TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – KHOA Y DƯỢC Báo cáo thực hành Lý Sinh Giảng viên: Đỗ Minh Hà Nhóm Thành viên: Phạm Trung Kiên Bùi Diệu Linh Nguyễn Thái Hoàng Văn Trọng Minh Đào Việt Nam MỤC LỤC Bài Xác định lượng hoạt hóa q trình co bóp tim ếch tách rời ……………………………………………………… 1.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 1.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 1.3.Thực hành…………………………………………………………… 1.4.Kết quả……………………………………………………………… 1.5.Giải thích…………………………………………………………… 1.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Tính thấm chiều da ếch…………………………………… 2.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 2.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 2.3.Thực hành…………………………………………………………… 2.4.Kết quả……………………………………………………………… 2.5.Giải thích…………………………………………………………… 2.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Xác định độ bền màng tế bào hồng cầu ……………………… 3.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 3.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 3.3.Thực hành…………………………………………………………… 3.4.Kết quả……………………………………………………………… 3.5.Giải thích…………………………………………………………… 3.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Đo kích thước tế bào kính hiển vi…………………………… 4.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 4.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 4.3.Thực hành…………………………………………………………… 4.4.Kết quả……………………………………………………………… 4.5.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Xác định Dzeta tế bào phương pháp vi điện di …… 5.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 5.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 5.3.Thực hành…………………………………………………………… 5.4.Kết quả……………………………………………………………… 5.5.Giải thích…………………………………………………………… 5.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Định lượng protein phương pháp quang phổ hấp thụ……… 6.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 3 7 9 10 11 13 13 13 14 14 16 16 16 17 17 18 18 20 20 21 22 23 23 25 26 28 28 28 29 29 6.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 6.3.Thực hành…………………………………………………………… 6.4.Kết quả……………………………………………………………… 6.5.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Bài Quan sát tượng huỳnh quang………………………………… 7.1.Lý thuyết…………………………………………………………… 7.2.Mục tiêu…………………………………………………………… 7.3.Thực hành…………………………………………………………… 7.4.Kết quả……………………………………………………………… 7.5.Giải thích…………………………………………………………… 7.6.Tài liệu tham khảo………………………………………………… Phân cơng cơng việc………………………………………………………… Bài XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HÓA CỦA QUÁ TRÌNH CO BĨP TIM ẾCH TÁCH RỜI 1.1 LÝ THUYẾT 29 30 30 31 32 32 34 34 34 36 36 37 Động học nghiên cứu tốc độ phản ứng (hay trình) phụ thuộc vào yếu tố nhiệt độ, nồng độ có mặt chất xúc tác ức chế Để phản ứng hóa học xảy nguyên tử, phân tử chất tham gia phải thay đổi, xếp lại cấu trúc hình thành nên trật tự cấu trúc sản phẩm phản ứng Muốn vậy, nguyên tử phân tử phải có lượng tối thiểu để vượt qua