Đang tải... (xem toàn văn)
1. Chạy đường nềnTrước khi chạy mẫu ta phải thực hiện chạy đường nền cho Detector (chỉnh Zero)Các bước chạy đườngnền :1. Chọn Control > Preview Runkhi đó đường nền sẽ chạy2. Khi đường nền chạy hết thời gian ma ta đặt cho tham số Run time thì sẽ tự động ngừng. Nếu thấy đườngnền chưa ổn định thì ta phải chạy lại cho tới khi đường nền ổn định.3. Nếu thấy đường nền ổn định trước thời gian Run time thì ta có thể ngừng chạy bằng cách chon Control> Stop Run.Chú ý:Thông thường từ khi bắt đầu chạy đến khi đường nền ổn định cũng phải cỡ 30 phút (nếu hệ thống sạch).Còn hệ thống mà bẩn có thể lâu hơn.Nên rung siêu âm pha động trước khi chạy.Nước cất phải được lọc qua màng lọc 0.45um
BƯỚC 1: KHỞI ĐÔNG HỆ THỐNG Giả sử hệ thống HPLC lắp đặt xong phần mền EZchrom Elite cài đặt hoàn thành Trước khởi động hệ thống phải chuẩn bị đầy đủ Mobile phase , mẫu chuẩn ý thứ tự Mobile phase kênh Trình tự khởi động hệ thống HPLC - Lắp cột vào giá đỡ (nếu có tháo cột cất tắt hệ thơng ) - Mở van xả bơm dung môi, xả dung mơi kênh muốn sử dụng khơng hòa tan dung môi cũ… - Mở điện nguồn - Lần lượt mở Module CM5110, CM5210, CM5310, CM5420, PC , Print Khởi động phần nềm EZchrom Elite - Kích đúp (Double –click) biểu tượng EZchrom Elite hình máy tính - Xuất cửa sổ ban đầu sau: - Kích đúp vào biểu tượng có tên mặc định Instrument tên ta đặt VD: DAD system - Lúc khởi động xong phần nềm EZchrom Elite có cửa sổ để ta cài đặt thơng số chạy mẫu… EZchrom Elite BƯỚC 2: RỬA CÁC ĐƯỜNG ỐNG NẾU CĨ BỌT KHÍ Trong đường ống có xuất bọt trường hợp ta chạy mẫu lẫn ta thực thay đổi pha đông Các bước thực rửa ống (Purge) ống có bọt khí - Vặn van Drain ngược chiều kim đồng hồ 1800 1.1 Cách 1: Chọn Method > Instrument Set Up - Xuất cửa sổ Instrument Set up sau : - Xuất cửa sổ Instrument Set up sau : - Chọn thơng số tốc độ dòng để thực rửa kênh A (100%) Flow rate 0.4ml/min để thực rửa kênh A - Sau nhấn nút Purge CM 51110 pump để thực rửa kênh A Để thực hiên rửa kênh B, C, D ta thực hiên tượng tự Cách khác 3: Thường sử dụng với hệ High pressure gradient Vì với hệ áp suất cao ta không trực tiếp bấm Purge bơm 1.2 Cách 2: Ta thực rửa kênh trực tiếp phím cửa bơm: - Bấm phím “0 = Manual” Nhập giá trị cho tốc độ dòng mục “Flow” bấm “Enter” “Enter” Sau ta bấm “Pump” bơm chưa chạy bấm “PURGE” lúc bơm chạy loại khí với tốc độ tối đa (9.999ml/phút) 1.3 Cách 3: bấm Purge cửa sổ “Instrument status”: Từ cửa sổ chạy mẫu ta bấm “Control” chọn “Instrument status” sau chọn mục “Pump” chọn “Purge” Sau bấm Purge xuất hộp thoại nhỏ cho phép ta chọn Purge bơm A hay bơm B Chú ý: Phải vặn van thải trước bấm Purge EZchrom Elite BƯỚC 3: TẠO MỘT PHƯƠNG PHÁP MỚI Để thực phép phân tích cụ thể, ta phải tạo phương pháp phù hợp cho phép phân tích I) Trình tự tạo phương pháp 1.1 Chọn File > Method > New đo hình màu xanh cửa sổ xuất tên mặc định Method : untitle.met 1.2 Đối với phương pháp ta đặt tham số sau: 1.3 Đặt tham số thiết bị 1.4 Chon Method > Instrument Set up , xuất cửa sổ 1.5 Nhập tham số cần thiết