TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BỘ MƠN SINH – DI TRUYỀN BÀI GIẢNG SINH HỌC (LƯU HÀNH NỘI BỘ) NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC HÀ NỘI - 2010 CHỦ BIÊN: PGS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN NHÓM BIÊN SOẠN: PGS.TS Lương Xuân Hiến PGS.TS Trịnh Hữu Vách ThS Hà Xuân Anh ThS.Nguyễn Nam Thắng ThS Lê Việt Hà LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình sinh học biên soạn lại lần cho học viên sau đại học trường Đại học Y Thái Bình Nội dung giáo trình dựa sở tham khảo tài liệu sinh học di truyền y học Trường Đại học Y Hà Nội, Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh tài liệu khác Trong khuôn khổ thời gian ấn định, nội dung sách giới thiệu đại cương vấn đề sinh học giúp học viên hiểu vấn đề liên quan đến y học như: tế bào, di truyền, sinh học phân tử Trong trình biên soạn giáo trình này, nhận nhiều giúp đỡ Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo, đồng nghiệp trường Đại học Y Thái Bình sở đào tạo khác Chúng xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, động viên quý báu Chắc chắn khó tránh khỏi thiếu sót biên soạn, chúng tơi mong nhận nhiều góp ý học viên đồng nghiệp để sửa đổi, bổ sung cho lần tái tới hoàn chỉnh Trân trọng cám ơn CÁC TÁC GIẢ MỤC LỤC Lời nói đầu Mục lục Những đặc tính chung sống Các đại phân tử sinh học Đại cương tế bào Cấu trúc, chức tế bào Vận chuyển vật chất qua màng tế bào Quang hợp hô hấp tế bào Tổng hợp acid nucleic Sinh tổng hợp protein điều hòa sinh tổng hợp protein Sự phân chia tế bào Bệnh rối loạn vật chất di truyền Tư vấn di truyền Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng y học Tài liệu tham khảo NHỮNG ĐẶC TÍNH CHUNG CỦA SỰ SỐNG MỤC TIÊU: Sau nghiên cứu phần này, học viên có khả năng: - Chứng minh sống đa dạng thống - Trình bày tính chất đặc trưng cho sống - Trình bày biểu phân biệt sống với giới vô sinh Sự đa dạng thống sống Quanh ta, nơi có sinh vật: cỏ, côn trùng, tôm, cá, ếch, nhái, rắn, rùa, chim, thú các vi sinh vật Các nhà khoa học ước tính có khoảng triệu loài sinh vật sống hành tinh Về mặt sinh học, người loài khối đa dạng mn màu sắc Sự đa dạng sống biểu hai mặt: đa dạng loài hệ thống thứ bậc từ thấp lên cao nhiều mức tổ chức khác 1.1 Đa dạng lồi Mỗi lồi sinh vật có đặc điểm riêng bên ngoài, cấu trúc bên biểu sống đặc thù Ngay xét bề ngoài, khác thể rõ nhiều mặt: kích thước, màu sắc, hình dáng, trọng lượng Về tuổi thọ, vi khuẩn E coli hệ dài 20 phút, cổ thụ sống nghìn năm Sự đa dạng đến mức xét chi tiết khơng có hai sinh vật giống 1.2 Hệ thống thứ bậc nhiều mức tổ chức khác Một nét đặc thù giới sinh vật sống biểu nhiều mức độ tổ chức từ thấp phân tử đến cao toàn sinh hành tinh Có thể kể mức tổ chức chủ yếu sau: Phân tử - đại phân tử Tế bào - đơn vị sở sống Cơ thể - đơn vị sở tồn Quần thể - đơn vị sở tiến hóa phân loại Lồi - đơn vị tiến hóa Quần xã (community) - tồn nhiều loài sinh vật với vùng định Hệ sinh thái (ecosystems) - đơn vị sinh thái Sinh - sống hành tinh 1.3 Sự thống Sự đa dạng khắp nơi dễ nhận thấy, thống biết từ phân tích khoa học Ngồi gắn bó mức độ tổ chức vừa nêu trên, thống biểu hệ thống phân loại giống cấu trúc chế vi mô Dựa vào đặc điểm hình thái giống xếp sinh vật vào nhóm định gọi nhóm phân loại Nhóm phân loại lớn nhất, bao trùm, gọi giới Ví dụ, giới thực vật, giới động vật, giới nấm Mỗi giới chia thành nhóm nhỏ gọi giới phụ Tuần tự ta có phân chia nhỏ dần