CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN LỆ HÀ Luận văn Thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày … tháng … năm … Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: TT Họ tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện Phản biện Ủy viên Ủy viên, Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau Luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV TRƯỜNG ĐH CƠNG NGHỆ TP HCM CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG QLKH – ĐTSĐH Độc lập – Tự – Hạnh phúc TP HCM, ngày … tháng… năm 20 … NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ĐỖ TIẾN NAM Giới tính: … Nam Ngày, tháng, năm sinh: 15-12-1988 Nơi sinh: ….Hải Hưng Chuyên ngành: KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG MSHV:…1441810005 I- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM II- Nhiệm vụ nội dung: Nhiệm vụcủa đề tài nghiên cứu ứng dụng protease việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu protein với hiệu suất cao nhất, nâng cao hiệu sản xuất góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trường III- Ngày giao nhiệm vụ: IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 22-08-2016 V- Cán hướng dẫn: TS NGUYỄN LỆ HÀ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn Đỗ Tiến Nam ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo nhà trường, quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường khơi nguồn động lực, tin tưởng giao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THUỶ PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM” Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS.Nguyễn Lệ Hà tận tình hướng dẫn giúp em ngày hoàn thiện đề tài nghiên cứu Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn kính chúc q thầy cơ, gia đình người thân yêu dồi sức khỏe Đỗ Tiến Nam iii TÓM TẮT Mục tiêu đề tài nghiên cứu ứng dụng enzyme protease - TEGALASE R660L việc thủy phân phế liệu tôm sú nhằm thu protein với hiệu suất cao Thông qua nội dung nghiên cứu, số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein thời gian thủy phân thích hợp, ảnh hưởng thời gian, nồng độ enzyme cho thuỷ phân xem xét đánh giá nhằm tìm kết tối ưu Từ kết thí nghiệm cho thấy, thời gian thủy phân protein tối ưu 9h, nồng độ enzyme 0.075% với nhiệt độ 55oC iv ABSTRACT Target of this study are enzymatic hydrolysis of protein from head meat of Black Tigershrimp using protease - TEGALASE R660L Factors affecting the hydrolysis of protein including time, temperature and concentration were investigated The experimental results showed that, the optimal hydrolysis time for the best efficiency was hours The optimal conditions for the besthydrolysis included temperature 55oC combined with the concentration 0.075% v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………… ……i LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………… …….ii TÓM TẮT………………………………………………………… …………… iii ABSTRACT……………………………………………… ………………………iv MỤC LỤC………………………………………………………… …………… v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNHẢNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài nghiên cứu Mục đích chung đề tài nghiên cứu : Phương pháp nghiên cứu : .2 CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1) Nguồn phế liệu tôm 1.1.1) Thành phần hóa học đầu tôm 1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu vỏ tôm .4 1.1.3) Hiệu môi trường mà đề tài mang lại………………… …………6 1.2) Giới thiệu proteaza 1.2.1) Giới thiệu chung protease : 1.2.2) Tính chất chung enzyme: Giới thiệu Enzyme proteaza sử dụng : 14 1.3) Ứng dụng proteaza: .14 1.3.1) Trong công nghiệp: .14 1.3.2) Trong nông nghiệp : 15 1.3.3) Trong mỹ phẩm : 15 1.3.4) Trong y học : 15 1.3.5) Trong kỹ nghệ phim ảnh : .16 vi 1.4) Các nghiên