cho thiết bị Click vào mục new bảng method để khởi tạo phương pháp phân tích Trong mục ta tiến hành cài đặt thông số cho từ modul HPLC 1.5.1 Pump: - Pressure limit: áp suất giới hạn hệ thống Min: áp suất nhỏ bơm Thường để mặc định Max: áp suất lớn bơm Thường để 40 40 MPa: cho tốc độ dòng 0.001 – 5.000 mL 20 MPa: cho tốc độ dòng 5.001 – 9.999 mL - Solvent name: đặt tên cho kênh dung môi (A, B, C, D) hút vào bơm - Flow: tốc độ dòng Pump gradient mode: LFM (low frequency mode: sử dụng trộn) HFM (high frequence mode: không sử dụng trộn) EZchrom Elite - Thường chọn LFM Turn off a shutdown: chọn mục bơm tự tắt sau khai báo tắt hệ thống bảng chạy mẫu theo lô .1.5.2 Cài đặ thông số cho tiêm mẫu tự động - Sampling: thông số cho xy lanh rút mẫu ASP syringe Speed: tốc độ hút mẫu syringe DSP syringe speed: tốc độ bơm mẫu syringe Needle down speed: tốc độ chuyển động kim tiêm mẫu Syringe volume: Thể tích xy lanh (70, 175, 700) Air volume: Thể tích khí lấy vào Trong All volume giá trị = - Rinse port wash: Rửa phận rửa kim Wash time (s): thời gian rửa tính giây - Needle wash: rửa kim tiêm mẫu Wash solvent: dung mơi rửa kim Có thể chọn dung môi dung môi Wash time solvent (s): thời gian rửa cho dung môi Wash time solvent (s): thời gian rửa cho dung môi Needle wash before injection: chế độ rửa kim trước tiêm Nếu chọn ô này, sau hút mẫu xong kim tự động rửa trước tiêm - Pluger wash: EZchrom Elite Pluger wash after sequence finish: rửa pluger sau kết thúc q trình chạy theo lơ Dung mơi rửa dung môi Wash time (s): thời gian rửa plunger - Wash solvent: dung môi rửa Solvent name: tên dung môi rửa Solvent name: tên dung môi rửa - Injection: tiêm mẫu - Injection method: phương pháp tiêm mẫu Bao gồm chế độ tiêm mẫu: Cut, All, Loop - Lead volume (ml): thể tích đầu Phần thể tích bỏ đoạn đầu phương pháp tiêm Cut - Rear volume (ml): thể tích sau Phần thể tích bỏ đoạn sau phương pháp tiêm Cut - Feed volume (ml): thể tích dung mơi lấy vào loop - Waste volume (ml): thể tích mẫu bỏ hai đầu vòng loop - Time injection with pump (PASS): thời gian tiêm mẫu với bơm Chế độ đồng hóa thời gian tiêm mẫu với vị trí quay trục piston Chế độ tích hợp hệ gradient áp suất thấp Chế độ Pass làm tăng độ ổn đinh thời gian lưu tiêm mẫu - Sense Missing vial: Chế độ báo lỗi vial tiêm mẫu Chế độ cho phép báo lỗi kim tiêm mẫu không phát vial khay mẫu 1.5.3 Cài đặt thông số cho Lò cột - Temperature: nhiệt độ Max Temperature for column 0C: nhiệt độ giới hạn lò cột (20 – 95 0C) - Wait before Injection: Chờ trước tiêm tiêm Wait with Tolerance (±0C): nhiệt độ dao động lò cột Wait time (min): thời gian chờ ổn định - Temperature control: điều khiển lò cột - Control off at shutdown: chọn mục bơm tự tắt sau khai báo tắt hệ thống bảng chạy mẫu theo lô Time table: bảng cài đặt nhiệt độ lò (Temp) cột theo thời gian chạy (Time) EZchrom Elite 1.5.4 Cài đặt thông số cho đầu dò DAD UV- VIS Detector : - Cài đặt thơng số cho đầu dò UV – Vis Time: thời gian lấy tín hiệu đầu dò Stop time (min): thời gian muốn lấy tín