Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm MỤC LỤC MỤC LỤC QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I CÁC QUI ĐỊNH CHUNG CỦA PHỊNG THÍ NGHIỆM II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM III KỸTHUẬT SINH HÓA Bài 1: PHA HÓA CHẤT, CHUẨN BỊ THIẾT BỊ DỤNG CỤ I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT II HÓA CHẤT DỤNG CỤ 13 III THỰC HÀNH 13 IV CÂU HỎI CHUẨN BỊ 13 Bài 2: XÁC ĐỊNH PROTEIN TỔNG, ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL 14 A XÁC ĐỊNH PROTEIN TỔNG 14 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 14 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 14 III HÓA CHẤT 15 IV THỰC HÀNH 15 V CÂU HỎI CHUẨN BỊ 17 B XÁC ĐỊNH ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PP SORENSEN) 17 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 17 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 18 III HÓA CHẤT – NGUYÊN LIỆU 18 IV THỰC HÀNH 18 V CÂU HỎI CHUẨN BỊ 20 Bài 3: XÁC ĐỊNH HÀM ẨM VÀ TỔNG LƯỢNG CHẤT KHƠ HỊA TAN 21 A XÁC ĐỊNH HÀM ẨM 21 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 21 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 21 III HÓA CHẤT 21 IV THỰC HÀNH 21 V CÂU HỎI CHUẨN BỊ 23 B XÁC ĐỊNH TỔNG LƯỢNG CHẤT KHƠ HỊA TAN 23 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 23 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 23 III HÓA CHẤT 23 IV THỰC HÀNH 23 Bài 4: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG, ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS 25 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 25 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 25 III HÓA CHẤT 25 IV THỰC HÀNH 25 Bài 5: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ DẦU MỠ 27 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 27 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 27 III HÓA CHẤT 27 IV THỰC HÀNH 27 V CÂU HỎI CHUẨN BỊ 29 Bài 6: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME ALPHA – AMYLASE 30 I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT 30 II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 30 III HÓA CHẤT 30 IV THỰC HÀNH 30 PHỤ LỤC 32 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I CÁC QUI ĐỊNH CHUNG CỦA PHỊNG THÍ NGHIỆM Mỗi nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an tồn, dụng cụ, hóa chất kết thí nghiệm cho thực tập Sinh viên phải có mặt phòng thí nghiệm qui định Sinh viên đến trễ khơng vào phòng thí nghiệm Khi kết thúc thí nghiệm sinh viên phải báo cáo kết với giáo viên hướng dẫn trước lúc Sinh viên vắng mặt phải có giấy phép phải xin thực tập bù buổi khác Sinh viên phải xem kỹ thực tập trước vào phòng thí nghiệm Mỗi nhóm thực tập cử sinh viên đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, bể) báo cáo cho giáo viên hướng dẫn Sinh viên phải rửa dụng cụsạch trước sau thực tập Kết thúc buổi thực tập nhóm phải lau dọn, làm chỗ nhóm làm thí nghiệm, dụng cụ bị mát, hư hỏng phải báo cho người phụ trách phòng thí nghiệm biết Mỗi buổi thực tập, nhóm trực nhật có nhiệm vụ: nhắc nhở nhóm dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước cửa trước Mỗi nhóm sinh viên làm tường trình kết theo yêu cầu thực tập, nộp kết cho giáo viên hướng dẫn vào buổi thực tập II KỸ THUẬT PHỊNG THÍ NGHIỆM Các điểm cần lưu ý để tránh tai nạn làm việc thực tập phòng thí nghiệm Cẩn thận tiến hành thí nghiệm, khơng sử dụng máy móc, dụng cụ chưa biết rõ cách sử dụng Phải hiểu biết rõ tính chất hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc Tất chai lọ đựng hóa chất có nhãn, dùng phải đọc kỹ tên nồng độ, dùng xong phải đậy nút đểlại chỗcũ Phần lớn hóa chất độc nên phải cẩn thận Đối với chất kiềm, acid đậm đặc phải