cứu nước việc sử dụng enzyme proteaza thủy phân protein 16 1.4.1) Các nghiên cứu nước : 16 1.4.2) Các nghiên cứu nước: 17 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1) Nguyên liệu nghiên cứu 18 2.2) Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1) Quy trình nghiên cứu 18 2.2.2) Phương pháp phân tích áp dụng: 20 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano) .21 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô 21 Phương pháp xác định hàm lượng chất tro .21 2.2.3) Phương pháp xử lý số liệu: 21 2.3) So sánh chi phí lợi ích mở rộng kế hoạch thuỷ phân phế liệu tôm sú nhằm tận thu protein với phương pháp khác để thấy hiệu .21 2.3.1) Phương pháp : Sản xuất thức ăn gia súc : 21 2.3.2) học : Phương pháp : Tận thu Chitin Chitosan phương pháp hoá 22 2.3.3) Phương pháp : Phương pháp tận thu protein 23 CHƯƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1) Kết nghiên cứu : 24 3.1.1) Ảnh hưởng nồng độ enzyme, thời gian đến trình thuỷ phân nhiệt độ 50oC .24 3.1.2) Ảnh hưởng nồng độ enzyme, thời gian đến trình thuỷ phân nhiệt 55oC .28 3.1.3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme, thời gian đến trình thuỷ phân nhiệt độ 60oC 31 3.2) Thảo luận ảnh hưởng yếu tố khác đến trình thuỷ phân 33 3.2.1) Ảnh hưởng nhiệt độ : 33 3.2.2) Ảnh hưởng nồng độ enzyme: 34 3.2.3) Ảnh hưởng thời gian thuỷ phân 34 vii 3.3) Thành phần hố học đầu tơm trước sau phản ứng : 35 3.4 ) Hiệu kinh tế khả ứng dụng : 36 3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải phương pháp xử lý 37 3.5.1) Nguồn thải trình thủy phân 37 3.5.2) Thành phần tính chất nước thải 37 3.5.3) Cơng nghệ áp dụng để xử lý nguồn thải 38 4.1) Kết luận 39 4.2) Đề xuất cho nghiên cứu 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 42 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ thực vật ………………19 Bảng 2: Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme từ động vật……………… 20 Bảng 3: Thành phần hoá học đầu tôm trước sau thuỷ phân………… 44 DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình : sơ đồ Bố trí thí nghiệm nghiên cứu q trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tơm………………………………………………………………………………27 Hình : Một số sản phẩm bột cá thị trường……………………………… 29 Hình : Kết thuỷ phân nhiệt độ 50oC………………………………….31 Hình : Kết thuỷ phân nhiệt độ 55oC………………………………….37 Hình : Kết thuỷ phân nhiệt độ 60oC………………………………….38 35 Thời gian ảnh hưởng đến kết thuỷ phân nhiều Khi ta tăng thời gian thuỷ phân, lượng peptid acid amin thu tăng theo Kết thuỷ phân tăng mạnh từ khoảng 1h-9h, chậm dần từ khoảng 9h 12h khoảng 12h-15h kết tăng chậm Bên cạnh kết có khuynh hướng giảm nhiệt độ 60oC khoảng thời gian từ 12h- 15h Như khoảng thời gian tối ưu để thuỷ phân khoảng 9h Đối chiếu so với nghiên cứu khác : Theo TS NGUYỄN LỆ HÀ thời gian thủy phân dài, lượng peptid - acid amin tạo nên lớn, đạt cực đại, sau giảm dần Kết nghiên cứu đề tài điều - Bên cạnh với loại enzyme khác khoảng thời gian tối ưu để đạt hiệu suất cao khác Theo ThS Trần Văn Thảo với enzyme Flavourzyme đạt hiệu suất cao 6h, đề tài với enzyme protease - TEGALASE R660L khoảng thời gian tối ưu 9h Như trình khảo sát thực nghiệm ta đánh giá qua khoảng thời gian 9h với nhiệt độ 55oC nồng độ 0.075% điều kiện thuỷ phân tối ưu nhằm đạt kết tốt tránh lãng phí nhiệt lượng cho q trình thuỷ phân 3.3) Thành phần hố học đầu tôm trước sau phản ứng : protein Trước PƯ 2528% chitin canxi Sau PƯ Trước PƯ Sau PƯ Trước PƯ 3-5% 27.2% 26% 10% Sau PƯ photpho tro lipit Trước PƯ Sau PƯ Trước PƯ Sau PƯ Trước PƯ Sau PƯ 9.50% 3.16% 3% 31.7% 30% 0.4% 0.1% Bảng 3: Thành phần hố học đầu tơm trước sau thuỷ phân - Qua trình thuỷ phân ta thấy chưa thể tách hồn tồn lượng protein có đầu tôm nhiên ta giảm phần lớn lượng protein Đây trình cần thiết cho bước sau diễn thuận lợi hơn, giảm thiểu lượng hố chất cần thiết nhằm góp phần giảm thiểu nguy cơô nhiễm môi trường 36 - Phần bã sau thuỷ phân ta tiến hành sản xuất chitin mà cần tốn NaOH cho trình khử protein Vì hàm lượng protein sau thuỷ phân enzyme lại thấp3-5% so với việc phải khử protein với hàm lượng 25-28% ban đầu Việc góp phần giảm thiểu nguy nhiễm mơi trường Phần dịch lọc ta tách chiết chất màu astaxanthin, sau bổ - sung phần peptid axiamin vào thực phẩm thứcăn gia súc Cách làm mang lại hiệu kinh tế cao, giảm thiểu nguy gây ô nhiễm môi trường 3.4 ) Hiệu kinh tế khả ứng dụng : Qua trình nghiên cứu, kết cho ta thấy hiệu mặt môi trường mà đề tài mang lại lớn - Sử dụng phương pháp thuỷ phân góp phần làm giảm lượng hoá chất đầu vào Theo “ Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp Chitin từ phế liệu chế biến thuỷ sản “ TS Bùi Xuân Đông (2013) để sản xuất kg chitosan phương pháp hóa học cần sử dụng 80 kgs HCl 10% 75 kgs NaOH 40% để khử chất khoáng protein - Theo nghiên cứu này, ta thấy : để sản xuất kg chitosan phương pháp sinh học ta cần 1.5ml enzyme protease - TEGALASE R660L, 14,3 kgs HCl 10% 14 kgs NaOH 40% để khử chất khống protein Bên cạnh đó, với nguồn nước thải đầu ta hạn chế khoảng 85% chất phân giải protein thải mơi trường ta thuỷ phân 23% protein đầu vỏ tôm phương pháp sinh học, phải khử 5% protein lại phương pháp hố học Như ta thấy khả ứng dụng đề tài vào việc sản xuất quy mô công nghiệp lớn, mang lại hiệu kinh tế cao 37 3.5 ) Thành phần, tính chất nguồn thải phương pháp xử lý 3.5.1) Nguồn thải trình thủy phân - Việc sử dụng nước để rửa phế liệu tôm làm phát sinh nguồn nước thải Trong có chứa nhiều chất hữu cơ, vô thành phần vi sinh vật Nếu khơng kiểm sốt xử lý kịp thời nước thải ảnh hưởng xấu đến môi trường - Bã thải sau q trình thủy phân Nếu khơng xử lý tốt nguồn gây ô nhiễm môi trường Bã sau trình lọc tận dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất Chitin Như sản xuất Chitin vừa tiết kiệm bước khử protein, vừa tận thu nguồn thải giảm nguy gây ô nhiễm môi - Dịch sau trình ly tâm nhằm tách protein khỏi dung dịch sau thủy phân 3.5.2) Thành phần tính chất nước thải - Nước thải trình thủy phân thường có nồng độ chất nhiễm cao (BOD, COD, SS …) Nếu nước thải thải trực tiếp môi trường mà không qua xử lý ảnh hưởng lớn đến môi trường sức khỏe người, đặc biệt gây nhiễm nguồn nước Trong dịch thải sau trình thủy phân có chứa nhiều hàm lượng chất hữu vơ hàm lượng chất hữu chiếm chủ yếu - Protein: phế liệu vỏ tôm, đầu tơm có chứa hàm lượng cao, sau q trình rửa, phần protein hòa tan với nước thải, nhiên hàm lượng khơng cao khơng cần tách protein khỏi nước thải Hàm lượng protein nước thải làm suy giảm oxy hòa tan protein dễ bị phân hủy tạo chất có mùi khó chịu như: H2S, NH3, hợp chất gây mùi khác … - Khoáng: CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 không nhiều Khi tách khỏi đầu, vỏ tôm khoáng chủ yếu tồn dạng muối như: CaCl2 , Ca3 38 (PO4 )2 Nếu để nước thải sau khoảng thời gian định muối lắng xuống, việc tách khỏi dễ ràng - Chất màu: chất màu nước thải thủy phân protein chủ yếu Astaxathin hàm lượng không cao ( Khoảng 16mg/kg) vỏ, đầu tơm lại có giá trị kinh tế lớn - Lipid: Trong đầu tôm chứa hàm lượng lipid nhỏ có chứa đầy đủ acid béo quan trọng như: acid paletic, acid oleic, acid linoleic … Như với thành phần có nước thải, thải ngồi mơi trường gây nhiễm mơi trường nặng, cần phải xử lý nước thải trước đưa mơi trường 3.5.3) Cơng nghệ áp dụng để xử lý nguồn thải Kết tủa protein cách dùng acid để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein điểm đẳng điện protein, sau dó dùng phương pháp lắng lọc để thu hồi protein Nguồn nước thải tiếp tục xử lý hệ thống xử lý