hiệu từ đầu dò Response time (s): thời gian đáp ứng chọn giá trị nhỏ tốc độ lấy tín hiệu nhanh - Sampling period (ms): khoảng thời gian lấy tín hiệu khoảng thời gian ngắn lượng tín hiệu lấy lớn - Absorbance: độ hấp thu Offset (AU): vị trí điểm tín hiệu Polarity: trạng thái lấy tín hiệu Bao gồm cực dương (Positive) cực âm tín hiệu (Negative) Range: chiều cao lấy tín hiệu cực đại Bao gồm (thường hay sử dụng 2) - Auto zero before injection: chọn mục tín hiệu chuyển điểm trước bắt đầu ghi tín hiệu EZchrom Elite - Lamp: đèn Mode: chế độ chọn đèn Gồm chế độ: D2, Wi, D2 Wi Lamp of at shutdown: chọn mục bơm tự tắt sau khai báo tắt hệ thống bảng chạy mẫu theo lô - Wavelength: bước sóng Chọn bước sóng cần để lấy tín hiệu Bao gồm chế độ: Single Wavelength Due Wavelength Single Wavelength: bảng cài đặt gồm mục Time (min): cài đặt khoảng thời gian lấy tín hiệu cho bước sóng Wavelength (nm): cài đặt bước sóng cần lấy tín hiệu 1.5.5 Các thơng số khác cửa sổ “Aux Traces” - ta muốn thể thơng số hình ta kích vào mục “Acquire” Thường không cần thiết 1.5.6 Cửa sổ Trigger - Nếu chọn “none” không tim mẫu - Nếu chọn “Internal” phải bấm “OK” sau tiêm mẫu Do nên chọn “External” mục Nếu chọn External để tự động chạy sau bơm mẫu - Kiểm tra lại lần thông số phương pháp II) Trình tự lưu phương pháp EZchrom Elite 2.1 Chọn File > Method > Save as Khi xuất cửa sổ sau 2.2 Chọn thư mục lưu phương pháp Method 2.3 Đặt tên cho phương pháp 2.4 Sau đặt xong, nhấn nút Save để lưu phương pháp Chú ý : Phương pháp nên lưu thư mục Method Phương pháp data lưu folder ổ cứng máy tính Nhưng nên đặt tên đường dẫn để dễ tìm kiếm Đường dẫn lưu Method Đặt tên cho phương pháp Phương pháp mà ta tạo lúc chưa thực hoàn chỉnh Sau chạy mẫu chuẩn ta phải thực thao tác sắc đồ nhận đặt tên peak, chỉnh sửa cho peak, tạo đường chuẩn, tạo báo cáo Khi phương pháp thực hồn chỉnh đặc tính ảnh hưởng trực tiếp lên file data phân tích hay file mở III) Mở phương pháp có sẵn Khi có sẵn phương pháp phù hợp với mẫu mà ta muốn phân tích (thường phương pháp mà ta tạo cho mẫu lần chạy trước) ta cần mở phương pháp để chạy mà ta không cần tạo phương pháp - Các bước thực mở phương pháp sau: 3.1 Chọn File > Method > Open Khi xuất cửa sổ Method File open 3.2 Chọn thư mục lưu phương pháp Method > chọn tên phương pháp > nhấn open Chú ý : Khi tiền đề xuất tên phương pháp ta mở Tất đặc tính cửa phương pháp ảnh hưởng đến phép phân tích data hành EZchrom Elite BƯỚC : ĐO HIỆU CHỈNH SẮC ĐỒ Chạy đường Trước chạy mẫu ta phải thực chạy đường cho Detector (chỉnh Zero) Các bước chạy đường : Chọn Control > Preview Run đường chạy Khi đường chạy hết thời gian ma ta đặt cho tham số Run time tự động ngừng Nếu thấy đường chưa ổn định ta phải chạy lại đường ổn định Nếu thấy đường ổn định trước thời gian Run time ta ngừng chạy cách chon Control > Stop Run Chú ý: - Thông thường từ bắt đầu chạy đến đường ổn định phải cỡ 30 phút (nếu hệ thống sạch) Còn hệ thống mà bẩn lâu - Nên rung siêu âm pha động trước chạy - Nước cất phải lọc qua màng lọc 