BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG” Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1151100246 : Hồ Thị Bích Phương Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực phòng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh Các số liệu kết trung thực, chưa công bố Tôi xin chịu hồn tồn trách nhiệm lời cam đoan trước q thầy nhà trường Tp Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực Hồ Thị Bích Phương Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ gian lao nuôi dạy thành người người thầy đầu đời Cha mẹ chỗ dựa vững con, người giúp đứng vững sau lần vấp ngã, nguồn động viên, động lực để tiếp tục phấn đấu sống Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ sinh học – Mơi trường – Thực phẩm, tồn thể Thầy Cơ Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quý báu sở ngành chuyên ngành từ ngày em bước chân vào giảng đường đại học Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hương người ln tận tình dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Cảm ơn tất bạn lớp 11DSH04 bạn làm đồ án phòng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Môi trường – Thực phẩm ln khích lệ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập trường trình làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 SVTH: Hồ Thị Bích Phương Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỤC LỤC BẢNG viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.1.1 Hợp chất thứ cấp 12 1.1.2 Triển vọng tiềm sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.2 Tổng quan prodigiosin 15 1.2.1 Khái niệm prodigiosin .15 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin 16 1.2.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 18 1.3 Tổng quan Serratia marcescens 24 1.3.1 Phân loại Serratia marcescens .24 1.3.2 Đặc điểm Serratia marcescens .25 1.3.4 Một số hợp chất tổng hợp Serratia marcescens 29 1.3.5 Tổng quan quorum sensing S marcescens .31 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin .32 1.4.1 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 32 1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin 34 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Điều kiện tổng hợp prodigiosin 38 1.4.4 Thu nhận, tinh định lượng prodigiosin 39 1.5 Tiềm sản xuất prodigiosin Serratia marcescens 42 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1 Thời gian địa điểm 45 2.1.1 Thời gian 45 2.1.2 Địa điểm .45 2.2 Vật liệu 45 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 45 2.2.2 Mơi trường ni cấy hóa chất sử dụng 45 2.3 Phương pháp nghiên cứu 46 2.4 Bố trí thí nghiệm 47 2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy 49 2.5.1 Kiểm tra độ khiết .49 2.5.2 Kháng sinh đồ .49 2.6 Xác định điều kiện lên men 49 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc nuôi cấy 52 2.7.2 Xác định pH tối ưu cho môi trường lên men 53 2.7.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 53 2.7.4 Khảo sát ảnh hưởng phương pháp đồng nuôi cấy 54 2.7.5 Khảo sát ảnh hưởng sản phẩm Quorum sensing 55 2.8 Thu hồi sản phẩm thô 56 ii Đồ án tốt nghiệp 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men 56 2.8.2 Cải thiện q trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ 56 2.9 Các phương pháp phân tích 56 2.9.1 Xác định protein có mẫu 57 2.9.2 Xác định lipid có mẫu 57 2.10 Sắc ký mỏng TLC 57 2.11 Phương pháp phân tích .59 2.11.1 Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin 59 2.11.2 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 59 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Kết kiểm tra độ khiết 60 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin 65 3.2.1 Ảnh hưởng thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 65 3.2.2 Xác định vận tốc lắc 67 