sinh học kết hợp hai trình kỵ khí q trình hiếu khí với tham gia vi sinh vật kỵ khí hiếu khí Nước sau xử lý sinh học có BOD5 COD đạt tiêu chuẩn xả nguồn loại B theo TCVN5945-1995 39 CHƯƠNG 4) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN : 4.1) Kết luận Đề tài xác định khoảng điều kiện tối ưu thuỷ phân vỏ tôm sú enzyme protease - TEGALASE R660L nhiệt độ 55oC, nồng độ enzyme 0.075% với thời gian 9h 4.2) Đề xuất cho nghiên cứu - Nghiên cứu ứng dụng thuỷ phân phế liệu tôm sú enzyme protease TEGALASE R660L công nghiệp Nâng cao giá trị sử dụng, tránh thất thoát lượng lớn protein giảm thiểu nguy ô nhiễm môi trường - Thử nghiệm sử dụng protease khác vào thủy phân đầu, vỏ tôm, so sánh hiệu với enzyme protease TEGALASE R660L - Nghiên cứu ứng dụng từ dịch sau thuỷ phân tôm sú enzyme proteasaTEGALASE R660L nhằm đạt hiệu cao lợi ích kinh tế mang lại - Nghiên cứu sử dụng vỏ tôm sau thuỷ phân lấy phần lớn protein nhằm giảm thiểu nguy ô nhiễm môi trường - Tách chiết chất màu astaxanthin sau trình thuỷ phân bằngprotease TEGALASE R660L.nhằm nâng cao giá trị sử dung nguồn phế phẩm từ tôm sú 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO • Luận văn Thu nhận enzym papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân protein bánh dầu đậu phộng: Luận văn thạc sỹ Hoá Học, Chiêm Lâm Phúc Diễm Đại Học Quốc Gia TP.HCM, (2009) • Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitin từ phế liệu chế biến thủy sản: Bùi Xuân Đông cộng ( 2013) • KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE Lê Minh Sơn, Đại Học Cần Thơ (2009) • “Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, Trường ĐH thủy sản Nha Trang Protease B subtilis thủy phân mạnh thịt cá mối vàcó thể sử dụng enzyme sản xuất bột đạm thủy phân Khi bổ sung protease B subtilis với nồng độ 0,3% vào hỗn hợp thịt cá mối thủy phân 500C • Vũ Ngọc Bội, 2004 Nghiên cứu trình thủy phân protein cá Enzyme protease từ B subtilis S5 Luận án tiến sĩ sinh học, trường Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TP HCM • Lê Công Chánh, 2000 Nghiên cứu chiết rút Chitin từ nang mực Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Thủy sản, Đại học Thủy sản, Nha Trang • Đỗ Văn Ninh, 2003 Tối ưu hóa q trình thủy phân protein protease thịt cá thử nghiệm sản xuất sản phẩm từ protein thủy phân Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Thủy sản, Nha Trang • Nguyễn Văn Thiết Đỗ Ngọc Tú, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện KH CN Việt Nam, số 2/2006 Phương pháp Enzyme tách chiết Chitin từ vỏ tơm • Trần Thanh Trúc 2015 “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THỦY PHÂN DỊCH PROTEIN CỦA THỊT ĐẦU TÔM SÚ BẰNG ENZYME PROTEASE NỘI TẠI” tạp chí khoa học, Đại Học Cần Thơ 41 • Trần Văn Thảo, 2011“Nghiên cứu sản xuất sản phẩm thủy phân từ đầu tôm enzyme Flavourzyme ứng dụng sản xuất nước chấm” Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang • Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phương pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết nhanh chóng xác • Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dương cho hiệu suất thủy phân cao 42 PHỤ LỤC 1) Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (phương pháp Amano) 1.1 Nguyên tắc Dùng protein “casein” làm chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein enzyme protease sở định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân tác dụng enzyme 1.2 Các bước tiến hành ➢ Xây dựng đường chuẩn tyrosine Bảng 1.2.