hàng rào lực đẩy lớp vỏ điện tử để liên kết với nhau, lượng hoạt hóa lượng tối thiểu cần thiết để nguyên tử, phân tử tham gia vào phản ứng Kí hiệu Ehh Theo Maxwell – Boltzmann, phân bố phân tử theo lượng có dạng hình Những phân tử có lượng lớn Ehh (là phân tử có lượng nằm bên phải đường thẳng Ze) có khả tham gia vào phản ứng tạo thành sản phẩm Khi nhiệt độ thay đổi, làm thay đổi động chuyển động nhiệt phân tử Do tổng lượng phân tử thay đổi Chẳng hạn nhiệt độ tăng lên (T2 > T1) lượng phân tử tăng lên, phân tử có lượng lớn Ehh nhiều hơn, thể đường cong phân bố Maxwell – Boltzmann dịch sang bên phải, chúng có khả tham gia vào phản ứng nhiều làm cho tốc độ phản ứng tăng lên.Để tăng tốc độ phản ứng hoá học, ta thường tăng nhiệt độ Mối liên quan tốc độ phản ứng nhiệt độ biểu diễn qua phương trình Arhenius (1.1) đó: K – tốc độ phản ứng; Ehh – lượng hoạt hóa; P – yếu tố lập thể; R – số khí; Z – hệ số va chạm; T – nhiệt độ tuyệt đối Đồ thị biểu diễn phụ thuộc lnK vào đại lượng thể hình Đồ thị có ý nghĩa quan trọng, dựa vào xác định giá trị lượng hoạt hóa q trình: (1.2) Năng lượng hoạt hóa xác định thơng qua đại lượng khác, đại lượng Q10 Đại lượng Q10 hay gọi hệ số Van’t Hoff Đại lượng tỷ số hai số tốc độ phản ứng điều kiện chênh lệch 10 độ Censius (10oC) (1.3) Trong đó: K1 – số tốc độ phản ứng nhiệt độ ban đầu T1; K2 – số tốc độ phản ứng nhiệt độ T2 = T1 +10; Đại lượng Q10 có nghĩa quan trọng Nó cho biết số tốc độ phản ứng tăng hay giảm lần nhiệt độ thay đổi 10oC Biểu thức toán học thể mối liên quan lượng hoạt hóa q trình đại lượng Q10 sau: (1.4) Trong hệ sinh học Q10 tốc độ phản ứng hoá học quan thể Trong thí nghiệm Q10 tần số co bóp tim ếch Trong hệ sinh học, Q10 xấp xỉ 1,7; hệ hoá học Q10 từ 2-4 phản ứng thể xảy phạm vi giới hạn nhiệt độ định Nếu tăng nhiệt độ vượt ngưỡng cho phép thành phần enzim xúc tác phản ứng bị biến đổi làm cho phản ứng xảy Trong thực nghiệm xác định đại lượng Q10 việc tính giá trị lượng hoạt hóa q trình (nhất q trình sinh học) trở nên dễ dàng Mục đích thực tập xác định lượng hoạt hóa q trình co bóp tim ếch tách rời 1.2 MỤC TIÊU: Xác định đối tượng nghiên cứu động học; Nắm vững lượng hoạt hóa phản ứng (một q trình); Mơ tả mối liên quan số tốc độ phản ứng với nhiệt độ; Nắm vững chất đại lượng Q10 ý nghĩa nó; Thành thạo phương pháp lập tim ếch tính lượng hoạt hóa q trình sinh học 1.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC HÀNH: 1.3.1 Dụng cụ, hóa chất vật liệu: - kéo to - cuộn - kéo - khăn lau dùng để mổ - chọc tủy - ếch / nhóm - khay mổ - bàn xốp để ghim ếch - 10 đinh ghim - công tơ hút - cốc thủy tinh - bình tam giác có nút cao su - canuyl dài hai lỗ - nồi cách thủy - lít dung dịch Ringer dung cho - khay (chậu) nước đá động vật biến nhiệt o - nhiệt kế loại – 50 C - đồng hồ bấm giây 1.3.2 Các bước tiến hành: Tách rời tim ếch: Bước 1: Gây tê ếch Dùng kim chuyên dụng chọc tủy ếch Bước 2: Cách mổ ếch - Đặt ếch lên bàn mổ, dung ghim cố định bốn chi ếch vào bàn mổ - Dùng kéo to mở rộng xoang ngực ếch, cẩn thận cắt