lưu ý: - Không hút miệng - Phải dùng ống đong bình nhỏ giọt - Phải đổ acid kiềm vào nước cần pha loãng chúng - Phải đặt nghiêng miệng ống nghiệm cốc phía khơng có người - Khi acid bị đổ ngồi cho nhiều nước để làm loãng acid Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Khi theo dõi dung dịch sôi không đưa mặt gần hay để chất lỏng (chất kiềm) vào cốc phải đưa xa Khi đun chất lỏng ống nghiệm hay cho acid, kiềm vào phải đặt ống nghiệm nghiêng góc 45 Khi đun phải lắc hướng miệng ống nghiệm phía khơng có người Khi làm việc với chất dễ cháy tuyệt đối: Khi sử dụng chất dễ cháy ether, xăng, benzen, chloroform, natri, kali cần ý: - Không dùng lửa tránh xa lửa - Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt (chất dễ cháy, dễ bốc làm nổ hay bật nút, bốc gặp lửa cháy, lửa xa) - Khi chữa cháy phải bình tĩnh dập tắt lửa khăn ướt hay bình chữa cháy Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh: - Kiểm tra kỹ dụng cụ trước dùng - Tránh đổ vỡ - Dụng cụ dùng cho việc Khi đun, đun dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt - Dụng cụ phải rửa trước sau sử dụng - Không dùng dụng cụ thủy tinh, chai lọ để chứa chất kiềm mạnh acid đậm đặc có tác dụng bề mặt ăn mòn thủy tinh HF Khi làm việc với dụng cụ điện sử dụng điện tay phải khô, chỗ làm việc phải khô Kiểm tra kỹ nguồn điện dây dẫn điện sửdụng Sơcấp cứu phòng thí nghiệm Sơcấp cứu biện pháp tạm thời trường hợp thương tích nhẹ trước đưa bệnh nhân đến bệnh viện như: a Phỏng i Phỏng nhiệt (hay vật nóng) - Phỏng nhẹ: Lấy vải mùng tẩm dung dịch acid picric bão hòa đắp lên mặt vết - Phỏng nặng: Đắp nhẹ vải mùng tẩm dung dịch acid picric lên vết phỏng, sau chuyển bệnh viện ii Phỏng hóa chất Việc trước tiên ngâm vết thương vào chậu nước to để vết thương vòi nước chảy thật nhẹ Sau trung hòa hóa chất Chú ý trường hợp sau: - Phỏng acid: Đắp vải mùng tẩm dung dịch bicarbonat natri 8% - Phỏng kiềm: Đắp vải mùng tẩm dung dịch acid picric 3% Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm b Tai nạn vềmắt - Acid hay brom vào mắt: Rửa mắt tức khắc nhiều lần nước sạch, sau tẩm mắt dung dịch bicarbonat natri 1% - Chất kiềm vào mắt: Xử lý tẩm mắt dung dịch acid boric 1% c Ngộ độc Khi bị chất độc vào miệng: - Acid: Xúc miệng nhiều lần dung dịch bicarbonat natri 1% - Kiềm: Xúc miệng nhiều lần dung dịch acid 1% - Các hóa chất khác: Xúc miệng nhiều lần nước lạnh d Nhiễm độc Đưa nạn nhân nơi thống khí, nới rộng quần áo cho dễ thở Hô hấp nhân tạo lúc di chuyển đến bệnh viện e Điện giật Trước hết ngắt cầu dao điện có liên quan đến phòng thí nghiệm Nới rộng quần áo nạn nhân sau đem nơi thống Hơ hấp nhân tạo chờ chuyển đến bệnh viện trường hợp nặng f Hỏa hoạn - Ngọn lửa nhỏ: dập tắt khăn, vải bố ướt hay cát - Lửa bắt đầu cháy quần áo: lăn vài vòng đất để dập tắt lửa, bạn lấy vải ướt trùm lên chỗ cháy ép sát lửa tắt Tránh chạy hoảng - Dùng bình chữa cháy trước phòng thí nghiệm để dập lửa Lưu ý:Sinh viên phải báo cho nhân viên phòng thí nghiệm giáo viên hướng dẫn cố phòng thí nghiệm III KỸTHUẬT SINH HÓA Các dụng cụ thường dùng thực tập sinh hóa a Cách rửa dụng cụ Độ dụng cụ ảnh hưởng lớn đến kết thí nghiệm, rửa dụng cụ hóa học phần kỹ thuật phòng thí nghiệm mà sinh viên cần phải biết Để chọn phương pháp rửa dụng cụ trường hợp riêng biệt thường phải biết tính chất chất làm bẩn dụng cụ Sau sử dụng tính chất hòa tan chất bẩn nước nóng hay nước lạnh, dung dịch kiềm, acid, muối hay dung môi hữu Thường dùng cọ rửa dùng bàn chải chà xát vào dụng cụ (dùng cọ rửa phải ý cọ làm thủng đáy dụng cụ) Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Các dụng cụ sau rửa chất bẩn ngâm vào dung dịch sulfo- cromic (hỗn hợp K2Cr2O710% H2SO4 đậm đặc tỉ lệ thể tích) ngày; sau