sau: giới - giới phụ - lớp - - họ - giống - loài Tất sinh vật xếp vào hệ thống phân loại theo đơn vị kể Đây chứng tiến hóa sinh giới từ tổ tiên chung ban đầu Sự thống hay giống sinh vật thể rõ thành phần cấu tạo nên thể Thành phần hóa học sinh vật giống từ nguyên tố tham gia chất sống đến bốn nhóm chất hữu cơ: gluxit, lipid, protein axit nucleic Tất sinh vật có cấu tạo tế bào Tế bào cấu trúc nhỏ có biểu đầy đủ tính chất đặc trưng sống Nó đơn vị sở sống Ở mức vi mô (mức độ tế bào mức độ phân tử), biểu sống tất sinh vật giống Càng sâu nghiên cứu sinh học phân tử, có thêm nhiều chứng nguồn gốc chung giới sinh vật Sự đa dạng dễ dàng giải thích sở thay đổi tỷ lệ nguyên tố chất, thành phần đại phân tử loại tế bào, cấu trúc số lượng tế bào sinh vật khác Tóm lại, giới sinh vật đa dạng thống đa dạng giới sinh vật bắt nguồn từ tổ tiên chung ban đầu Sự khác biệt sinh vật giới vô sinh Các yếu tố vật chất lượng tồn giới sinh vật giới vô sinh, nhiên biểu yếu tố giới có đặc điểm khác Chúng ta tìm hiểu khác tìm hiểu yếu tố có giới sinh vật - thơng tin 2.1 Vật chất - Cấu trúc phức tạp tổ chức tinh vi Đây tính chất dễ nhận thấy Các sinh vật tạo nên từ nguyên tố vốn có tự nhiên, cấu trúc bên phức tạp chứa vô số hợp chất hóa học đa dạng Ví dụ: vi khuẩn Escherichia coli (E coli), sinh vật đơn bào nhỏ bé với kích thước - micromet (1 phần nghìn milimet), nặng 2.10-6 mg (2 phần triệu miligram) chứa khoảng 40 tỷ phân tử nước với 5.000 loại hợp chất hữu khác Riêng protein có khoảng 3000 loại với cỡ 1.000.000 phân tử, mà phần lớn cấu trúc chúng chưa biết Nếu tính người số loại protein khác khơng phải 3.000 E coli, số hoạt động giống Thậm chí hai người protein không giống nên dễ xảy tượng không dung hợp mô lấy mô người ghép sang người khác Mỗi sinh vật có protein axit nucleic riêng biệt cho Các chất phức tạp thể sống hình thành nên cấu trúc tinh vi thực số chức định Không cấu trúc màng, nhân tế bào mà loại đại phân tử có vai trò quan trọng định Trong giới sinh vật hồn tồn nói chức loại phân tử Ví dụ bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gọi "bệnh phân tử" 600 axit amin tạo nên chuỗi (3 hemoglobin bị thay đổi axit amin vị trí thứ (axit glutamic bị thay valin) Trong gần 600 axit amin bị thay gây bệnh ảnh hưởng đến khả sống cá thể Rõ ràng thể sống, loại phân tử quan trọng Điều giới vơ Tế bào E coli nhỏ bé với cấu trúc tổ chức phức tạp có hoạt động sống cao, 20 phút nhân đơi tạo tế bào giống hệt với tế bào ban đầu 2.2 Năng lượng - Sự chuyển hóa phức tạp Đặc điểm thứ hai thể sống khả thu nhận lượng từ mơi trường bên ngồi biến đổi để xây dựng trì tổ chức phức tạp đặc trưng cho sống Một số sinh vật lấy chất đơn giản C02, N2, H20 làm nguyên liệu ánh sáng mặt trời làm nguồn lượng Năng lượng lượng tử ánh sáng chuyển thành lượng hóa học chất hữu xanh, từ lưu chuyển sang sinh vật khác thông qua chuỗi thức ăn Sự chuyển hóa vật chất lượng tế bào diễn phức tạp, ví tế bào "nhà máy hóa học đặc biệt‖, nhiều phản ứng hóa học đồng thời xảy với độ nhanh nhạy, xác có hiệu suất cao, lại điều hòa cách hợp lý lúc, chỗ Tế bào nhận lượng bên vào dạng lượng hóa học (các chất hữu thức ăn), sau cải biến để thực cơng hóa học q trình tổng hợp thành phần tế bào, công cho vận chuyển vào tế bào công học cho co di chuyển Những cặn bã dư thừa thải ngồi Vật chất vơ sinh khơng có khả sử dụng lượng bên ngồi để trì cấu trúc thân sinh vật Ngược lại, vật chất vô sinh hấp thụ lượng