bỏ màng bao tim thấy tim ếch hai động mạch: rẽ sang trái, rẽ sang phải từ động mạch chủ Nhẹ nhàng lật tim ếch lên thấy tĩnh mạch chủ phía - Dùng kéo panh nhỏ, luồn sợi dài chừng 15-20cm xuống hai động mạch tĩnh mạch chủ Cẩn thận luồn qua tĩnh mạch thành tĩnh mạch mỏng nên dễ bị rách - Thắt chặt tĩnh mạch chủ động mạch phía phải ếch Nhẹ nhàng kéo sợi để nâng động mạch trái lên, cắt vát đường, tạo lỗ nhỏ để luồn canuyl có chứa dung dịch Ringer (dung dịch sinh lý máu lạnh) vào sâu tâm thất Sự xuất cột máu canuyl tim co bóp đẩy lên chứng tỏ canuyl đưa vào đến tâm thất - Dùng ống hút rút bỏ máu canuyl, tiếp tục cho dung dịch Ringer vào canuyl để rửa tim toàn máu tim thay hết dung dịch Ringer - Thắt chặt chỉ, buộc động mạch trái vào canuyl dung kéo cắt rời tim khỏi lồng ngực ếch, tim sau tách rời khỏi thể mà đập, đẩy cột dung dịch sinh lý canuyl lên xuống nhịp nhàng việc tách rời (hay cô lập) tim ếch đạt yêu cầu - Gắn canuyl có tim ếch nhiệt kế vào hai lỗ nhỏ nút bình tạo ẩm cho bầu thủy ngân nhiệt kế mỏm tim độ cao Bình ẩm bình tam giác thủy tinh có chứa dung dịch sinh lý để tạo độ ẩm cho tim cô lập hoạt động tốt Nếu kỹ thuật tách tốt ta có tim cô lập đập nhịp nhàng tới liên tục Xác định đại lượng Q10 lượng hoạt động q trình co bóp tim ếch tách rời - Chuẩn bị ba bình ẩm chứa khoảng 50ml dung dịch Ringer nhiệt độ khác Bình Đặt nhiệt độ phòng thí nghiệm Bình Đặt máy điều nhiệt có nhiệt độ cao nhiệt độ phòng o 10 C Bình Đặt vào chậu nước đá để hạ nhiệt độ xuống thấp nhiệt độ phòng 10oC - Khi nhiệt độ ổn định, đặt tim ếch cô lập vào bình ẩm nhiệt độ phòng, đếm số nhịp đập tim thời gian phút, số tốc độ q trình co bóp tim ếch tách rời (KT) đếm lần để lấy giá trị trung bình Lưu ý: Có thể xác định số tốc độ trình cách xác định thời gian mà tim đập 20 nhịp Suy 60 giây đập nhịp Làm tiết kiệm thời gian - Tiến hành tương tự nhiệt độ cao thấp 10oC so với nhiệt độ phòng để xác định KT+10 KT-10 Cần ý lần thay đổi nhiệt độ phải chờ phút cho tim thích ứng với điều kiện nhiệt độ bình ẩm - Áp dụng cơng thức để tính đại lượng Q10 điều kiện tăng nhiệt độ : Từ tính lượng hoạt hóa q trình co bóp tim ếch tách rời điều kiện là: [kcal] (T1, T2 chuyển thành nhiệt độ tuyệt đối) Còn điều kiện giảm nhiệt độ thì: Và lượng hoạt hóa là: [kcal] 1.4 KẾT QUẢ THỰC HÀNH: Đo nhiệt độ phòng T=28 độ C ta kết sau: Bảng tổng hợp số liệu trung bình Số nhịp Thời gian (s) Hằng số Đại Năng đập 20 Lần Lần Lần Trung bình tốc độ K lượng Q10 lượng hoạt hóa Ehh 25 22 23 23.3 52 22 23 21 22 55 1.06 0.26 25 26 27 26 46 1.13 0.51 ( T1= 28oC) 20 ( T2= 38oC) 20 ( T3= 18oC) 1.5 Kết luận- Giải thích: Tim ếch nhiệt độ 38oC đập mạnh tim ếch nhiệt độ 28oC đập yếu nhiệt độ 18oC Như ta thấy tăng nhiệt độ tốc độ đập tim ếch tăng lên lượng phân tử tăng lên, số phân tử có lượng lớn Ehh nhiều 1.6 Tài liệu tham khảo: Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 2010 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 Bài TÍNH THẤM MỌT CHIỀU CỦA DA ẾCH 2.1.LÝ THUYẾT Màng tế bào hệ thống mở mà chúng có