đem rửa với nước máy tráng lần với nước cất, xong để vào tủ sấy khô Dụng cụ thủy tinh gọi nước thành không tạo thành giọt riêng mà dàn mỏng b Các loại dụng cụ cách sử dụng i Ống nghiệm Ống nghiệm thường hình trụ tích khác Ta khơng đun nóng đáy ống nghiệm mà lửa phải để vào thành ống Điều kiện đun nóng dung dịch ống nghiệm: - Dung dịch không nhiều 1/3 ống nghiệm - Ống nghiệm giữnghiêng khoảng 45 luôn lắc khuấy - Miệng ống nghiệm không hướng vào người gây ii Ống hút (pipet) Có nhiều loại ống hút thơng dụng: - Loại có bầu an toàn: Dùng để hút dung dịch độc - Loại có hai vạch: Thể tích ghi ống thể tích hai vạch - Loại bình thường có phân độ Đối với loại chất lỏng độc, ta dùng bóp cao su đặc biệt gắn vào đầu ống hút, bóp hút để chất lỏng tự nhờ hệ thống khóa (valve) * Cách sử dụng: + Tráng ống hút lượng nhỏ dung dịch sẽhút + Hút dung dịch lên đến bên vạch ngang (xem hình) + Lấy ngón trỏ bịt đầu ống hút lại (ngón trỏ phải sạch, khơ), lau bên ngồi đầu ống hút giấy thấm + Nâng ống lên cao cho vạch chia độ ống hút ngang tầm mắt, đầu ống dựa vào thành bình cho dung dịch chảy từ từ theo thành bình đến lấy đủ thể tích cần dùng cho thí nghiệm ngưng (lúc cần quan sát mực nước cong tiếp xúc với vạch ống hút) + Giữ ống hút thẳng đứng chuyển qua bình hứng, đặt đầu ống hút chạm vào thành bình bng ngón trỏ để dung dịch chảy tự (bình hứng phải để nghiêng) Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm + Khi dung dịch ngưng không chảy nữa, ta xoay đầu ống hút 2-3 vòng trước lấy ống hút khỏi bình (khơng thổi vào ống hút để đuổi giọt thừa lại ống) + Khi đọc thể tích cần ý đọc theo mặt cầu lõm chất lỏng không màu suốt nước, đọc theo mặt cầu lồi chất lỏng có màu sậm dung dịch chứa iod iii Ống chuẩn độ (Buret) Được gắn giá có khóa để điều chỉnh lượng dung dịch chảy ống có phân độ (xem hình) * Cách sử dụng: + Kiểm tra xem khóa bơi vaselin để tránh chảy nước, xem có bị q xít, khó vặn khơng + Tráng lần với nước cất lần với dung dịch định dùng để chuẩn độ + Đổ đầy dung dịch vào ống lên đến mức số + Dùng tay trái mởkhóa cho dung dịch chảy từ từ mực dung dịch tiếp xúc với vạch (nếu giọt dung dịch dính lại đầu ống chuẩn độthì phải lấy cách chạm vào thành bình chứa) iv Ống đong (Cylinder) Có dung tích thay đổi từ5 mL đến L, có thểcó mặt đáy phân độ, tùy sựphân độ gần thể tích tồn phần Vì khơng nên dùng ống đong để chia lượng nhỏ v Bình tam giác (Erlenmeyer) Được sử dụng rộng rãi thí nghiệm phân tích (chuẩn độ) Bình tam giác có nút mài gọi “Bình xác định số iod” vi Bình chiết Dùng để tách riêng dung dịch lỏng khơng hòa tan với (ví dụ nước dầu) Khi lắc bình chiết, ngón tay phải giữ nút đầu khóa đầu bình vii Bình hút ẩm (Desiccator): Là dụng cụ thủy tinh có thành dày có nắp, dùng để làm khô mẫu từ từ để bảo quản chất dễ hút ẩm từ không khí Phần bình có đặt chất hút ẩm Muốn mở nắp bình phải đẩy nắp phía, tránh nhắc nắp lên cao viii Bình hút chân khơng: Được sử dụng bơm chân khơng đểlọc Bình có ống nhánh phần trên, ống nhánh nối với bơm chân không ix Ống sinh hàn: Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Là dụng cụ để làm lạnh ngưng Tùy theo điều kiện mà chất lỏng tạo thành ống sinh hàn làm lạnh sang bình thu trở lại bình đun nóng Sự khác chức ống sinh hàn định hình dạng tên gọi chúng Khi nối ống sinh hàn cần tuân theo quy tắc: Nước vào từ đầu thấp phía từ đầu phía x Bình định mức: Là dụng cụ tối cần thiết thí nghiệm phân tích Chúng bình cầu đáy có nút thủy tinh mài nhám Bình định mức dùng để pha lỗng dung dịch đến thể tích xác định để hòa tan chất dung mơi với thể tích xác định Khi cho dung dịch vào bình định mức cổ hẹp, phải dùng phễu, xong đậy nắp chặt dốc ngược bình nhiều lần để trộn Khi cho nước gần