0.45um Chạy mẫu chuẩn, mẫu thử: Sau đường ổn định, ta thực chạy mẫu chuẩn mẫu thử Có chế độ chạy mẫu chuẩn: Chạy mẫu theo chế độ Single Run Sequence Run - Single Run: Chế độ Single Run thường dùng để chạy mẫu chuẩn để thực thao tác xác định peak, đặt tên cho peak Sau lưu phương pháp (Lúc cần chọn File >Method > Save) - Sequence Run: Chế độ dùng để chạy mẫu chuẩn có nồng độ khác để xây dựng đường chuẩn có nhiều mức (đi qua hai điểm trở lên không thiết phải qua gốc tạo độ) - Để thực hiệu chỉnh sắc đồ ta chạy mẫu chuẩn chế độ Single Run 2.1 Các bước chạy chế dộ Single Run: + Chọn Single Run cửa sổ Single Run Acquistion xuất + Nhập tham số theo yêu cầu vào cửa sổ sau Sample ID : Nhập tên mẫu ta muốn chạy Method : Nhập tên phương pháp (kể đường dẫn) mà ta muốn chạy mẫu này, tên phương pháp tự động chèn vào ô này, ta nhấn biểu tượng Open kế bên để nhập tên Data path: Nhập tên File Phải có đường dẫn, ta dùng biểu tượng open kế bên để chọn đường dẫn thư mục để lưu file vào Data File: Tên file mà ta cần lưu vào Nên chọn tên dễ nhớ dễ tìm liên quan đến tên mẫu đo 5.Vial: Vị trí đặt mẫu (đối với hệ sử dụng bơm mẫu tự đông Auto Sampler ) EZchrom Elite Injection volume: Thể tích lần bơm mẫu (đối với hệ sử dụng bơm mẫu tự đông Auto Sampler ) Các mục khác: Có thể bỏ qua, để mặc định Vị trí lọ mẫu khay Và thể tích mẫu cần bơm - Sau điền đầy đủ tham số thích hợp vào cửa sổ Nhấn nút Start để bắt đầu chạy Lúc hình xuất sắc đò sau: Chú ý: Trên tiêu đề màu xanh xuất tên phương pháp file liệu Lúc phía cửa sổ xuất dòng chữ "Waiting for finishing run" bắt đầu bơm mẫu + Bơm mẫu Nếu có bơm mẫu tự động máy tự động bơm chạy theo quy trình cài đặt Bước chủ yếu hiệu chỉnh sắc đồ, ta dùng nẫu chuẩn mà ta chuẩn bị chạy để bơm Khi ta thực thao tác hiệu chỉnh sắc đồ nhận + Khi sử dụng bơm mẫu tay thực theo bước sau : EZchrom Elite Với điểm thứ ta nhập “Calibration level”: 3… Nồng độ thứ 2: Nhập giá trị cho data mẫu chuẩn lần thứ Nồng độ thưa Nhập giá trị cho data mẫu chuẩn chạy lần thứ (có nồng độ lớn ) Lúc ta tạo xong đường chuẩn qua mức Ta xem cách chọn Method > Review Calibration bấm trực tiếp biểu tượng đường chuẩn công cụ EZchrom Elite BƯỚC 6: THỰC HIỆN PHÂN TÍCH MẪU Sau hồn thành phương pháp chạy mẫu chuẩn để chạy đường chuẩn ta tiến hành phân tích mẫu thử Ta xác định nồng độ mẫu thử (Unknown) cách: Cách 1: Dựa vào diện tích chất chuẩn Nồng độ mẫu thử = [(nồng độ mẫu chuẩn x diện tích mẫu thử)/(diện tích mẫu chuẩn)] x (hệ số pha lỗng) Cách 2: Dựa vào đường chuẩn có sẵn * Chú ý: Các data file liệu mẫu thử chạy sau với file mẫu chuẩn Nhưng phải chạy điều kiện phương pháp với mẫu chuẩn - Chạy mẫu chuẩn chạy theo Single run sequence run (giống cách chạy với chạy mẫu chuẩn).Khác cửa sổ Single run ta không chọn mục “Calibrate” Không chọn Lúc mẫu ta bơm có thành phần giống với thành phần có mẫu chuẩn xuất thời gian lưu mẫu chuẩn Nồng độ xác định bỉ Ezchrom Elite vào diện tích peak chiêu cao Đây q trình định tính định lượng hệ thống VD : Sắc đồ mẫu chuẩn mẫu phân tích - Sắc đồ mẫu chuẩn : EZchrom Elite - Sắc đồ mẫu phân tích Để xem nồng độ mẫu thử theo đường chuẩn ta bấm chuột phải sau chọn “Anotations” chọn ESTD lúc ta thấy nồng độ xuất peak tương ứng Nếu chưa thấy xuất nồng độ chất thử ta kiểm tra lại xem bước sóng chọn có khơng?! Hoặc ta mở Method có đường chuẩn để tính tốn tích phân data file mẫu thử EZchrom Elite BƯỚC 7: TẠO BÁO CÁO KẾT QUẢ Custom Report báo cáo gồm thông tin cho phép phân tích phương pháp, sắc đồ, bảng peaks Sau hồn thành cơng việc chạy mẫu, ta phải xem in kết thông qua báo cáo (Report) Ta sử dụng mẫu Report có sẵn phần mềm tự tạo báo cáo theo ý riêng người dùng (Custom Report) Báo cáo ( Report): 7.1- Cách mở báo cáo có sẵn: - Mở file chứa method data cần tạo báo cáo - Mở data cần tạo file báo cáo Sau mở phổ đồ sắc ký ta tiến hành xử lý sắc ký đồ EZchrom Elite - Bỏ phần dư bên peak cần phân tích: click vào phía cơng cụ chọn vào biểu tượng intergration off Sau chọn phần cần bỏ đi: Và nhấn vào analyze now để hiển thị phần bỏ EZchrom Elite Sau bỏ phần không lấy diện tích ta chọn vào biểu tượng define peak để tính diện tích cho peak mong muốn tính Ta chọn vào khu vực cần chọn peak EZchrom Elite Sau nhấn OK Tiếp theo ta vào bảng peak/group mục method để đặt lại tên peak cho peak EZchrom Elite Sau đặt tên xong ta nhấn vào biểu tượng analyze thấy thay đổi sắc ký đồ Muốn hiển thị thông số diện tích,… click chuột phải vào phổ đồ chọn annotations Trong bảng ta chọn thông số cần hiển thị từ bảng phía trái qua phía phải EZchrom Elite Sau xử lý xong phần đồ thị ta tiến hành bước tạo file báo cáo kết để in - Bước 1: Vào Method/ Custom Report : - Bước : click chuột phải vào hình chọn import report EZchrom Elite - Bước 3: Màn hình xuất cửa sổ gồm nhiều report có sẵn Thường chọn External Standard.srp Click chuột phải vào hình chọn vào mục header/footer Trong phần header/footer ta tiến hành chỉnh sửa lại theo yêu cầu cần thiết EZchrom Elite Sau chỉnh sửa xong click chuột phải vào hình chọn export report để save lại phương pháp chỉnh sửa sắc ký đồ 7.2 Cách tạo báo cáo theo ý riêng (Custom Report) : Để có tạo Custom Report ta thực bước sau: - Chọn Method/ Custom Report xuất cửa sổ Method Custom Report EZchrom Elite Để tạo Custom Report ta phải chuột phải cửa sổ Xuất menu thông tin Chọn thông tin cần thiết để chèn vào Report thông tin tự động cập nhật mở File data khác cung phương pháp Các thông tin chủ yếu cần nhập sau: Trong mục Insert Field chọn : + Method name: + File name: + Injection volume: + Run time… Trong mục Insert graph chọn: + Data graph (sắc đồ) + Calibration curve (khi muốn in đường chuẩn) Trong mục Insert report chọn: + Run report Khi cửa sổ run report xuất ta chọn thông tin cần in EZchrom Elite Thường chọn: Pk≠ (số thứ tự peak); Name; Retention time; Area; ESTD… Chọn current data mở file cần in trước Hoặc mở từ biểu tượng Open phía Chọn kênh phân tích tai bước sóng chọn Chọn thơng tin cần in từ ô bên trái bấm vào mũi tên màu xanh để nhập sang ô bên phải Nếu muốn không xuất ta chọn từ ô bên phải