bên ngồi ánh sáng, nhiệt, chuyển sang trạng thái hỗn loạn sau tỏa xung quanh Tóm lại: Cơ thể hệ thống hở khơng cân bằng, có khả thu nhận lượng từ bên vào, sử dụng vật chất lượng với hiệu cao hẳn so với phần lớn máy móc mà người chế tạo Trong tế bào luôn diễn hai trình đồng hóa dị hóa Thơng qua q trình đồng hóa, vật chất lấy từ mơi trường sử dụng để xây dựng cấu trúc tế bào thể Thơng qua q trình dị hóa tế bào phân hủy chất hữu để tạo lượng cung cấp cho hoạt động tế bào thể 2.3 Thơng tin - Ổn định, xác liên tục Chứa truyền đạt thơng tin tính chất tuyệt diệu giới sinh vật Tính chất không tồn giới chất vô sinh can thiệp người Thơng tin liên quan đến trình sống chủ yếu sinh sản, phát triển, tiến hóa phản ứng thích nghi Trong thể sống, thơng tin có hai dạng chủ yếu: thông tin di truyền thông tin thích nghi * Thơng tin di truyền Nhờ có thơng tin, tế bào có khả tự sinh sản tạo hệ giống hệt cha mẹ Sự sinh sản gắn liền với tính di truyền biểu rõ qua nhiều hệ Thế hệ trước truyền cho hệ sau khơng phải tính trạng mà chương trình phát triển lồi sinh vật gọi thông tin di truyền Thông tin di truyền mã hóa loại nucleotid dạng trình tự thẳng phân tử ADN biểu dạng cấu trúc không gian ba chiều phân tử protein cấu trúc tế bào Thông tin di truyền biểu hệ sau trình phát triển cá thể Mỗi sinh vật q trình lớn lên lập lại xác giai đoạn phát triển cha mẹ Con người hợp tử, phôi, thai, sinh ra, mọc răng, biết nói, , trưởng thành, già, chết Bộ máy di truyền chi phối biểu sống: tái tạo cấu trúc tinh vi, điều hòa việc thực hàng loạt chuỗi phản ứng hóa học phức tạp giúp thể phản ứng thích nghi với mơi trường Có định nghĩa rằng: "Sự sống - trì tái tạo tích cực cấu trúc đặc thù kèm theo tiêu tốn lượng" Thông tin di truyền tinh vi truyền đạt cho nhiều hệ nối tiếp với ổn định cao nhờ chế chép xác phân tử ADN chế phân chia gen cho tế bào trình phân bào Cá thể sinh vật đến lúc chết, thông tin di truyền lại truyền cho hệ sau biến đổi tiến hóa Nhờ nối tiếp di truyền mà sống từ xuất dòng liên tục tất sinh vật trái đất có quan hệ họ hàng với nhau, bắt nguồn từ tổ tiên chung ban đầu * Thơng tin thích nghi Ở động vật nhiều thông tin liên quan đến hoạt động hệ thần kinh Một biểu rõ ghi nhận thơng tin trí nhớ sinh vật Có nhiều chế tinh vi xác nhanh nhạy khác để thu nhận thơng tin loài sinh vật giúp chúng phản ứng chủ động với mơi trường xung quanh Đó ánh sáng đom đóm, chất dẫn dụ côn trùng, âm tiếng kêu chim, điệu múa đường lấy phấn hoa loài ong Thực vật có thơng tin thích nghi không nhanh nhạy động vật: rễ mọc hướng đến chỗ có nhiều chất dinh dưỡng, mọc phía ánh sáng Thơng tin thích nghi lúc đầu xuất đời sống cá thể tạo ưu đấu tranh sinh tồn nên chọn lọc tự nhiên giữ lại ghi thêm vào thông tin di truyền sinh vật Do vậy, thơng tin thích nghi chịu chi phối gen lưu truyền Bộ gen sinh vật tiến hóa cao mang nhiều thơng tin di truyền tổ tiên Điếu thể rõ lặp lại ngắn gọn giai đoạn tổ tiên phát triển phôi sinh vật bậc cao: phơi người lúc đầu giống cá, bò sát, có lơng Tiến hóa thích nghi tạo nên đa dạng sinh vật ngày từ tổ tiên ban đầu Trong tiến hóa có thừa kế Các biểu thể sống Với đặc điểm vật chất, lượng thông tin đặc trưng vậy, giới sinh vật có nhiều biểu đặc thù khác hẳn giới vô sinh 3.1 Trao đổi chất (Metabolism) Để tồn tế bào phải thực liên tục hàng loạt phản ứng hóa học để phân huỷ chất dinh dưỡng cung cấp lượng vật liệu cho sinh tổng hợp cho trình sống khác tăng trưởng, vận