Đường chuẩn tyrosine Đối Ống số 10 20 30 40 50 60 70 80 90 chuẩn 10 20 30 40 50 60 70 80 90 98 97 96 95 94 93 92 91 0 0 0 0 chứng Nồng độ (g/ml) Dung tyrosine dịch (l) Dung dịch HCl (l) Na2CO3 (ml) Thuốc thử Folin (ml) 1000 990 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 43 Pha dung dịch tyrosine nồng độ khác : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 gtyrosine / mlHCl bảng 3.3.2 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine nồng độ khác thêm ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 37  0,50C 20 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 660 nm Ghi nhận kết As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90 As100 Đối với ống đối chứng dùng ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine Đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 660 nm ghi nhận kết Aso Trị số mật độ quang ống từ đến sau trừ trị số ống đối chứng giá trị  OD1 đến  OD9 Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên  OD theo nồng độ protein Đồ thị gọi đường chuẩn tyrosine ➢ Xác định hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme khảo sát nhiệt độ 370C pH = Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 37  0,50C 10 – 15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dịch chiết enzyme thô vào lắc Đem ủ hỗn hợp 37  0,50C Cho vào ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme Để ổn định dung dịch 25 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc Thêm ml thuốc thử Folin Trộn đều, để yên 37  0,50C 20 phút 44 Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thu bước sóng 660 nm (ghi nhận kết Am) Mẫu đối chứng : lấy ml nước cất thay cho ml dung dịch enzyme tiến hành bước tương tự mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ A0 Hàm lượng tyrosine giải phóng protease thủy phân tính cách lấy Am – A0 lấy kết so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease theo tính tốn sau : Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease xác định lượng enzyme để tạo lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosine ml dịch lọc điều kiện thí nghiệm Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – A0).F.1/100.n.V m F = [10/  As10 + 20/  As20 + 30/  As30 + 40/  As40 + 50/  As50 + 60/  As60 + 70/  As70 + 80/  As80 + 90/  As90+100/As100]/10  Am : độ hấp thu mẫu  A0 : Độ hấp thu ống đối chứng  F : Hệ số tương quan hàm lượng tyrosine độ hấp thu bước sóng 660 nm đường chuẩn  n : Hệ số pha loãng enzyme  1/100 : Hệ số chuyển đổi  V : Thể tích dung dịch enzyme  m : khối lượng chế phẩm enzyme thơ Tính tốn hoạt tính riêng (HTR) enzyme protease: từ kết hàm lượng protein (mg/ml) hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính hoạt tính riêng enzyme 45 Số đơn vị hoạttính HTR (UI/mg) = mg protein enzyme 2) Định lượng protein phương pháp Kjeldahl Lượng nitơ tổng số phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường xác định phương pháp Kjeldahl Đó hàm lượng tổng dạng nitơ hữu vơ có phẩm vật nghiên cứu Để định lượng nitơ protein, người ta thường xác định nitơ tổng số nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau lấy hiệu số hai dạng nitơ nhân với hệ số tương ứng Lưu ý: Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8%, trường hợp hệ số nhân 5.95 (100 : 16.8) Các protein động vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16%, trường hợp hệ số nhân 6.25 (100 : 16) 2.1) Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl Dưới tác dụng H2SO4 đặc nhiệt độ cao, hợp chất hữu có chứa nitơ (N) bị phân huỷ bị oxi hố đến CO2 H2O, nitơ chuyển thành amoniac tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat Quá trình tiến hành qua bước sau: * Vơ hố ngun liệu R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 * Cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + 2H2O + 2NH3 Phản ứng xảy bình hứng: 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Chuẩn độ H2SO4 dư bình hứng NaOH 0.1N 46 2.2) Xác định nitơ phi protein Để xác định N-phi protein