tới vạch, cẩn thận dùng ống hút đưa thêm giọt đến vạch mức Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Bài 1: PHA HÓA CHẤT, CHUẨN BỊ THIẾT BỊ DỤNG CỤ I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Phần lý thuyết nồng độ a Định nghĩa: Nồng độ đại lượng biểu thị cho mức độ đậm đặc hệ dạng rắn, lỏng hay khí b Các loại nồng độ: - Nồng độ phụ: Nồng độ phụ loại nồng độ mà giá trị khơng xác lý sau: + Lượng cân chúng không cân cân phân tích + Hóa chất cân khơng tinh kiết đạt tiêu chuẩn PA + Khi pha chất chúng không thực định mức bình định mức đạt chuẩn o Cơng dụng: Dùng cho phản ứng mang tính chất quan sát Dùng làm môi trường cho phản ứng xảy Phục vụ cho công việc pha chế o Các loại nồng độ phụ sử dụng hóa phân tích thường loại nồng độ sau  Nồng độ phần trăm: Có cách biểu diễn nồng độ phần trăm %(khối lượng/khối lượng): biểu diễn số gam chất tan có 100g dung dịch Ví dụ: nồng độ H2SO4 20% nghĩa 100 gam dung dịch H2SO4 20% có 20 gam H2SO4 tinh kiết Cơng thức tính: C%w/w = mct.100/mdd %(khối lượng/thể tích): biểu diễn số gam chất tan có 100ml dung dịch Cơng thức tính: C%w/v = mct.100/Vdd %(thể tích/ thể tích): biểu diễn số mililit chất tan có 100ml dung dịch Ví dụ: Cồn 50 có nghĩa 100mL dung dịch cồn 500 có 50mL cồn tinh khiết Cơng thức tính: C%v/v = Vct.100/Vdd  Nồng độ tỷ lệ: Nồng độ tỷ lệ biểu thị tỷ số lượng thể tích chất tan dạng đậm đặc thương mại lượng thể tích nước Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Ví dụ: Dung dịch HCl 1:1 nghĩa thể tích dung dịch chia làm hai phần phần thể tích HCl đậm đặc phần thể tích nước Dung dịch HCl 1:5 nghĩa chia dung dịch làm phần có phần thể tích HCl đậm đặc phần thể tích nước - Nồng độ chính: Là loại nồng độ có giá trị xác Những dung dịch biểu thị nồng độ phải pha từ chất gốc cân cân phân tích hay phải thiết lập nồng độ từ dung dịch tiêu chuẩn khác o Công dụng: Nồng độ dùng để đo hàm lượng hay nồng độ chất, nên liên quan trực tiếp đến mức độ sai kết o Các loại nồng độ sử dụng hóa phân tích thường loại nồng độ sau đây:  Nồng độ mol (CM) Biểu thị số phân tử gam chất tan có 1000mL dung dịch (hay lít dung dịch) Cơng thức tính: a 1000 CM   M Vdd Trong đó: a số gam chất tan M khối lượng phân tử gam hay nguyên tử gam chất tan Vdd thể tích dung dịch (mL) 1000 1000mL dung dịch  Nồng độ đương lượng (CN hay N) Biểu thị số đương lượng gam chất tan có 1000mL dung dịch hay lít dung dịch Cơng thức tính: a 1000 CN   D Vdd Trong đó: a số gam chất tan Đ khối lượng đương lượng gam chất tan Vdd thể tích dung dịch (mL) 1000 1000mL dung dịch 10 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Số nhóm cacboxyl tự số nhóm amin liên kết với fomanđehit, chuẩn độ nhóm cacboxyl xác định nhóm amin Vì cho phép định lượng axit amin có dung dịch nghiên cứu II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ pipet 10ml erlen 250ml buret 25ml III HÓA CHẤT – NGUYÊN LIỆU Dung dịch axit amin khoảng 0,1% nguyên liệu có axit amin cần định lượng Dung dịch NaOH 0,1 N Dung dịch HCl 0,1N Dung dịch fomanđehit trung hoà 30%: Lấy 50ml fomanđehit 30% cho thêm 0, l ml phenolphtalein etanol % chỉnh NaOH 0, 1N đến xuất màu vàng nhạt Dung dịch tymolphtalein 0, 1% etanol 90% Dung dịch KOH 0, 01N etanol 90% Cồn tuyệt đối Dung dịch CuCl2 amoniac 0,0025M Dung dịch phenolphtalein 1% etanol 60% IV THỰC HÀNH Cách tiến hành Cho vào bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1% Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Để trung hòa dung dịch axit amin, cho giọt NaOH 0,1N đến xuất màu vàng nhạt Cho thêm 20ml dung dịch fomanđehit 30% trung hòa lắc bình nón Sau phút dung dịch màu Chuẩn độ NaOH 0,1N đến xuất màu vàng nhạt trở lại (pH = 9,0) Thí nghiệm kiểm tra tiến