khả trao đổi chất từ ngược lại , đồng thời đào thải chất cặn bã ngồi mơi trường Da ếch đối tượng kiểm tra tính thấm chiều 10 Số liệu 17,89μm 18,91μm 21,37μm 11,12μm 0,92μm 14,77μm Đo trực tiếp (Thị kính 15x, vật kính 40x, 4,44 vạch = 100 μm) Lần đo Số liệu Lần đo Số liệu 1 vạch 0,9 vạch Quy đổi sang μm: Lần đo Số liệu 22,53 μm Lần đo Số liệu 20,277 μm 1,5 vạch 1,1 vạch 0,8 vạch 0,8 vạch 1,2 vạch vạch vạch 10 1,5 vạch 33,795 μm 24,783 μm 18,024 μm 18,024 μm 27,036 μm 45,06 μm 22,53 μm 10 33,795 μm Các thơng số thống kê: a Kích thước tế bào trung bình: = =19,013 μm b Phương sai mẫu hiệu chỉnh: s2 = =82.51851 c Độ lệch chuẩn: σ = = 9.08397 4.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 24 BÀI 5: XÁC ĐỊNH THẾ DEZTA CỦA TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI ĐIỆN DI 5.1 LÝ THUYẾT Trong hệ dị thể - đặc biệt đối tượng sinh vật xảy trình chuyển động tương đối pha phân tán so với môi trường phân tán dạng tác dụng điện trường khơng đổi Hay có chênh lệch áp suất thủy tĩnh gradient trọng lực thường xuất hiệu điện pha phân tán với môi trường phân tán Những tượng gọi tượng điện động học Một tượng điện động học điện di Điện di chuyển động pha phân tán so với môi trường phân tán tác dụng điện trường không đổi Chẳng hạn hệ dị thể gồm tế bào nấm men môi trường sống chúng tế bào coi pha phân tán, chuyển động có tác dụng dòng điện chiều bên ngồi so với mơi trường sống – mơi trường phân tán Sở dĩ tế bào di chuyển định hướng chúng có điện tích bề mặt Nếu bề mặt tích điện dương chúng chuyển động phía cực âm điện trường ngồi, ngược lại tích điện âm thi chúng chuyển động phía cực dương Như cách cụ thể nói vi điện di chuyển động pha phân tán phía điện cực có dấu trái với dấu điện tích bề mặt chúng Sở dĩ bề mặt pha phân tán có điện tích ngun nhân sau: Do chúng có khả hấp phụ ion lên bề mặt; Do chúng có khả ion hóa nhóm phân li phân tử cấu thành nên chúng 25 Những ion bám chặt bề mặt hạt gọi ion tạo thế Chúng có lực ion khác dấu phân bố môi trường phân tán Loại ion gọi ion nghịch Càng xa bề mặt ion tạo thế, lượng ion phân bố thưa dần Do lực hút tĩnh điện hai loại ion tạo ion nghịch tạo nên bề mặt hạt lớp điện kép Chiều dày lớp điện kép phụ thuộc vào nồng độ dung dịch, điện tích hạt nhiệt độ mơi trường, biến thiên từ vài A0 đến vài μm Cấu trúc lớp điện tích kép phức tạp, cho ion tạo gắn chặt bề mặt hạt có số ion nghịch bám xung quanh lực hút tĩnh điện Lớp chất lỏng mơi trường có ion nghịch bám quanh bề mặt hạt, chuyển động với hạt tác động điện trường gọi lớp hâp phụ Lớp chất lỏng mơi trường ion nghịch lại gọi lớp khuếch tán Khi hạt chuyển động điện trường lớp hấp phụ lớp khuếch tán xuất bước nhảy điện Điện gọi điện động hay Dzeta, ký hiệu ζ Dấu ζ dấu ion tạo định, giá trị ζ tỷ lệ với hiệu số điện ion tạo với ion nghịch lớp hấp thụ Nói cách khác, giá trị ζ giá trị ion nghịch lớp khuếch tán tạo nên Vì lượng ion nghịch lớp khuếch tán lớn ζ cao ζ - điện loại tế bào trạng thái sinh lý bình thường đại lượng cố định Khi bị tổn thương hay biến đổi