động, sinh sản Toàn hoạt động hóa học thể sinh vật gọi trao đổi chất Khi trao đổi chất dừng thể sinh vật chết Trao đổi chất gồm hai q trình: đồng hóa dị hóa Đồng hóa (anabolism) q trình sinh vật thu nhận lượng chất hóa học từ mơi trường để xây dựng nên thành phần thể Dị hóa q trình sinh vật phân hủy chất hữu cơ, tạo lượng cho hoạt động thể 3.2 Sự nội cân (Homeostasis) Quá trình trao đổi chất phức tạp, điều hòa hợp lý để trì hoạt động bên tế bào mức cân ổn định trạng thái định Ví dụ, nhiệt độ thể người bình thường ln trì 37°c dù thời tiết có thay đổi nóng lạnh khác Xu hướng thể sinh vật tự trì mơi trường bên ổn định gọi nội cân thực chế nội cân (homeostatic mechanisms) Các chế nhạy cảm hữu hiệu Ở sinh vật có mức phát triển cao, chế đảm bảo nội cân phức tạp 3.3 Sự tăng trưởng (Growth) Sự tăng trưởng tăng khối lượng chất sống thể sinh vật Nó bao gồm tăng kích thước tế bào tăng số lượng tế bào tạo nên thể Sự tăng trưởng tế bào khác nhiều so với lớn lên tinh thể dung dịch muối Một đặc điểm tăng trưởng diễn ra, phần tế bào hay thể hoạt động bình thường Một số sinh vật phần lớn thực vật có thời gian tăng trưởng kéo dài lâu cổ thụ nghìn năm Hầu hết động vật có giới hạn tăng trưởng định, kích thước đạt tối đa lúc sinh vật trưởng thành 3.4 Sự vận động Các sản phẩm quặng mỏ: (peroxythydro - clorua sắt) hố chất phòng thí nghiệm (formaldehyt - dibenzoan thraxen) Các hố mỹ phẩm: thuốc nhuộm tóc v.v chất gây đột biến, người nghiện rượu, nghiện thuốc tần số sai lạc NST SCE (sisterchromatid exchanges) cao nhóm người bình thường Hậu chất độc: mù tạc ni tơ dioxin sử dụng chiến tranh làm tỷ lệ chết sơ sinh dị dạng sơ sinh tăng cao Tác nhân sinh vật học-, virus vượt qua hàng rào rau thai để đến mô bào thai Bệnh rubêon bệnh nhiễm virus gây quái thai trầm trọng Virus viêm gan thông báo có gây số dị dạng bẩm sinh Toxoplasma ký sinh gây hậu nghiêm trọng cho thai nhi: dị tật mắt, viêm hắc võng mạc, não úng thuỷ v.v 3.4 Tiến hành xét nghiệm Tuỳ bệnh, tật, hội chứng cụ thể, ta định xét nghiệm cần thiết sau đây: 3.4.1 Các xét nghiệm di truyền tế bào, - Nuôi cấy tế bào để đánh giá NST Người ta nuôi cấy lympho bào, nguyên bào sợi (fibroblast); chẩn đốn trước sinh ni cấy tế bào tua rau, tế bào nước ối, với kỹ thuật nhuộm giêm sa thông thường kỹ thuật băng G - R - c - T phát sai lạc số lượng, cấu trúc NST - Xét nghiệm vật thể Barr, vật thể Y nhằm phát rối loạn liên quan đến số lượng, cấu trúc NST X Y - Xét nghiệm nếp vân da số trường hợp có biểu nếp vân da hội chứng Down, bệnh tâm thần phân liệt v.v Phương pháp di truyền tế bào có giá trị để chẩn đốn bệnh rối loạn số lượng, cấu trúc NST 3.4.2 Các xét nghiệm chẩn đoán bệnh di truyền mức phân tử Phân loại bệnh phân tử chia thành nhóm lớn: - Bệnh phân tử enzyme - Bệnh phân tử enzyme Hiện người ta phát hàng trăm bệnh mức phân tử Tuỳ bệnh phải dùng phương pháp thích hợp Đối với bệnh enzyme dẫn đến rối loạn chuyển hoá chất axit amin, gluxit, lipid, purin, pirimidin, chất khống v.v Để chẩn đốn nhóm bệnh người ta dùng kỹ thuật định lượng trực tiếp enzyme sản phẩm bất thường rối loạn chun hố V.V Ví dụ rối loạn chuyển hoá axit amin bệnh phenylxeton niệu phát kỹ thuật định lượng phenylalanin huyết tương dịch não tuỷ: Ở người bệnh huyết tương 20mg - 60mg/100ml; dịch não tuỷ 7mg/100ml (người bình thường huyết tương - 3mg/100ml, dịch não tủy khơng q 0,4mg/100ml) Ngồi với FeCl3 ta phát phenylpyruvic nước tiểu Rối loạn