3.2.3 Kết xác định pH tối ưu cho môi trường MT3 69 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ muối lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 71 3.2.5 Kết thí nghiệm đồng ni cấy 73 3.2.6 Sử dụng dịch nuôi cấy 76 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trường 77 3.3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ canh trường: dung mơi trích ly lên hàm lượng prodigiosin thu hồi 77 3.3.2 Cải thiện q trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trường 78 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hóa học mẫu 84 3.4.1 Phản ứng Biuret’s test 84 3.4.2 Xác định lipid có mẫu 86 3.5 Sắc ký mỏng TLC 88 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 4.1 Kết luận 91 4.2 Kiến nghị 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bước sóng hấp thụ cực đại TLC: Thin Layer Chromatogarphy Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 19 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) 20 Hình 1.3 Cơ chế kháng tế bào ung thư prodigiosin (Chia-Che cộng sự,2011) 23 Hình 1.4 Serratia marcescens kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 29 Hình 1.5 Khuẩn lạc Serratia marcescens mơi trường nutrient agar 25 C sau 48 (David, 2012) 28 Hình 1.6 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno cộng sự, 2001) 35 Hình 1.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens (Sundaramoorthy cộng sự, 2009) 37 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51 Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 54 Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký 61 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy môi trường NA 63 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng soi nghiêng kính hiển vi vật kính 10X 64 Hình 3.3 Kết nhuộm Gram chủng SH1 65 Hình 3.4 Kết kháng kháng sinh chủng SH1 65 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Ảnh hưởng thể tích lên men lên hàm lượng prodigiosin tổng hợp 69 Hình 3.6 Hàm lượng prodigiosin thay đổi vận tốc lắc 71 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH lên tổng hợp prodigiosin S marcescens SH1 73 Hình 3.8 Kết hàm lượng prodigiosin bổ sung NaCl 75 Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 Bacillus sp 77 Hình 3.10 Kết đồng ni cấy E coli 78 Hình 3.11 Hàm lượng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trường: dung mơi khác 81 Hình 3.12 Canh trường sau ly tâm 82 Hình 3.13 Sắc tố đỏ sau trích ly với dung mơi Etanol:HCl (95:5) 83 Hình 3.14 Vi khuẩn S marcescens cấy môi trường NA 84 Hình 3.15 Hàm lượng prodigiosin so với đối chứng 85 Hình 3.16 Kết quét quang phổ sắc tố canh trường khơng đun đun 100 C 86 Hình 3.17 Biuret’s test dịch sau ly tâm dịch trích ly prodigiosin thơ 87 Hình 3.18 Ninhydrin test dịch sau ly tâm dịch trích ly prodigiosin thơ thí nghiệm đun khơng đun canh trường 88 Hình 3.19 Kết mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trước sau phun thuốc thử 90 Hình 3.20 Kết sắc ký mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v) 92 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin 93 vii Đường chuẩn Sắc tố 0.4 y = 1.100x + 0.004 R² = 0.999 0.35 0.3 O D 53 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ sắc tố (mg/ml) PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Ảnh hưởng pH đến hàm lượng sắc tố ANOVA Table for Prodigiosin by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.4576 2.4576 Within groups 0.193979 0.0484949 50.68 0.0021 Total (Corr.) 2.65158 Summary Statistics for Prodigiosin pH Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range deviation variation 7.2 3.3012 0.19277 5.83939% 3.1055 3.4909 0.3854 không 2.0212 0.244601 12.1017% 1.7763 2.2655 0.4892 2.6612 0.728228 27.3646% 1.7763 3.4909 1.7146 chỉnh Total