trạng thái giá trị ζ thay đổi Dựa vào giá trị ζ điện đánh giá trạng thái chức tế bào Khơng có phương pháp đo giá trị ζ cách trực tiếp Người ta thường sử dụng phương pháp vi điện di để xác định giá trị ζ cách gián tiếp Nguyên lý phương pháp vi điện di sử dụng nguồn điện chiều (80-100V) làm cho tế bào chuyển động Quan sát chuyển động tế bào kính hiển vi xác định tốc độ di động (v) chúng để tính giá trị ζ Đối với hạt tích điện q tác động điện trường E lực f1 làm cho hạt chuyển động là: f1= q.E Khi chuyển động, hạt chịu tác dụng lực cản f2, theo định luật Stocxơ thì: f2 = 6πηvr (đối với hình cầu) 26 f2 = 4πηvr (đối với hạt có dạng gần giống với hình cầu) đó: η – độ nhớt mơi trường hạt chuyển động (puazơ); v - tốc độ chuyển động hạt (μm/s); r – bán kính hạt Khi hạt chuyển động f1=f2 nghĩa q.E=6πηvr Đối với hạt hình cầu xem: q = ζεr đó: ζ – điện bề mặt hạt hình cầu; ε – số điện mơi; r – bán kính hạt Ta viết: ζεrE = 6πηvr ζ = (hay ζ = ) Để cho đơn giản, coi môi trường phân tán nước số điện mơi ε = 81; η = 0,01 puazơ Theo công thức ζ tính đơn vị tĩnh điện (đvtđ) Thay giá trị vào ta biểu thức để tính giá trị ζ tế bào nấm men: ζ = 140 (mV) Ta biết tốc độ v = (s- quãng đường, t-thời gian hạt quãng đường S) gradient điện E = (V/cm) (u- hiệu điện hai đầu cầu aga hình chữ L buồng đo, l-khoảng cách hai đầu cầu đó) Từ đó: ζ = 140 5.2 MỤC TIÊU Hiểu khái niệm vi điện di Giải thích số tế bào rời đa số đại phân tử sinh vật lại chuyển động tác dụng điện trường Hiểu nguồn gốc điện tích bề mặt tế bào 27 Phân biệt khái niệm: ion tạo thế, ion nghịch, lớp hấp phụ lớp khuyếch tán Hiểu chất ý nghĩa điện động (thế Dzeta) Thành thạo phương pháp xác định Dzeta điểm đẳng điện loại tế bào rời dấu điện tích bề mặt 5.3.THỰC HÀNH Dụng cụ, hóa chất vật liệu - kính hiển vi quang học có trắc vi vật kính trắc vi thị kính - Nguồn điện chiều 150 von + điện cực đồng dây dẫn - khóa chốt để đảo mạch - Giấy thấm, khăn lau thấm nước - cầu agar hình chữ U - ống tế bào nấm men - panh - 250ml dung dịch KCl bão hòa - buồng đo điện di - 250 ml dung dịch CuSO4 10% - cầu agar hình chữ L - 250ml sacharose 8% - công tơ hút - 250ml Na2HPO4 - pipet loại 2ml ml - 250 ml dung dịch axit citric 0,1M 10 ống nghiệm loại 10ml giá pipet giá ống nghiệm đĩa đồng hồ loại to - đèn cồn dũa thủy tinh đồng hồ bấm giây đồng hồ đo điện vạn mẩu giấy kẻ oli dài 5-> 7cm 28 Các bước tiến hành Mắc mạnh điện theo hình : Pha dung dịch Măc-in-ven dung dịch đệm Măc-in-ven Pha dung dịch Măc-in-ven có pH = 2,4; 4,0; 5,2; 6,2; 7,0 cách trộn hai dung dịch Na2HP04 0.2M dung dịch acid citric 0,1M theo tỉ lệ Lấy dung dịch pH vừa pha trộn với dung dịch glucose 8% tỉ lệ 1:9 dung dịch đệm măc-in-ven có pH tương ứng pH 2,4 Na2HPO4 0,2M (μl) Acid Citric 0,1M (μl) 31 469 Glucose 8% (μl) 4500 29 4,0 5,2 6,2 7,0 192,5 268 330,5 412 307,5 232 169,5 88 4500 4500 4500 4500 Xác định dấu điện tích bề mặt tế bào giá trị dezta chúng Xác định điểm đẳng điện tế bào 5.4 KẾT QUẢ STT pH S(cm) L(cm) U(mV) t(s) ζ 3.0 0,05 3,5 63,4 3,25 0,085 4.2 0,05 3,5 69,2 0,063 6.0 0,05 3,5 83,8 6,5 0,032 7.0 0,05 3,5 87 9,6 0,021 Kết luận điểm đẳng điện Với pH tăng thì tế bào di chuyển chậm ζ chúng nhỏ.Vì điểm đẳng điện chúng pH >= 7.0 5.5 GIẢI THÍCH pH dung dịch tăng ζ tế bào giảm vời pH thấp tức nồng độ ion H+ cao điện tích Q chạy qua tế bào nhiều Trong khoảng cách lớp hấp phụ lớp khuyếch tán không đổi, điện Q chuyển đến tế bào giảm dần từ pH thấp đến pH cao ζ giảm dần 5.