hành tương tự với hoá chất thay dung dịch chứa axit amin nước cất thể tích Tính kết : ml dung dịch NaOH 0,1N tương đương l, mg nitơ Số mg nitơ amin dung dịch nghiên cứu tính theo cơng thức: mgN = (A - B) x 1, Trong đó: A – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm, B – Số ml NaOH 0, 1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra Phương pháp chuẩn độ formol axit amin trực tiếp thuận lợi Nó sử dụng để định lượng axit amin dung dịch nghiên cứu Đồng thời cần nhớ phương pháp khơng cho kết hồn tồn xác giá trị nitơ amin, dung dịch có prolin, liên kết khơng bền với fomanđehit nên làm giảm kết định lượng Ngược lại dung dịch nghiên cứu có tyrozin, lại làm tăng kết định lượng có nhóm phenol Phương pháp định lượng chuẩn độ formol sử dụng với mẫu có muối amoni, formalin cho hexamin, đồng thời giải phóng axit 4NH4C1 + 6HCHO  N4(CH2)6 + 6H2O + 4HC1 Nhóm cacboxyl axit amin lưỡng tính, peptit lớn protein xác định kỹ thuật chuẩn độ dung dịch nước - etanol khơng có formalin Mơi trường nước - etanol gây cản trở phân ly nhóm amin, kết trơ mơi trường nước, axit amin trở thành axit, nhóm cacboxyl axit amin chuẩn độ lại kiềm Với đặc tính này, định lượng axit amin phương pháp micro: Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm giọt dung dịch tymolphtalein 0,1% etanol 90% chuẩn độ KOH 0,01N etanol 90% đến xuất màu xanh Sau cho thêm 10 thể tích cồn tuyệt đối vào thể tích dung dịch cần 19 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm định lượng axit amin Màu dung dịch biến mất, chuẩn độ lại dung dịch màu xanh Màu để so sánh với màu chuẩn độ sử dụng dung dịch amoniac CuCl2 0.0025M Phương pháp đặc biệt dùng cho nghiên cứu trình động học enzim, biểu diễn ảnh hưởng tác động lên enzim proteolitic protein peptit V CÂU HỎI CHUẨN BỊ Các phương pháp định lượng acid amin Sai số phương pháp chuẩn độ formol Tại phải trung hòa formol trước sử dụng? 20 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Bài 3: XÁC ĐỊNH HÀM ẨM VÀ TỔNG LƯỢNG CHẤT KHƠ HỊA TAN A XÁC ĐỊNH HÀM ẨM I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Nguyên lý Dùng sức nóng làm bay hết nước mẫu thực phẩm Cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm nước có thực phẩm II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ (đến 100 – 105C 130C) Cân phân tích, xác đến 0,0001g Nồi cách thủy Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm bên (Na2SO4 khan, CaCl2 khan silicagen…) Cốc cân thủy tinh đáy bẹt có nắp nhám kín Đũa thủy tinh đầu dẹp, dài khoảng cm III HÓA CHẤT Mẫu thực phẩm (gạo, đậu xanh, đậu nành…) Na2SO4 cát bể Cát bể chuẩn bị sau: đổ cát qua rây có lỗ đường kính – mm Rửa qua nước sạch, sau rửa axit clohydric HCl Để qua đêm, sau rửa cát nước hết axit (thử giấy quỳ) Rửa lại nước cất, sấy khơ, cho qua rây có lỗ đường kính –1,5mm, đem nung lò nung 500 – 600C để loại chất hữu Giữ cát lọ đậy kín IV THỰC HÀNH Cách tiến hành Tiến hành thử nghiệm cho mẫu thử song song mẫu trắng sau Lấy cốc cân thủy tinh có đựng 10 – 30g cát đũa thủy tinh dẹt đầu, đem sấy 100 – 105C trọng lượng khơng đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Sau cho vào cốc cân khoảng 10g mẫu chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ Cân tất cân phân tích Dùng que thủy tinh trộn mẫu với cát Dàn thành lớp mỏng Cho tất vào tủ sấy 100 – 105C, sấy khô trọng lượng không đổi, thường tối thiểu Trong thời gian sấy, sau lại dùng đũa thủy tinh dẹp đầu nghiền nhỏ phần vón cục, sau lại dàn tiếp tục sấy 21 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Sấy xong, làm nguội bình hút ẩm 25 – 30 phút đem cân cân phân tích Cho lại vào tủ sấy 100 – 105C 30 phút, lấy để nguội bình hút ẩm cân trọng lượng không đổi Trọng