Multiple Range Tests for Prodigiosin by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups không chỉnh 2.0212 X 7.2 3.3012 X Khảo sát ảnh hường nồng độ muối NaCl Summary Statistics for Prodigiosin % NaCl Count Averag Standard Coeff e deviation variation of Minimum Maximum Range Stnd skewness 0% 12.103 0.750165 6.19816% 11.3091 12.8 1.4909 -0.4044 1% 18.460 2.53651 13.7402% 15.5454 20.1636 4.6182 -1.1733 2% 12.987 4.71475 36.3012% 8.0727 17.4727 9.4 3% 7.7454 3.82559 49.3915% 4.6909 12.0363 7.3454 0.9209 12.824 4.88085 38.0596% 4.6909 20.1636 15.472 -0.0849 Total 12 ANOVA Table for Prodigiosin by % NaCl Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0264 Between groups 174.328 58.1094 Within groups 87.7213 10.9652 Total (Corr.) 262.049 11 Multiple Range Tests for Prodigiosin by % NaCl Method: 95.0 percent LSD % NaCl Count Mean Homogeneous Groups 3 7.74543 X 12.103 X 5.30 -0.2880 12.9879 XX 18.4606 X Đồng nuôi cấy S marcescens Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 2:1 ANOVA Table for Prodigiosin by đồng nuôi cấy Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.8848 Squares Between groups 0.101873 0.101873 Within groups 17.096 4.27399 Total (Corr.) 17.1979 0.02 Summary Statistics for Prodigiosin dong nuoi Count Average Standard Coeff cay S/B 2:1 of Minimu Maxim Range Stnd deviation variation m um skewness 7.53333 1.71541 22.7709% 5.9091 9.3273 3.4182 0.31176 Đối chứng 7.79403 2.36773 30.3787% 5.9818 10.473 4.4912 1.00872 Total 7.66368 1.8547 10.473 4.5639 0.76131 24.2011% 5.9091 Đồng nuôi cấy S marcescens Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 1:1, S/B 1:2 Summary Statistics for Prodigiosin NT Count Average Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Rang Stnd variation e skewness 1:1 16.8545 7.40232 43.9189% 9.05455 23.7818 14.72 -0.36993 1:2 17.4273 9.00178 51.6534% 7.03636 22.8545 15.81 -1.22109 ĐC 26.0818 13.2061 50.6335% 11.6727 37.6091 25.93 -0.6613 Total 20.1212 9.87946 49.0997% 7.03636 37.6091 30.57 0.38955 ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 160.372 80.1859 0.78 0.5017 Within groups 620.458 103.41 Total (Corr.) 780.829 Multiple Range Tests for prodigiosin by nghiệm thức Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups 1:1 16.8545 X 1:2 17.4273 X DC 26.0818 X Sử dụng dịch trong nuôi cấy ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.01 Between groups 2.49983 1.24992 Within groups 579.421 96.5702 Total (Corr.) 581.921 0.9872 Table of Means for PRO by NT with 95.0 percent LSD intervals NT Count Mean Stnd error (pooled s) Lower limit Upper limit DC 26.0818 5.67363 16.2651 35.8985 E coli 26.7182 5.67363 16.9015 36.5349 S 27.3727 5.67363 17.556 37.1894 26.7242 marcescens Total Multiple Range Tests for Prodigiosin by nghiệm thức NT Count Mean Homogeneous Groups DC 26.0818 X Dịch 26.7182 X 27.3727 X nuôi cấy E coli Dịch S marces cens Xác định vận tốc lắc So sánh kết thí nghiệm với ANOVA Table for Prodigiosin by TN Source Sum of Df Mean Squares P-Value 8.89 0.0161 Square Between groups 48.365 24.1825 Within groups 2.72145 16.3287 F-Ratio Total (Corr.) 64.6937 Multiple Range Tests for Prodigiosin by TN Method: 95.0 percent LSD TN Count Mean Homogeneous Groups TNC 5.185 X TNB 8.8848 X TNA 10.7653 X Summary Statistics for Prodigiosin TN Count Average Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Range variation TNA 10.7653 2.08945 19.409% 8.376 12.25 3.874 TNB 8.8848 1.42031 15.9859% 7.2545 9.8545 2.6 TNC 5.185 1.33464 25.7405% 3.736 6.364 2.628 Total 8.27838 2.84372 34.3511% 3.736 12.25 8.514 Thí nghiệm xử lý nhiệt canh trường Summary Statistics for Prodigiosin NT Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range deviation variation 10.168 4.34639 42.7458% 6.291 