chuyển hoá gluxit: ví dụ bệnh galactose huyết Để chẩn đốn bệnh phát người dị hợp tử, người ta định lượng hoạt tính enzyme galacto transferase hồng cầu Rối loạn chuyển hố lipid: ta gặp rối loạn tăng lipid giảm lipid huyết tích spingolipid Trong bệnh buigergrutz nhờ định lượng lipoprotein lipaza chẩn đoán bệnh Bệnh rối loạn chuyển hoá purin: phát định lượng axit uric huyết Ví dụ bệnh goutte lượng axit uric người bình thường 5mg/100ml huyết thanh, người bệnh I 15mg/100ml huyết Các bệnh yếu tố đông máu: ta gặp số bệnh có tần sơ gen tương đối cao Ví dụ hemophilie A (tần số gen bệnh - 1,7 X 10-4) thiếu yếu tố AHG (antihemophilie globulin) hay gọi yếu tố VIII Bệnh hemophilie B tần số gen bệnh (4 - X 10-5) thiếu yếu tô" kristmans (yếu tố IX); Bệnh khơng có fibrinogen tần số X 10-3 Người bệnh khơng có hạ fibrin xuống 0,5g/lít Bệnh hemoglobin (Hb): Được nhiều tác giả nghiên cứu: ví dụ bệnh HbC; HbE; bệnh thalassemia v.v phương pháp điện di Hb ta phát người bệnh người dị hợp tử Trong xét nghiệm sinh hoá, kỹ thuật định lượng alpha - feto protein (AFP) máu mẹ sử dụng rộng rãi AFP gluco protein nguồn gốc bào thai (sản xuất gan ống tiêu hoá bào thai) Chất tiết qua nước tiểu vào dịch ối khuếch tán vào thể mẹ - Có thể định lượng chất huyết mẹ nhờ kỹ thuật miễn dịch phóng xạ - Phụ nữ mang thai cao phụ nữ bình thường, tăng vào tuần 12 tốỉ đa 35 38 tuần, giảm ngày đẻ - Thường xét nghiệm vào tuần 14-16 AFP tăng đa thai, thai bất thường, dị tật hệ thần kinh trung ương, dị tật tim, bệnh chuyển hố Phương pháp khơng gây hại nên quần thể có tỷ lệ cao bệnh bất thường ống thần kinh, tây bắc Pháp 4% phụ nữ mang thai tuần 17 định lượng AFP Tùy bệnh hội chứng ta có xét nghiệm thích hợp để chẩn đốn Với tiến khoa học, phương pháp phân tích ADN dùng ADN probes đặc hiệu, dùng kỹ thuật Southern blotting PCR (Polymerase chain reaction) sequencing v.v Người ta chẩn đoán SC) bệnh; đặc biệt số bệnh mức phân tử cách nhanh chóng xác 3.4.3 Kết luận - Xác định bệnh, tật, hội chứng gì? - Bệnh di truyền không? Nếu di truyền theo chế, qui luật nào? - Tiên lượng bệnh? Khả điều trị phòng bệnh? Hướng trị liệu cho bệnh nhân? - Xác suất sinh lành, bị bệnh, mang gen bệnh - Đối với nhóm người cần tư vấn vấn đề thường chia nhóm: + Yên tâm chuẩn bị điều kiện tốt để mang thai (nhóm người có xác suất sinh bị bệnh vơ nhỏ) + Có thai cần giúp đỡ y học xác suất sinh bị bệnh nhóm nguy thấp < 5% + Cần cân nhắc có thai khơng vì: - Xác suất nguy cờ sinh bị bệnh lớn (xác suất sinh bị bệnh nhóm nguy cao > 5%) - Xác suất nguy mắc bệnh lớn trường hợp bố mẹ người bị bệnh mang NST chuyển đoạn mang gen bệnh Những người mẹ mang thai ngồi 35 tuổi v.v cần chẩn đốn trước sinh Lưu ý: trường hợp mới, gặp, nên hội chẩn: qua thực tế nên rút kinh nghiệm số bệnh định để phù hợp lý thuyết thực tế Nên kết hợp tâm lý y học luật pháp để bảo vệ hạnh phúc cho người bệnh Ngồi mục đích nêu trên, tư vấn đề di truyền cần phát vấn đề sức khoẻ nhân dân, đề đạt với Nhà nước để có sách thích hợp Ví dụ bệnh di truyền liên quan đến nghề nghiệp, tư vấn cho tổ chức xã hội, tổ chức nhân đạo, từ thiện giúp đỡ bệnh nhân gia đình bệnh nhân hữu ích MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC MỤC TIÊU: Sau học xong phần này, học viên trình bày được: - Phương pháp tách chiết acid nucleic - Một số enzym kỹ thuật di truyền - Các phương pháp lai phân tử - Phương pháp PCR - Phương pháp giải trình tự gen Tách chiết acid nucleic 