cần dùng dung mơi thích hợp để chiết rút tất dạng N-phi protein (ví dụ dung môi etanol 70%) Tuy nhiên, dịch chiết lẫn vài loại protein, cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hoà tan q trình chiết rút Kết tủa protein tiến hành theo nhiều cách như: etanol, axeton, muối kim loại nặng, axit đun nhiệt độ cao … thông dụng dùng chất kết tủa sau đây: TCA 10-20%, poly nhôm clorua (PAC) với chất trợ keo tụ dạng âm A101, polyme C310H (keo tụ dương) Pb(CH3COO)2 10-15%, CuSO4 10% hỗn hợp với NaOH 10%, tỷ lệ : Sau loại bỏ kết tủa, dịch lọc chứa dạng N-phi protein Đem vơ hố dịch tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl 2.3) Định lượng protein nguyên liệu N-tổng số bao gồm N-protein N-phi protein Muốn xác định hàm lượng protein nguyên liệu phải xác định N-tổng số N-phi protein Hàm lượng protein mẫu tính theo cơng thức sau: Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).6,25 Hoặc Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).5,95 47 3) Kết sau thuỷ phân : a) Tại nhiệt độ 50oC Nồng Độ Enzyme 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 1h 3h 0.642 0.724 0.742 0.764 0.784 0.790 6h 0.850 0.939 1.025 1.087 1.128 1.165 9h 1.022 1.125 1.198 1.237 1.278 1.306 1.141 1.255 1.296 1.324 1.367 1.405 12h 15h 1.205 1.208 1.321 1.324 1.395 1.405 1.460 1.466 1.486 1.492 1.516 1.520 Kết sau xử lý số liệu : 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 1h 25.5 6.07 31.0 6.07 32.2 6.07 33.7 6.07 35.0 6.07 35.4 6.07 3h 39.4 45.3 51.1 55.2 57.9 60.4 50oC 6h 50.9 57.7 62.6 65.2 67.9 69.8 9h 58.8 66.4 69.1 71.0 73.9 76.4 12h 63.1 70.8 75.7 80.1 81.8 83.8 15h 63.3 71.0 76.4 80.5 82.2 84.1 b) Tại nhiệt độ 55oC : Nồng Độ Enzyme 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 1h 3h 6h 9h 12h 15h 0.801 0.880 0.897 0.935 0.963 0.997 1.050 1.125 1.165 1.207 1.234 1.255 1.188 1.292 1.328 1.360 1.395 1.410 1.264 1.418 1.550 1.577 1.591 1.605 1.278 1.434 1.565 1.591 1.606 1.616 1.282 1.440 1.570 1.595 1.610 1.620 48 Kết sau xử lý số liệu : 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 6.07 6.07 6.07 6.07 6.07 6.07 1h 36.1 41.4 42.5 45.1 46.9 49.2 3h 52.7 57.7 60.4 63.2 65.0 66.4 6h 61.9 68.9 71.3 73.4 75.7 76.7 9h 67.0 77.3 86.1 87.9 88.8 89.7 12h 67.9 78.3 87.1 88.8 89.8 90.5 15h 68.2 78.7 87.4 89.1 90.1 90.7 1h 3h 6h 9h 12h 15h 0.927 0.955 0.967 0.988 0.997 1.013 1.116 1.186 1.202 1.265 1.297 1.318 1.199 1.287 1.346 1.367 1.398 1.447 1.282 1.442 1.565 1.587 1.595 1.610 1.306 1.452 1.576 1.590 1.611 1.622 1.290 1.443 1.562 1.575 1.606 1.615 6h 62.7 68.5 72.5 73.9 75.9 79.2 9h 68.2 78.9 87.1 88.5 89.1 90.1 12h 69.8 79.5 87.8 88.7 90.1 90.9 15h 68.7 78.9 86.9 87.7 89.8 90.4 c) Tại nhiệt độ 60oC : Nồng Độ Enzyme 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 Kết sau xử lý số liệu : 0.025% 0.05% 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0h 6.07 6.07 6.07 6.07 6.07 6.07 1h 44.5 46.4 47.2 48.6 49.2 50.3 3h 57.1 61.8 62.9 67.1 69.2 70.6 49 - Đường chuẩn Tyrosin : y = 0.0157x + 0.2595 R² = 0.9591 1.8 1.6 1.4 1.2 Series1 Linear (Series1) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 20 40 60 80 100 120 ... ngành: KỸ THU T MÔI TRƯỜNG MSHV:…1441810005 I- Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THU PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM II-... lực, tin tưởng giao cho em đề tài đồ án tốt nghiệp “ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE TRONG THU PHÂN PHẾ LIỆU TÔM SÚ PENAEUS MONODON NHẰM TẬN THU PROTEIN PHÙ HỢP CHO MỤC ĐÍCH THỰC PHẨM” Đặc biệt, em... sử dụng protease để thu phân đểđạt hiệu kinh tế cao nhất, tránh gâng lãng phí điều cần thực Vì đề tài Nghiên cứu ứng dụng protease thu phân phế liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu protein