14.8 8.509 DUN 26.15 5.89949 22.5602% 18.655 33.054 14.399 Total 18.159 9.79748 53.9538% 6.291 33.054 26.763 DC ANOVA Table for Prodigiosin by NT Source Sum of Df Mean Squares F-Ratio P-Value 19.03 0.0048 Square Between groups 510.849 510.849 Within groups 161.085 26.8475 Total (Corr.) 671.934 Multiple Range Tests for Prodigiosin by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups DC 10.16 X DUN 26.15 X PHỤ LỤC BẢNG Bảng Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Kháng sinh Ký S I R hiệu Hàm lượng Đĩa Ampicillin Am ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 10μg Gentamicin Ge ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 10 μg Cefuroxime Cu ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefoxitin Cn ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefotaxime Ct ≥ 26 23 – 25 ≤ 22 30 μg Amoxicillin-clavulanic Ac ≥ 18 14 – 17 ≤ 13 20 μg /10 μg Amikacin Ak ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 30 μg Piperacillin/tazobactam Pt ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 100 μg /10 μg Ciprofloxacin Ci ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 μg Ertapenem En ≥ 22 19 – 21 ≤ 18 10 μg Ceftazidime Cz ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 30 μg Chloramphenicol Cl ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 30 μg Imipenem Im ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 10 μg Trimethoprim / Bt ≥ 16 11 – 15 ≤ 10 1.25 μg acid sulfamethoxazole /23.75 μg Cefepime Cm ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Tetracycline Te ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 30 μg Bảng Đánh giá nồng độ oxy hòa tan Nồng độ O2 Đánh giá mg/l Nguy hiểm, oxy nước không đủ cho cá, tôm mg/l Nước đủ oxy cung cấp ch0 cá, tôm -8 mg/l Tốt, nước có nhiều oxy Bảng Hàm lượng prodigiosin thu hồi trích ly tỷ lệ canh trường:dung môi (mg/ ml canh trường) quy mơ lên men khác A (thể tích lên B (thể tích lên C Tỷ lệ canh trường: men 20 (thể tích ml/ men 200 ml/ lên men 400 dung mơi bình) bình) ml/ bình) Tỷ lệ 2:3 8,4 7,3 3,7 Tỷ lệ 1:2 12,3 9,9 6,4 Tỷ lệ 2:5 11,7 9,5 5,5 Bảng Kết hàm lượng prodigiosin đồng nuôi cấy S marcescens SH1 với Bacillus sp Nghiệm thức Đối chứng S/B = 2:1 Đối chứng S/B = 1:1 S/B = 1:2 26,1 ± 13,2 (a) 16,9 ± 7,4 17,4 ± 9,0 Hàm lượng 7,8 ± 2,4(a) 7,5 ± 1,7 (a) prodigiosin tổng (a) (a) hợp (mg/ml canh trường) % prodigiosin 100 ± 96,7 ± 22 % tổng hợp so với 30,4% đối chứng (%) PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Thí nghiệm đo oxy hòa tan DO 100 ± 50,6 % 64,6 28,4 % ± 66,8 34,5% ± Hình Chai DO chứa canh trường MT3 thí nghiệm đo oxy hòa tan Hình Mẫu đo oxy hòa tan lên men 24h lắc 200 vòng/phút Mơi trường PG; 2.Mơi trường MT3 Canh trường MT3 (6 mg/l) Mơi trường PG (4 mg/l) Hình Đo oxy hòa tan sử dụng kit đo oxy hòa tan bán sẵn thị trường Thí nghiệm đồng ni cấy S marcescens Bacillus subtilis A Đối chứng; B Nghiệm thức S/B = 2:1 A.Đối chứng; B S/B = 1:1; C S/B = 1:2 Hình Thí nghiệm lên men đồng nuôi cấy S marcescens SH1 với Bacillus sp Thí nghiệm ni cấy có bổ sung dịch S marcescens SH1 E coli Hình Sử dụng dịch trong nuôi cấy A Đối chứng; B Dịch S marcescens; C Dịch loại bỏ tế bào E coli Hình Canh trường đun 100 C ... nhiều yếu tố cần cải thiện Dựa sở đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG” tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng... chất prodigiosin tách từ việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha thu nhận sắc tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy môi trường peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml sắc tố (... đồ Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hưởng vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phương pháp đồng nuôi cấy