bấm phím mũi tên màu đỏ để xóa khỏi danh sách bên phải Sau bấm “OK” Lúc xuất report bảng sample table sau Ta bấm chuột phải sample table chọn “ Show Data at Design time” thấy xuất số liệu bảng số liệu “Sample table” bảng sau: Channel A Results Retention Time 5.739 6.587 8.303 8.569 Totals Name Peak1 Peak2 Peak3 Peak4 Area Percent 25.611 21.327 19.265 32.253 Area 63056 52508 47432 79411 Height 7790 5631 4213 7667 98.456 242407 25301 Ngồi ta chọn để chèn thông tin Header Footer… Hoặc chèn hình hay thơng tin từ văn khác EZchrom Elite Muốn thêm bớt thông tin bảng cách click chuột phải bảng > chọn Report Properties > xuất cửa sổ Run report > thực chọn lựa cửa sổ > OK Muốn kiểm tra trang in Report, Bấm chuột phải trắng trang Report chọn Print Preview > muốn in nhấn Print góc trái cửa sổ, đóng lại cách nhấn nút Close 7.3 Lưu Custom Report Để sử dụng Custom Report cho phương pháp hành ta phai lưu phương pháp hành lại ta sử dụng cho lần in sau - Chọn File > Method > Save Kể từ lúc Custom report lưu phương pháp Khi phương pháp dùng, mẫu Report tự động cập nhận thông tin cho phân tích hành Muốn sử dụng mẫu Custom report cho phương pháp khác ta phải lưu Report theo trinh tự sau: Đang cửa sổ Method custom report Chọn File > Report template > Save as > Xuất cửa sổ sau: Nhập tên report với phần mở rộng rep - Save in : chọn thư mục Template - File name: Nhập tên File report với phần mở rộng “REP” - Nhấn Save Khi dùng phương pháp khác để thực phân tích, muốn sử dụng mẫu Custom Report này, chọn File > Report Template > Open Report > Open Như hình sau EZchrom Elite Muốn tên file Report xuất menu Report Ta thực lưu Report với phần mở rộng “.srp” (Vd: Report 2H instrument.srp) thư mục Template Sau copy file sang thư mục Ezchrom Elite khởi động lại phần nềm Ezchrom Elite BƯỚC 8: TẮT HỆ THỐNG Sau kết thúc trình phân tích Ta thực tắt hện thống sau: Tắt đèn từ cửa sổ phần mềm (nên tắt đèn trước tắt máy phút để đảm bảo đèn làm mát) Đóng tất cửa sổ phần nềm EZchrom Elite Tắt Module hệ thống nên ngừng bơm trước tắt công tắc bơm Tắt PC > Printer Chú ý: - Nếu không sử dụng hệ thống thời gian dài, ta phải tháo cột cất vào hộp, trước cất cột phải chạy rửa cột pha động thích hợp (Shiping solvent) Nút đầu cột đầu bịt kèm với cột - Thường xuyên thay nước cất, không nên sử dụng lâu ngày Khi dùng lại cần phải lọc qua màng lọc 0.45um rung siêu âm loại bọt khí cho dung mơi trước dùng EZchrom Elite ... phải phương pháp hành hay không, thông thường Ezchrom Elite mặc định phương pháp hành - Data Path: Đường dẫn đến thư mục cần lưu file liệu thông thường Ezchrom Elite mặc định data hành - Data File... chuẩn Nồng độ xác định bỉ Ezchrom Elite vào diện tích peak chiêu cao Đây q trình định tính định lượng hệ thống VD : Sắc đồ mẫu chuẩn mẫu phân tích - Sắc đồ mẫu chuẩn : EZchrom Elite - Sắc đồ mẫu... ký đồ EZchrom Elite - Bỏ phần dư bên peak cần phân tích: click vào phía cơng cụ chọn vào biểu tượng intergration off Sau chọn phần cần bỏ đi: Và nhấn vào analyze now để hiển thị phần bỏ EZchrom