1.1 Tách chiết ADN Các bước để tách chiết ADN sau: - Phá vỡ màng tế bào màng nhân (ở tế bào Eukaryota) nhờ nghiền tế bào, mô dung dịch chất tẩy mạnh proteinase (thường SDS Proteinase K) - Loại bỏ protein: hòa tan dịch nghiền dung dịch phenol-chloroform Hỗn hợp phenol-chloroform làm biến tính protein làm khơng hòa tan nước ADN hòa tan nước thu nhận nhờ ly tâm - Kết tủa ADN ethanol isopropanol thu nhận lại ly tâm Sau ADN rửa ethanol 70% 1.2 Tách chiết ARN Các bước để tách chiết ARN toàn phần sau : - Nghiền tế bào, mô dung dịch chất tẩy mạnh (SDS), tác nhân gây biến tính protein mạnh (Guanidinium thiocianate), chất khử (2mecaptoethanol) (hai chất sau để ức chế ARNse nội bào tách protein khỏi ARN) - Protein loại khỏi mẫu nhờ xử lý phenol-chlorofom ly tâm - ARN hòa tan nước tủa ethanol thu nhận lại ly tâm Việc tách loại ARN từ ARN toàn phần sau : - Với rARN tARN có kích thước xác định tách điện di ly tâm, - Với mARN kích thước khơng xác định tách nhờ sắc ký lực cột oligoT-cellulose Axit nucleic tinh nhờ sắc ký, điện di hay siêu ly tâm Một số enzyme kỹ thuật di truyền 2.1.Enzyme giới hạn (RE: restriction enzym) Enzyme giới hạn enzyme có khả nhận biết cắt ADN mạch kép trình tự xác định Thường dùng enzyme giới hạn loại II, có khả cắt vị trí nhận biết Mỗi RE nhận biết trình tự đặc trưng Trình tự nhận biết có đặc điểm đọc xi ngược nhau: Ví-dụ: enzyme EcoRI có trình tự nhận biết là: 5‘GAATTC3‘ 3‘ CTTAAG 5' RE cắt ADN tạo đầu dính Ví dụ: enzyme EcoRI cắt tạo đầu dính: G5‘ AATTC3‘ 3‘ CTTAA G 5‘ Nếu ADN nguồn gốc khác cắt enzyme có khả kết hợp làm thơng qua đầu dính 2.2 ADN Polymerase ADN polymerase có khả tổng hợp ADN từ ADN sợi đơn làm khuôn mẫu theo chiều 5‘-3‘, cần có mồi Mồi đoạn ARN (hoặc ADN) ngắn có khả bắt cặp với đầu ADN khuôn Kết tạo sợi ADN kép có mạch tổng hợp bổ sung với sợi khn Ví dụ ADN polymerase I, II, III Trong số ADN polymerase có loại chịu nhiệt, ví dụ Taq polymerase dùng kỹ thuật PCR, có loại tổng hợp ADN từ khuôn ARN Reverse Transcriptase, Các phƣơng pháp lai phân tử 3.1 Khái niệm lai phản tử Khi đun nóng ADN mạch kép chuyển thành mạch đơn nhiệt độ Tm Khi nhiệt độ hạ xuống từ từ hai mạch đơn bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử với hai đặc điểm: Đặc hiệu tuyệt đối: tái bắt cặp xảy hai trình tự hồn tồn bổ sung cho dù chúng có hàng triệu phân tử khác Các trình tự bổ sung ADN ARN dẫn đến hình thành phân tử: ADN-ADN, ARN-ARN hay ADN-ARN 3.2 Một sổ phương pháp tai phân tử 3.2.1 Phương pháp Southern Blot Dùng để xác định vị trí trình tự ADN gen, hay đoạn ADN kích thước nhỏ ADN plasmit, phage, Kỹ thuật Southern mô tả năm 1975 gồm bước sau: -ADN gen cắt thành đoạn kích thước khác nhờ hay nhiều enzyme giới hạn đoạn phân tách dựa vào kích thước qua điện di gel agarose - ADN biến tính (tách thành mạch đơn gel chuyển lên màng lai Trong q trình chuyển, vị trí đoạn giữ nguyên - ADN cố định màng lai đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Sau trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ mẫu dò thừa khơng bắt cặp - Cuối cùng, dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi để định vị phân tử lai Ứng dụng: - Lập đồ giới hạn gen - Phát đa dạng trình tự (fragment polymorphysm) gen chủng hay cá thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng - Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp gen chúng làm thay đổi đồ giới hạn chúng 3.2.2 Lai chỗ huỳnh quang (FISH) Trong