lượng lần cân liên tiếp không cách 0,5mg gam mẫu Kết Độ ẩm theo phần trăm tính sau: X (G1  G )  100 G1  G (3.1) Trong đó: G trọng lượng bì (cốc cân, cát, đũa thủy tinh) G1 trọng lượng bì mẫu trước sấy G2 trọng lượng bì mẫu sau sấy Sai lệch kết lần xác định song song không lớn 0,5% Kết trung bình cộng kết lần xác định song song Tính xác đến 0,01% Lưu ý Có thể sử dụng phương pháp sấy khơ 130C hay phương pháp sấy chân không nhiệt độ thấp (60C) Đối với thực phẩm lỏng, cần làm bốc nước nồi cách thủy khô, trước cho vào tủ sấy Trường hợp khơng có cốc thủy tinh có nắp kín dùng cốc kim loại (nhơm) hay chén sứ Nhược điểm Phương pháp sấy khơ cho kết sai số làm tăng thủy phần sấy, chất bay (như tinh dầu, cồn, axit bay hơi…) bay với nước sấy thực phẩm có chứa nhiều đường, đạm, thành phần bị phân giải thành fucfurol, amoniac, làm giảm tỷ lệ thủy phần Cũng cho kết sai số, số thành phần bị oxy hóa gặp khơng khí nhiệt độ cao Axit hữu loại hợp chất hữu mà phân tử có chứa nhóm – COOH (nhóm cacboxyl ) Chất hữu tác dụng với muối cacbonat tạo khí CO2 phân tử chất hữu phải có chứa nhóm chức axit hữu (−COOH) 22 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Người ta thường vào tính chất axit hữu tạo bọt khí CO2 cho tác dụng với muối cacbonat để nhận biết axit hữu cơ, tách lấy riêng axit hữu khỏi hỗn hợp chất hữu cơ: Chất hữu tạo bọt khí nhỏ vào cục đá vơi (CaCO3) (hay muối cacbonat khác) axit hữu cơ; Cho hỗn hợp chất hữu có chứa axit hữu tác dụng với bột CaCO3 có dư, có axit hữu phản ứng tạo muối canxi cacboxilat Đun nóng để đuổi chất hữu bay đi, lại muối canxi cacboxilat CaCO3 dư Sau cho dung dịch H2SO4 vừa đủ vào muối (cho từ từ hết bọt khí CO2), thu CaSO4 kết tủa dung dịch axit hữu Sau chưng cất phân đoạn để thu axit hữu tinh khiết V CÂU HỎI CHUẨN BỊ Ưu nhược điểm phương pháp sấy đến khối lượng không đổi so với phương pháp xác định độ ẩm khác Tại phải để nguội mẫu sau sấy bình hút ẩm? B XÁC ĐỊNH TỔNG LƯỢNG CHẤT KHƠ HỊA TAN I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Nguyên tắc Dựa vào chiết suất để suy nồng độ dung dịch, nồng độ dung dịch tăng chiết suất tăng II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Khúc xạ kế (chiết quang kế) cầm tay 0-30 độ Brix III HĨA CHẤT Mẫu thực phẩm (nước có gas, nước ép trái cây) IV THỰC HÀNH Cách tiến hành Hiệu chỉnh chiết quang kế: Về nguyên tắc, nước cất khơng chứa chất hòa tan, người ta sử dụng nước cất để hiệu chỉnh chiết quang kế Nhỏ giọt nước cất (nhiệt độ 20C) lên mặt kính đo (chú ý khơng tạo bọt) đóng mặt kính lại Điều chỉnh vít vặn cho dải phân cách vùng sáng tối rõ nét điểm Lấy giọt mẫu thực phẩm lỏng nhỏ lên mặt kính đo (chú ý khơng tạo bọt) đóng mặt kính lại Đọc số tương ứng dải phân cách Đo nhiệt độ mẫu thực phẩm lỏng Nếu nhiệt độ khác 20C cần hiệu chỉnh theo phụ lục (Bảng hiệu chỉnh nồng độ chất khô đo nhiệt độ 20C) 23 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Chú ý: trước sau đo chiết suất phải dùng bơng tẩm rượu ete lau lăng kính đựng dung dịch thật Thường xuyên kiểm tra điểm “0” chiết quang kế cách lấy – giọt nước cất cho vào máy đo thước đo nồng độ Nếu thấy sai số phải dùng khóa điều chỉnh Chiết quang kế cho ta nồng độ chất khơ hòa tan 24 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Bài 4: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG, ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNS I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường tổng đường khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử acid dinitrosasylic tính đường khử mẫu nghiên cứu II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Ống nghiệm có nắp: Becker 250ml: Pipet 10ml: Đũa thủy tinh: Pipet 1ml: Chén cân: Bình định mức 