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 30 BÀI 6: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD (PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ) 6.1 NGUYÊN TẮC: Phương pháp Bradford phương pháp xác định protein dựa vào tạo phức hợp với protein thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue (Bradford 1976) Thuốc nhuộm tồn dạng: cation (đỏ), trung tính (xanh lá), anion (xanh dương) (Compton Jones 1985) Trong môi trường acid, thuốc nhuộm tồn chủ yếu dạng cation proton hóa kép có màu đỏ (Amax = 470nm) Tuy nhiên, thuốc nhuộm gắn với protein, bị biến đổi thành dạng ổn định chưa proton hóa có màu xanh (Amax = 595nm) (Reisner et al 1975, Fazekes de St Groth et al 1963, Sedmack and Grossberg 1977) Chính dạng màu xanh bị phát với bước sóng 595 nm phương pháp quang phổ kế đầu đọc microplate Các thí nghiệm với acid polyamino tổng hợp thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue G-250 gắn chủ yếu với amino acid đơn giản (đặc biệt arginine) amino acid thơm (Compton Jones 1985) Spector (1978) phát hệ số tận diệt dung dịch phức hợp thuốc nhuộm albumin không đổi phạm vi nồng độ 10 lần Do đó, định luật Beer áp dụng để định lượng protein cách xác cách chọn tỉ lệ thích hợp thể tích thuốc nhuộm để lấy mẫu nồng độ Một vài loại tương tác protein hóa học thuốc nhuộm hóa học làm ảnh hưởng đến thí nghiệm Các chất khơng phải protein ảnh hưởng đến thí nghiệm làm thay đổi cân ba dạng thuốc nhuộm Một vài loại chất tẩy rửa, chất tạo mùi, số chất kích thích protein đơn giản làm ổn định màu xanh thuốc nhuộm cách gắn trực tiếp làm thay đổi pH (Compton Jones 1985, Fanger 1987) Mặc dù nhiều tác nhân hóa học không ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển màu thuốc nhuộm sử dụng quy trình chuẩn 6.2 MỤC TIÊU Hiểu phản ứng thuốc nhuộm Commasie xanh ứng dụng xét nghiệm nồng độ Biết thao tác sử dụng máy đọc kết quang phổ kế Hiểu áp dụng định luật Lambert-Beer việc xác định nồng độ chất 31 6.3 THỰC HÀNH 6.3.1 Dụng cụ,hóa chất: - Dung dịch BSA (1mg/ml) - Dung dịch thuốc nhuộm xanh Commasie 1x - protein với nồng độ chưa xác định - quang phổ kế 6.3.2 Cách thức thí nghiệm: - B1: Pha dung dịch protein chuẩn (BSA) có nồng độ 10mg/ml PBS - B2: Pha dung dịch thuốc thử Bradford + Pha 0,1g G250 50ml methanol pha loãng đến 500ml dung dịch A + Pha 100ml 85% H3PO4 dung dịch B + Trộn dung dịch A với B lọc ta dung dịch Bradford - B3: Dùng pipet hút 0; 0.2 ml dung dịch BSA vào ống falcon up tới 1ml PBS - B4: Thêm dung dịch nhuộm vào ống falcon theo tỉ lệ 1:9 - B5: Tắt đèn, để phản ứng diễn Tối thiểu phút không 20 phút - B6: Đo quang phổ kế 595nm để xác định độ hấp thụ A (absortion) 6.3.3 Phân tích số liệu: - Nếu quang phổ kế trả kết khác không mẫu trắng, ta lấy giá trị trung bình mẫu trắng trừ giá trị mẫu chuẩn mẫu cần đo với giá trị - Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thụ bước sóng 595nm trục y nồng độ trục x Xác định nồng độ dung dịch mẫu chưa biết đường chuẩn Nếu mẫu pha loãng ta xác định nồng độ mẫu cách nhân với hệ số pha loãng dùng 6.4 KẾT QUẢ Dung dịch Mức độ hấp thụ quang (Absortion) Giá trị trung bình Trắng (Blank) 0,007 0,004 0,004 Mẫu (Sample) Chuẩn(Standard) 0,057 0,358 0,058 0,360 0,060 0,364 0,058 0,36 Dựa vào kết trên, ta xây dựng đường chuẩn có công thức y= 0,0357x+ 0,0026 với hệ số tương quan = 0,9999 32 Với y = 0,058 thay vào phương trình ta dc x = 1,552 Như nồng độ dung dịch mẫu đo 1,552 mg/ml 6.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập), NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 Bradford, Marion (1976) "A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding" (PDF) Analytical Biochemistry 72: 248–254 doi:10.1006/abio.1976.9999 – via Google Scholar https://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay Bài QUAN SÁT HIỆN TƯỢNG HUỲNH QUANG 7.1 LÝ THUYẾT Nguồn lượng chủ yếu sinh vật trái đất lượng xạ mặt trời Dưới tác dụng ánh sáng mặt trời sống phát sinh, trì phát triển Để tồn tiến hóa, sinh vật thu nhận lượng từ ánh sáng mặt trời chuyển hóa sang dạng lượng khác cần thiết cho sống qua phản ứng đặc hiệu Ánh sáng xạ điện từ trường lan truyền không gian với vận tốc vô lớn (trong chân không vận tốc ánh sáng đạt 300,000 km/s) Ánh sáng chia thành vùng bản: - Vùng nhìn thấy (vùng khả kiến) có bước sóng (λ) từ 400 – 700nm - Vùng tử ngoại có λ = 200 – 400nm 33 - Vùng hồng ngoại có λ = 700 – 1000nm Trong hệ sinh vật, lồi có vùng khả kiến khơng giống Ví dụ, với người vùng khả kiến có λ = 400 – 700nm với trùng vùng khả kiến lại có λ – 320 – 500nm Quá trình hấp thụ ánh sáng vật chất có phương trình : A + hv A* trình vật lý lượng tử túy với sở tương tác vectơ điện lượng tử ánh sáng với nguyên tử phân tử.Nguyên tử (phân tử) hấp thụ lượng tử có bước sóng (λ) xác định với lượng tương ứng với hiệu lượng (E) hai trạng thái, trạng thái trạng thái kích thích nguyên tử (phân tử) có phương trình sau: E = hc/λ Trong đó: h: số Plan c: tốc độ ánh sáng λ: bước sóng ánh sáng - Giai đoạn hấp thụ lượng tử ánh sáng giai đoạn khử trạng thái kích thích điện tử phân tử, đặc trưng chung cho tất phản ứng quang sinh học: 34 Sơ đồ biểu diễn mức lượng phân tử bước chuyển mức lượng Mơ tả - Đường A, a: Khi phân tử hấp thụ lượng ánh sáng để chuyển từ mức lượng ban đầu (S0) lên mức lượng cao (S1 S2) - Theo học lượng tử khơng có bước chuyển phát xạ (phát sóng ánh sáng) phân tử chuyển từ mức S2 mức S0 khơng có bước chuyển thẳng từ mức S0 lên mức triplet (bước cấm) - Khi phân tử chuyển từ mức S1 mức S0 phát huỳnh quang (b) chuyển từ mức triplet mức S0 phát lân quang (c) - Các đường 1, 2, 3, phân tử thải hồi lượng dạng tỏa