kiểu lai chỗ, axit nucleic cần tìm khơng cần phải tách khỏi mơ hay tế bào Q trình lai với mẫu dò cho phép xác định xác vị trí trình tự cần tìm tế bào hay nhiễm sắc thể Ví dụ: Lai nhiễm sắc thể Làm tiêu nhiễm sắc thể kỳ Loại bỏ AHN Protein Biến tính ADN thành sợi đơn Lai với mẫu dò có đánh dấu huỳnh quang Soi kính hiển vi huỳnh quang để phát Phƣơng pháp PCR 4.1 Nguyên tắc Tất ADN polymerase hoạt động tổng hợp mạch ADN từ mạch khn cần có mồi Mồi đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn ADN nối dài mồi để hình thành mạch bổ sung với mạch khn Nếu ta có hai mồi chun biệt bắt cặp với hai đầu trình tự ADN, ta tổng hợp đoạn ADN nằm hai mồi 4.2 Các bước thực phản ứng PCR Bước 1: Biến tính: Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử ADN biến tính nhiệt độ khoảng 94- 95°c khoảng 30 giây đến phút Bước 2: Giai đoạn lai: Nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn (thực tế khoảng 40-70°C) kéo dài từ 30 giây đến phút Bước Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ tăng lên đến 72°c giúp cho ADN polymerase (chịu nhiệt) tổng hợp ADN Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài đoạn ADN cần khuếch đại, khoảng từ 30 giây đến nhiều phút Chu kỳ gồm bước lặp đi, lặp lại nhiều lần lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Sự tăng theo cấp sô nhân: sau 30 chu kỳ số lượng mẫu tăng khoảng triệu lần 4.3 ứng dụng kỹ thuật PCR Dùng để phát trình tự biết có gen hay khơng Ví dụ: Gen TDF qui định giới tính nam, nằm nhiễm sắc thể Y Trong trường hợp khơng rõ giới tính dùng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với gen TDF để nhận biết khuếch đại đoạn đặc hiệu gen Nếu phản ứng PCR xảy có mặt gen TDF, khơng có TDF âm tính Những cặp mồi đặc hiệu cho gen bệnh dùng để phát người có mang gen bệnh hay không Tương tự người ta dùng PCR để phát xem có mặt hay không vi khuẩn gây bệnh mẫu bệnh phẩm qua khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu cho vi khuẩn Dùng để sản xuất lượng lớn mẫu dò Nghiên cứu ARN nhờ kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR): trước hết ARN chuyển thành cADN nhò Reverse Transcriptase, sau cADN khuếch đại nhờ Taq polymerase Định lượng nhờ kỹ thuật Real Time PCR Giải trình tự (sequencing) 5.1 Các phương pháp giải trình tự ADN 5.1.1 Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert Đây phương pháp sử dụng hóa chất phù hợp để cắt phân tử ADN nucleotide đặc hiệu Để thực phương pháp người ta sử dụng enzyme giới hạn để cắt ADN thành đoạn có kích thước khoảng 500 bp Các đoạn ADN có trình tự giống đánh dấu đồng vị phóng xạ (32P) đầu 5‘ đầu 3‘ Nếu đánh dấu đầu 5‘ người ta dùng enzyme alkalin phosphatase để cắt nhóm phosphate đầu 5‘, bổ sung [g32P]ATP để gắn nhóm phosphate đánh dấu vào đầu 5‘ với xúc tác enzyme polynucleotide kinase Nếu đánh dấu đầu 3‘ người ta dùng [a32P]dATP enzyme terminal tranferase để gắn gốc phosphate đánh dấu vào đầu 3‘ Các đoạn ADN đánh dấu chia làm tuýp, tuýp chịu xử lý hóa học khác làm đứt mạch hay loại base Quá trình xử lý bao gồm bước: Làm biến đổi base ADN hóa chất: - Dùng dimethyl sunfate (pH = 8) để gắn nhóm methyl vào vị trí N7 G - Trong điều kiện pH = 2, dimethyl sunfate gắn nhóm methyl vào vị trí N7 G N3 A - Xử lý hydrazine làm mở vòng pyrimidine C T - Cũng xử lý với hydrazine điều kiện nồng độ muối cao (1,5M NaCl) vòng pyrimidine c mở Cắt đứt khung đường — phosphate vị trí base bị biến đổi: Tại vị trí base