100ml: Cuvet: Bóp cao su: Máy đo màu III HÓA CHẤT Thuốc thử acid ditrosalisylic(DNS):Cân 1g DNS pha 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất 30g muối Sodium potaaium tartrate, đun cách thủy cho tan định mức tới 100ml Dung dịch glucose mẫu (500ppm): cân 0, 5g D-glucose pha nước cất thành lit Dung dịch glucose mẫu (50ppm): hút 10ml dung dịch chuẩn glucose 500ppm cho vào bình định mức, thêm nước cất, định mức 100ml, lắc IV THỰC HÀNH Cách tiến hành Cân khoảng 4-6 gam táo hay mận, tiến hành trính ly 40ml cồn 90 độ cách chưng cách thủy cho sôi khoảng 10 phút becker 250ml.Chuyển dịch suốt q trình trích ly qua 40ml cồn 80 độ tiến hành trên, làm lần để đảm bảo lượng đường trích ly hồn tồn.Song song với q trình tiến hành khơ dịch trích ly becker khác đặc nồi chưng cách thủy.Khi dịch khơ 30ml dừng lại, cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cho đủ, lắc Hút 10ml dung dịch sau định mức cho vào bình định mức 100ml thêm nước cho đủ 100ml lắc đều.Đây dung dịch chuẩn bi tạo phức để đo độ hấp thu Nếu hàm lượng đường mẫu định mức lần Lập đường chuẩn với dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 50ppm tiến hành tạo phức màu cho mẫu theo bảng sau: 25 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Ống nghiệm Chuẩn Glucose 50ppm Dịch xác định Dung dịch DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 M1 M2 2 0.5 0.5 Đậy nắp ống nghiệm, chưng cất thủy sôi Nước cất 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 7.5 7.5 Chú ý: Sau cho thuốc thử DNS vào tiến hành chưng cách thủy cho sơi đến có màu nâu đỏ (chuyển tồn ống nghiệm vào becker 250ml chưng cách thủy) sau để nguội thêm nước cất cho đủ 10ml bảng Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 530nm Một số ý đo: Nếu màu phức đo q đậm hay nhạt giảm hay tăng thể tích chuân cho phù hợp bổ sung thể tích lại nước cất cho đủ 10 ml, pha chuẩn có nồng độ thấp hay cao Nếu độ hấp thu mẫu nằm ngài đường chuẩn tăng hay giảm lượng mẫu cho giá trị đo nằm đường chuẩn Tính kết Từ số liệu thu lập đường chuẩn: y = ax Từ tìm Cx Cơng thức hàm lượng đường khử tính sau: ppmbd  C x  Vdo Vdm Vdm1   Vxd2 Vxd1 m bd  C % bd  C x  Vdo Vdm Vdm1 100    Vxd2 Vxd1 m bd 10 Trong đó: Vđo thể tích dung dịch phức đo, 10 ml Vxd1 Vxd2 thể tích đem xác định lần 2, 10 ml, ml Vdm1 Vdm2 thể tích đinh mức lần 2, 100 ml, 100 ml mbd khối lượng mẫu đem xác định 26 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Bài 5: XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ DẦU MỠ I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Chỉ số xà phòng hóa: Chỉ số xà phòng hóa lượng mg KOH cần để trung hòa acid béo tự liên kết có 1g chất béo Chỉ số xà phòng cao chứng tỏ dầu mỡ chứa nhiều acid phân tử lượng thấp ngược lại Dưới tác dụng kiềm, glyxerit bị thủy phân tạo thành glyxerin xà phòng (muối Natri Kali acid béo) RCOOH + KOH  RCOOK + H2O CH OCOR CHOH CHOCOR + 3KOH  CH OCOR + CH OH CH OH Chỉ số axit: Chỉ số acid = số mg KOH cần thiết để trung hòa hết acid béo tự có g chất béo: RCOOH + KOH  RCOOK + H2O Trong dầu mỡ, lượng acid béo tự không đáng kể tăng lên trình bảo quản giai đoạn nẩy mầm, từ đánh giá dầu mỡ cũ hay mới, qua chế biến hay chưa II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ thiết bị cất sinh hàn hồi lưu, có mối nối nhám becker 100ml pipet 10ml ống đong 50ml buret 25ml, giá đỡ buret pipet 5ml bóp cao su erlen 250ml III HÓA CHẤT Mẫu dầu thực vật thô Cồn 96 Dd KOH 0, 5N chuẩn cồn 96 HCl 0,5N NaOH 0,1N Chỉ thị phenolphthalein 1% IV THỰC HÀNH Xác định số xà phòng hóa 27 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm a Tiến hành Cân xác 2g mẫu thử, cho vào bình cầu thiết bị cất, thêm 25ml KOH 0,5N cồn Lắp ống sinh hàn hồi lưu vào bình cầu đun cách thủy phản ứng xà phòng kết thúc (xác định thấy dung dịch bình suốt đồng điều khơng biến đổi pha lỗng với nước) Đối với chất khó xà phòng hóa, thêm 5-10ml xylen đun lâu tùy theo trường hợp Tiến hành song song mẫu trắng khơng có chất thử với 25ml dung dịch KOH 0.5N cồn điều kiện Ngay sau xà phòng hóa hồn tồn, pha lỗng bình với 25ml nước cất, cho vào giọt phenolphtalein, định phân dung dịch HCl 0.5N mảu hồng b Tính kết Chỉ số xà phòng hóa = Trong đó: 28,05.