nhiệt mơi trường Q trình phân tử hấp thụ lượng ánh sáng để chuyển lên trạng thái kích thích sau trở trạng thái ban đầu trình bất thuận nghịch Cảm giác màu sắc chuỗi trình sinh lý tâm lý phức tạp xạ vùng khả kiến chiếu vào võng mạc mắt Ánh sáng chiếu vào chất qua hồn tồn mắt ta chất khơng màu (thí dụ, thủy tinh hấp thụ xạ với bước sóng nhỏ 360 nm nên suốt với xạ khả kiến) Một chất hấp thụ hoàn tồn tất tia ánh sáng ta thấy chất có màu đen Nếu hấp thụ xảy khoảng vùng khả kiến xạ khoảng lại đến mắt ta gây cho ta cảm giác màu Chẳng hạn, chất hấp thụ tia màu đỏ (λ = 610 – 730) ánh sáng lại gây cho ta cảm giác lục 7.2 MỤC TIÊU Nắm chất ánh sáng Hiểu quy luật hấp thụ ánh sáng 7.3 THỰC HÀNH 7.3.1 Dụng cụ, hóa chất: - Giấy lọc - dịch chiết thực phẩm - Đèn UV - Kính lọc với chiết suất khác 7.3.2 Cách thức thực hiện: - Nhỏ giọt dịch chiết thực phẩm lên giấy lọc - Tắt đèn phòng, bật đèn UV pha quan sát giấy lọc thấm dịch chiết qua kính lọc với chiết suất khác 35 7.4 KẾT QUẢ Kính lọc Hình ảnh 420 440 460 480 36 550 620 650 7.5 GIẢI THÍCH Mỗi kính lọc cho bước song dải cho phép qua (ví dụ kính lọc 420nm cho phép bước sóng từ 410nm đến 430nm qua) Do ta thu dải hình ảnh ứng với dải bước sóng chiếu đến theo vùng ánh sáng khả kiến từ 400700nm giọt dịch chiết thực phẩm hấp thụ ánh sáng khác giấy lọc hấp thụ ánh sáng nên chiếu lên tia UV ta thu bước song phát khác Với kính lọc 650nm ta khơng thu kính lọc khơng cho ánh sáng khơng lọt qua 7.6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Sỹ An (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Bài giảng Lý Sinh học chương 6, thầy Đỗ Minh Hà 37 Phân công công việc Thành viên Phạm Trung Kiên Bùi Diệu Linh Nguyễn Thái Hoàng Văn Trọng Minh Đào Việt Nam Công việc Viết báo cáo thực hành Chụp ảnh (tính thấm da ếch) Đo kích thước tế bào trực tiếp kính hiển vi Viết báo cáo thực hành Đo số liệu (năng lượng hoạt hóa tim ếch) Đo kích thước tế bào trực tiếp kính hiển vi Viết báo cáo thực hành 4,6 Đo kích thước tế bào máy vi tính Thao tác lấy số liệu ( xác định nồng độ protein phương pháp quang phổ hấp phụ) Viết báo cáo thực hành 5,7 Đo kích thước tế bào máy vi tính Thống kê số liệu (điện di zeta) Chụp ảnh (huỳnh quang) Tổng hợp báo cáo Viết báo cáo thực hành Chụp ảnh (độ bền màng hồng cầu) Đo kích thước tế bào máy vi tính 38 ... (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Lương Duyên Bình (Chủ biên), Vật lý đại cương (3 tập) , NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, 2010 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập) , NXB Khoa... (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập) , NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 Bài XÁC ĐỊNH ĐỌ BỀN CỦA MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU 3.1 LÝ THUYẾT 15... (Chủ biên), Lý sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, 2005 Nguyễn Thị Quỳ, Lý sinh học (Phần thực tập) , NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2002 Bài ĐO KÍCH THƯỚC TẾ BÀO TRÊN KÍNH HIỂN VI 4.1 LÝ THUYẾT Muốn