bị biến đổi, khung đưòng - phosphate dễ dàng bị cắt đứt xử lý với piperidine 90° c Quá trình xử lý thực để trung bình đoạn nucleotide đứt base Qua xử lý, tuýp chứa số đoạn nucleotide có chiều dài khác Khi điện di gel polyacrylamide, đoạn nucleotide có chiều dài ngắn di chuyển xa phía cực dương Dựa vào kết điện di xếp đoạn ADN theo thứ tự từ ngắn đến dài có điểm mốc chuẩn đầu 5‘ (hoặc đầu 3‘) mang dấu phóng xạ p32 phát nhờ phương pháp phóng xạ đồ tự ghi Tổng hợp kết điện di tuýp, biết trình tự nucleotide phân tử ADN kể từ đầu 5‘ (hình dưới) Hình Các bước giải trình tự DNA phương pháp Maxam - Gilbert 5.1.2 Phương pháp enzyme (phương pháp dideoxy Sanger) Phương pháp dựa phản ứng tổng hợp DNA với xúc tác enzyme ADN polymerase, tương tự phản ứng PCR Tuy nhiên, thành phần phản ứng dNTP người ta bổ sung lượng nhỏ ddNTP đánh dấu huỳnh quang, cấu tạo, ddNTP nhóm — OH vị trí 3‘, khơng tạo liên kết với nhóm 5‘- phosphate Khi thực phản ứng, trình kéo dài chuỗi polynucleotide dừng lại có ddNTP đến gắn vào đầu 3‘-OH chuỗi polynucleotide Như sản phẩm phản ứng bao gồm chuỗi polynucleotide có chiều dài khác phân biệt điện di Chất huỳnh quang đánh dấu ddNTP giúp phát nucleotide cuối thuộc loại 5.2 ứng dụng Là công cụ giúp người hiểu chất gen đến nucleotide Là phương pháp sử dụng để xác định trình tự nucleotid gen số virus (viêm gan B, SV40, HIV-1 ) vi khuẩn (E.coli: 50% ), nấm men, số động vật, thực vật đặc biệt người Các phương pháp biến đổi vật liệu di truyền Các phương pháp biến đổi vật liệu di truyền bao gồm hai bước Biến đổi vật liệu di truyền: loại bỏ hay gắn thêm đoạn ADN vào đoạn gen cần nghiên cứu biến đổi gen cách có định hướng Chuyển vật liệu di truyền biến đổi vào tế bào nuôi 6.2 ứng dụng Để xác định vai trò trình tự ADN hoạt động sống Liệu pháp gen điều trị bệnh di truyền TÀI LIỆU THAM KHẢO Trịnh Văn Bảo cs Các nguyên lý sinh học Nhà xuất Y học, Hà Nội - 2002 Trịnh Văn Bảo Di dạng bẩm sinh Nhà xuất Y học, Hà Nội-2004 Nguyễn Như Hiển Sinh hoc đại cương NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội-2005 Nguyễn Như Hiền, Ngô Giang Liên Di truyền tê bào NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội 2007 Đặng Văn Ngữ, Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo, Phạm Đức Phùng Sinh học Nhà xuất Y học, Hà Nội-1987 Robert F Weaver (2002) Molecular Biology, second edition Leland H Hartwell (2000) Genetics: from genes to genomes Gerald c Karp (2002) Cell and molecular biology Peter H Raven and George B Johnson (1996) Biology, fourth edition Steven L Gersen and Martha B Keagle (1999) The Principles of Clinical Cytogenetics NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC BÀI GIẢNG SINH HỌC Chịu trách nhiệm xuất HOÀNG TRỌNG QUANG Biên tập sửa can: BÙI THANH KHIÊT Trình bày bìa: Kỹ thuật vi tính: CHU HÙNG BÙI THANH KHIÊT ... trình sinh học biên soạn lại lần cho học viên sau đại học trường Đại học Y Thái Bình Nội dung giáo trình dựa sở tham khảo tài liệu sinh học di truyền y học Trường Đại học Y Hà Nội, Đại học Quốc... Sự sinh sản Biểu sống dễ nhận thấy tất loài sinh vật Từ lâu, người biết: "sinh vật sinh sinh vật" "tế bào sinh tế bào" Các sinh vật nhỏ bé vi khuẩn lại có tốc độ sinh sản nhanh Có hai kiểu sinh. .. sống - Lý sinh học (biophysics) nghiên cứu trình vật lý thể sống - Sinh thái học (ecology) nghiên cứu mối quan hệ sinh vật với môi trường - Vi sinh học (microbiology) nghiên cứu giới vi sinh vật