(a  b) c 28, 05:số mg KOH tương ứng với 1ml dung dịch KOH 0.5N a: số ml HCl 0, 5N sử dụng mẫu trắng b: số ml HCl 0, 5N sử dụng mẫu cần thử c: trọng lượng mẫu thử tính gam Xác định số axit: a Tiến hành Cân xác 5g dầu ăn, hòa tan 50ml cồn 980 để hồ tan dầu ăn, cho vào giọt thị phenolphthalein Chuẩn độ dd KOH 0,1N dd bình tam giác có màu hồng nhạt bền vững 30 giây Đối với loại dầu có nhiều ester dễ bị xà phòng hóa, ta sử dụng dd NaOH 0,05N để chuẩn độ Làm lập lại thí nghiệm lần lấy thể tích trung bình b Tính kết Chỉ số Acid = 56,1.V N m Trong đó: 56,1 số mdl gam KOH (mg) V : số ml KOH 0,1N hay 0,05N sử dụng định lượng 28 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm N : nồng độ đương lượng dung dịch KOH m : trọng lượng chất béo cân (g) V CÂU HỎI CHUẨN BỊ Chỉ số xà phòng hóa đặc trưng cho tính chất dầu thực vật ? Chỉ số axit đặc trưng cho tính chất dầu thực vật ? Trình bày nguyên lý phương pháp kiểm nghiệm Trình bày ý nghĩa thực tiễn thí nghiệm 29 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Bài 6: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME ALPHA – AMYLASE I CHUẨN BỊ LÝ THUYẾT Hoạt tính α-amylase biểu thị khả enzyme amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin phút 50C biểu số đơn vị amylase 1g mẫu Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột lại chưa phân hủy tạo phản ứng màu với iode so màu máy so màu quang học bước sóng 620nm II DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Máy đo quang Tủ ấm III HÓA CHẤT Dung dịch đệm Sorensen 1/15M , pH (tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu) Dung dịch tinh bột 1%(chuẩn bị trước làm thí nghiệm) Dung dịch HCl 1N Dung dịch NaCl 3% Thuốc thử Lugol: 0,5g I2 5g KI nước thành 200ml IV THỰC HÀNH Cách tiến hành Trích Amylase tinh khiết hóa: Cân 10g lúa nảy mầm vào cối với 30 ml nước cất, nghiền nước.Để yên 15 phút, đem lọc Lấy 20ml nước lọc thêm vào 80ml cồn tuyệt đối Khuấy đều, ta thấy amylase protein kết tủa Để lắng, đổ phần nước bên qua giấy lọc Chất kết tủa lắng đáy, cho thêm 5ml cồn tuyệt đối vào, lắc vào dễ lắng Cho phần dịch qua giấy lọc giữ chất trầm lại Rửa đến lần với cồn tuyệt đối Sau kỳ rửa chót, đổ tất kết tủa lên giấy lọc Khi tất cồn chảy qua hết, để ống nghiệm phễu để giấy lọc 20ml nước cất hòa tan độ kết tủa Ta có dung dịch amylase (và vài protein khác) Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ơng nghiệm Dung dịch hóa chất Ơng nghiệm (t) Ông nghiệm (0) Nước cất (ml) Dịch chiết enzyme amylase (ml) 30 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm Dung dịch đệm (ml) 1 Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 Dung dịch NaCl 3% (ml) 0.5 0.5 Dung dịch HCl 1N (ml) Đem ủ 50C 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) Nước cất (ml) 5.5 5.5 Thuốc thử Lugol (ml) 0.05 0.05 Lắc hỗn hợp ống nghiệm đem so màu bước sóng 620nm Tính kết quả: Hđ A = Trong đó: (OD0  ODt )  C  L(UI ) ODt  t OD0:Mật độ quang ống chuẩn ODt:mật độ quang ống thử không C:lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng(mg) t:Thời gian phản ứng (phút) L: hệ số pha loãng mẫu enzyme 31 Bài giảng thực hành Hóa sinh thực phẩm PHỤ LỤC Bảng hiệu chỉnh nồng độ chất khô đo nhiệt độ 20C