Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 trong một số nhuyễn thể 2 mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ

228 31 0
  • Loading ...
1/228 trang
Tải xuống

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 14/12/2018, 10:56

Vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề có tầm quan trọng thường trực cho việc đảm bảo chất lượng cuộc sống của cả cộng đồng và đang nhận được sự quan tâm sát sao của toàn xã hội tại Việt Nam hiện nay. Trong lĩnh vực này, nổi cộm hơn cả là việc thực phẩm bị “nhiễm bẩn” bởi các tác nhân gây hại tới sức khỏe con người có nguồn gốc rất đa dạng, song tựu chung lại có thể phân loại thành 2 nhóm lớn: Thứ nhất, đó là những chất độc hại nhiễm vào thực phẩm do các hoạt động vô ý hay cố ý của con người, như lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật trong canh tác cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hay việc lạm dụng kháng sinh, chất kích thích tăng trưởng trong nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc, hoặc những chất thải độc hại ngấm vào thực phẩm qua các hoạt động khác của con người như sản xuất công nghiệp, xả thải công nghiệp, rác thải sinh hoạt bừa bãi ra khí quyển, nguồn nước... Thứ hai là những độc tố mang nguồn gốc tự nhiên xâm nhập, tích lũy trong thực phẩm, trong đó điển hình có thể kể đến các độc tố vi nấm trong các loại hạt ngũ cốc, các độc tố vi tảo [13], [88] và vi khuẩn trong các loại thủy hải sản, nhất là các loại nhuyễn thể. Trong số các độc tố tự nhiên có thể tích lũy trong thực phẩm, cho tới nay những nghiên cứu đã được công bố cho thấy các độc tố do các loài vi tảo hai roi sản xuất là nguyên nhân gây ra rất nhiều hội chứng ngộ độc cho người. Khả năng gây độc rất đa dạng, trong đó hay gặp nhất là các triệu chứng trên hệ thần kinh (gây tê liệt, hôn mê, mất trí n h ớ . , có thể tử vong trong các vụ ngộ độc nghiêm trọng) và hệ tiêu hóa (đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa...), dẫn tới những vụ ngộ độc ở quy mô khác nhau tại nhiều nơi trên thế giới [33], [133]. Trong các hội chứng ngộ độc đường tiêu hóa do độc tố của vi tảo hai roi gây ra có hội chứng tiêu chảy do ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP) với tác nhân là nhóm độc tố gồm acid okadaic (OA) và các dẫn xuất gọi chung là dinophysistoxin (DTX) [11]. Hiện tại ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ban hành Thông tư số 33/2015/TT-BNNVPTNT quy định về giám sát vệ sinh, an toàn thực phẩm trong thu hoạch nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong đó có quy định giới hạn tổng của OA, các DTX và pectenotoxin (PTX) là 160 ppb [1]. Tuy nhiên, 1 việc đánh giá nguy cơ có mặt của các độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách có hệ thống, ngoại trừ một số nghiên cứu khoanh vùng ở các khu nuôi thủy sảnnhư nghiên cứu của Viện Nghiên cứu hải sản tiến hành ở 3 vùng nuôi ngao tập trung vào năm 2003 [5]. Bên cạnh đó, phương pháp chính thức hiện tại của TCVN 8341: 2010 [2] chỉ cho phép xác định OA, không cho phép xác định các DTX, còn phương pháp bán định lượng trên chuột (MBA) có thể cho kết quả dương tính cả với các nhóm hợp chất thân dầu chưa ghi nhận có độc tính trên người như PTX, yessotoxin (YTX). Do vậy, cần có phương pháp đặc hiệu hơn để xác định chính xác OA và các DTX, thủ phạm chính gây hội chứng DSP. Để góp phầnđưa ra các giải pháp phân tích đặc hiệu hơn, cũng như đánh giá toàn diện hơn sự có mặt của độc tố nhóm OA trong nhuyễn thể tại Việt Nam, luận án: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỒ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỒI PHỔ " được thực hiện nghiên cứu với 2 mục tiêu sau: Mục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Mục tiêu 2: Xác định hàm lượng các độc tố kể trên trong một số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ được lấy tại các vùng biển Việt Nam BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI DƯỢC HÀ NỘI • HỌC • • • TỐNG THỊ THANH VƯỢNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DIN OPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT X ~ Ẵ 9 SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIÉN SĨ DƯỢC HỌC • • • HÀ NỘI, NĂM 2018 MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG TỔNG Q U AN 1.1 ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Tóm tắt q trình nghiên cứu số nhóm độc tố tảo đơnbào gây độc cho người 1.2 NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HỐ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM SOÁT ĐỘC TỐ DSP 1.2.1 Nguồn gốc độc tố D SP 1.2.2 Cấu trúc hoá học độc tố D SP 1.2.3 Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố D SP 10 1.2.4 Ngộ độc cho người độc tố D SP 11 1.2.5 Quy định kiểm soát độc tố D SP 12 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP 16 1.3.1 Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic 16 1.3.1.1 Lựa chọn dung mơi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn th ể 17 1.3.1.2 Các phương pháp làm dịch chiết ban đầu 18 1.3.1.3 Các phương pháp thuỷ phân mẫu làm sau thuỷ phân 20 1.3.2 Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 21 iii 1.3.2.1 Các phương pháp định lượng sinh học in vivo 21 1.3.2.2 Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào 22 1.3.2.3 Các phương pháp hoá sin h 23 1.3.3 Các phương pháp hố lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 24 1.3.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 24 1.3.3.2 Điện di mao quản 26 1.3.3 Sắc ký khí 27 1.4 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHĨM ACID OKADAIC 27 1.4.1 Các đặc trưng khối phổ độc tố nhóm O A 27 1.4.1.1 Khối phổ OA kỹ thuật EI C I 27 1.4.1.2 Khối phổ OA kỹ thuật FAB 28 1.4.1.3 Khối phổ OA kỹ thuật ESI 29 1.4.1.4 Khối phổ dạng ester O A 34 1.4.2 Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA LC - MS/M S 36 1.4.2.1 Kỹ thuật ion hoá 36 1.4.2.2 Lựa chọn phân tích khối 37 1.4.2.3 Điều kiện sắc k ý 38 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾ T BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U 43 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ 43 2.1.1 Dung mơi, hố chất chất chuẩn 43 2.1.1.1 Chất chuẩn 43 iv 2.1.1.2 Dung mơi, hố chất 43 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 43 2.1.2.1 Thiết bị phân tích 43 2.1.2.2 Dụng cụ phân tích 44 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45 2.2.1 Mẫu nhuyễn thể lấy địa phương 45 2.2.2 Mẫu thêm chuẩn 45 2.2.3 Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố 45 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể 46 2.3.1.1 Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ 46 2.3.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký 47 2.3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể 48 2.3.1.4 Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố tồn phần 48 2.3.1.5 Thẩm định phương pháp 49 2.3.2 Lấy mẫu nhuyễn thể bảo quản m ẫu 51 2.3.2.1 Lựa chọn số lượng cá thể cho mẫu nhuyễn thể 51 2.3.2.2 Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể 51 2.3.3 Phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể biện giải kết 51 2.3.3.1 Tiến hành phân tích mẫu thực 51 2.3.3.2 Các tiêu chí đánh giá kết phân tích độc tố nhuyễn thể 52 2.3.3.3 Các hướng biện giải, bàn luận kết 52 v CHