn Điều gây tổn thất lớn cho ngành chăn ni nói chung cho người nơng dân nói riêng Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồn lương thực thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe người tiêu dung - Nhận tình hình thực tế đó, nhà khoa nước giới có nhiều nghiên cứu nhằm giải vấn đề Các tác nhân vật lí, hóa học đưa thí nghiệm nhằm làm hiệu lực aflatoxin Đặc biệt, xu hướng trọng dựa vào tác nhân vi sinh vật Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus…) thử nghiệm khả làm giảm aflatoxin thu kết khả quan - Vì lí thực tiễn trên, định chọn đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp Mục đích - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bước đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nôi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin nấm mốc - Định danh sơ vi khuẩn xác định chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin thử nghiệm sinh hóa Kết cấu đồ án - Chương I: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu - Chương II: Vật liệu phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến dụng cụ, thiết bị phương pháp nghiên cứu đồ án - Chương III: Kết thảo luận – nội dung chương đưa kết mà đề tài thực đưa thảo luận, biện chứng cho kết thu - Chương IV: Kết luận đề nghị - nội dung chương tóm lại kết mà đề tài đạt đề nghị cho hướng cần cải thiện thêm đề tài ĐC CS1b Hình 3.12 Kết lên men Glucose Chủng CS1b cho kết dương tính ĐC CS1b Hình 3.13 Kết lên men Lactose Chủng CS1b cho kết âm tính ĐC CS1b Hình 3.14 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính ĐC CS1b Hình 3.15 Kết lên men Sucrose Chủng CS1b cho kết âm tính - Như kết thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn CS1b phân lập phần phù hợp đặc điểm sinh hóa với vi khuẩn Bacillus, chúng tơi kết luận chủng Bacillus sp - Qua có thử nghiệm hóa sinh, chúng tơi nhận thấy khả ức chế tổng hợp aflatoxin phát triển nấm mốc sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn CS1b Các sản phẩm khơng có hoạt tính chitinase kháng nấm theo chế khác Như protease β- glucanase, hợp chất hữu khác - Sau thử nghiệm hai phương pháp tiếp cận để phân lập vi khuẩn kháng nấm từ phụ phế phẩm, nhận thấy không khó khăn nhiều phân lập vi sinh vật kháng nấm tự nhiên Tuy nhiên để nghiên cứu sản xuất hợp chất kháng nấm từ vi sinh vật chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng Trong thời gian thực đề tài, sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng Tuy nhiên chưa sử dụng đơn chất tạo nên sinh khối nấm để làm chất cảm ứng, từ rút kết luận tác nhân kháng nấm vi khuẩn CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 - Kết luận Thử nghiệm hai phương pháp tiếp cân để phân lập vi khuẩn đối kháng nấm sinh aflatoxin cho thấy, muốn khảo sát khả kháng nấm canh trường vi khuẩn loại bỏ tế bào, cần nuôi cấy vi khuẩn môi trường chứa chất cảm ứng thuộc sinh khối nấm mốc - Bằng phương pháp trên, chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập trái cà phê nhiễm nấm, có khả tổng hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin (Aspergillus sp.) 4.2 - Đề nghị Cần mở rộng nguồn phân lập khác đất trồng, trái cây… để tìm kiếm thêm chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm - Định danh vi khuẩn CS1b đến cấp loài nhờ sử dụng API kit giải trình tự gen 16S rRNA - Cần tìm hiểu thêm chế tác động tác nhân vi khuẩn phân lập ức chế phát triển hình thành độc tố aflatoxin - Cần có nghiên cứu trích ly hợp chất có canh trường nuôi cấy vi khuẩn phân lập được, thu hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng nấm cao - Nghiên cứu xem xét đến hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin, cần mở rộng khảo sát chủng khuẩn Bacillus sp phân lập lên nấm sinh độc tố khác Fusarium, Aspergillus Penicilium… - Các thí nghiệm nghiên cứu dừng lại cấp độ in vitro Cần thực thí nghiệm in vivo để xác định khả kháng nấm tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003) Nấm mốc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi NXB nông nghiệp [2] Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, (2002) Thức ăn dinh dưỡng động vật NXB nông nghiệp [3] Lê Anh Phụng( 2001) Bệnh nhiễm độc aflatoxin phương pháp phát aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh [4] Phạm Văn Tất (1996), Tác hại Aflatoxin Tạp chí thuốc sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996) [5] Phạm Hoàng Thái (2007) Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả ức chế sản sinh aflatoxin chủng phân lập Luận án tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh [6] Asao T., Buchi G., Adbel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wogan G.N (1963) Aflatoxins B and G Journal of American Chemical Society, 85, 17061707 [7] Butler W.H, 1964 Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats B J Cancer 18:756 [8] Davis N.D., Iyer S.K., Diener U.L 1987 Improved Method of Screening for Aflatoxin with a Coconut Agar Medium Applied and Environmental Microbiology 53:1593-1595 [9] Kondo T., Sakurada M., Okamoto S., Ono M., Tsukigi H., Suzuki A., Nagasawa H., Sakuda S (2001) Effects of aflastatin A, an inhibitor of aflatoxin production, on aflatoxin biosynthetic pathway anh glucose metabolism in Aspergillus parasiticus J Antibiot (Tokyo) 54: 650-657 [10]Kurtzman C.P., Horn B.Q., Heseltine C.W (1987) Aspergillus nomius, a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari Antonie van Leeuwenhoek 53: 147-158 [11]Munimbazi C., Bullerman LB (1998) Inhibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus Mycopathologia 140: 163-169 [12]Ono M., Sakuda S., Suzuki A., Isogai A (1997) Aflastatin A, a novel inhibitor of aflatoxin production by aflatoxingenic fungi J Antibiot (Tokyo) 50: 111-118 [13]Peterson S.W., Ito Y., Horn B.W., Goto T (2001) Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A monius Mycologia 93: 689-703 [14]Wild CP., Gong YY 2010 Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue Carcinogenesis 31:71-82 WHO (2008) World Health Statistics (2008) WHO Press, Geneva [15]Wu F., Khlangwiset P 2010 Health economic impacts and cost-effectiveness of aflatoxin reduction strategies in Africa: Case studies in biocontrol and postharvest interventions Food Additives & Contaminants 27:496-509 [16]Yan PS., Song Y., Sakuno E., Nakajima H., Nakagawa H., Yabe K (2004) Cyclo(L-leucyl-L-prolyl) produced by Achromobacter xylosoxidans inhibits aflatoxin production by Aspergillus parasiticus Appl Environ Microbiol 70:7466-7473 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM A.1 Thành phần mơi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trường PDA D - Glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml A.2 Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) Môi trường PDB D - Glucose 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000ml đun sôi 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000ml Bảo quản tủ mát chưa sử dụng - Khi ni cấy nấm mốc, bổ sung Chloramphenicol vào thành phần môi trường với tỉ lệ 0.02% A.3 Thành phần môi trường Nutrient Broth (NB) Môi trường NB Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Nước cất 1000 ml A.4 Thành phần môi trường Nutrient Broth_1 (NB1) Môi trường NB1 Peptone 2.5 g Meat extract 1.5 g NaCl 2.5 g Nước cất 500 ml Dịch tơ nấm (10g/l) 500 ml A.5 Thành phần môi trường Nutrient Agar (NA) Môi trường NA Peptone 5g Meat extract 3g NaCl 5g Agar 20 g Nước cất 1000 ml A.6 Thành phần môi trường Coconut Cream Agar (CCA) Môi trường CCA Agar 20 g Dịch nước cốt dừa 500 ml Nước cất 500 ml Lưu ý: - Dịch nước cốt dừa: 250g cơm dừa trộn phút 500ml nước cất đun sôi Lọc loại bỏ cặn - Khi pha môi trường, cần đun sôi hỗn hợp trước khử trùng bắng autoclave A.7 Thành phần môi trường Simmon citrate Môi trường Simmon citrate MgSO4 0.2 g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g Natri Citrate 2g NaCl 5g Bromothymol Blue 0.08 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml A.8 Thành phần môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth Tryticase peptone 10 g NaCl 5g Meat extract 1g Phenol red 0.018 g (7.2 ml dung dịch Phenol red 0.25%) 1000 ml Nước cất Carbohydrate A.9 Thành phần môi trường Casein 1% Môi trường CCA Agar 15 g Casein 10 g Đệm Phosphate (pH=7) 1000 ml A.10 Thành phần môi trường Chitin 1% Môi trường CCA Agar 15 g Huyền phù chitin 2% 500 ml Đệm Phosphate (pH=7) 500 ml Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc Khuấy 10 phút Sau cho từ từ nước cất làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa Để qua đêm ngăn mát tủ lạnh Huyền phù rửa cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = đến huyền phù đạt pH = Bảo quản huyền phù tủ mát PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH NẤM MỐC ASPERGILLUS SP X3 PHÂN LẬP TRÊN ĐẬU PHỘNG - Nấm Aspergillus sp X3 sinh viên Nguyễn Vân Hương (lớp 11DSH04_ Đại học Công nghệ TP Hồ Chi Minh) phân lập từ đậu phộng - Trên môi trường PDA, nấm Aspergillus sp X3 có sợi nấm màu trắng, bào tử có màu vàng lục đến luc - Định danh sơ bộ, X3 thuộc lồi Aspergillus Có hình thái lạc nấm hình thái cuống bào tử tương đối giống với chủng Asp flavus Asp parisiticus - Trên môi trường AFPA, Aspergillus sp X3 làm hóa cam mơi trường - Trên môi trường CCA, Aspergillus sp X3 phát huỳnh quang ánh sáng cực tím (UV) bước sóng 365 nm ... - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả kháng nấm Mục tiêu đề tài - Bước đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có khả kháng nấm sinh aflatoxin Nơi dung đồ án - Phân lập chủng vi khuẩn. .. giảm aflatoxin thu kết khả quan - Vì lí thực tiễn trên, chúng tơi định chọn đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin. ”... khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin - Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn dựa hoạt tính đối kháng hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin nấm mốc - Định danh sơ vi khuẩn xác định chế kháng nấm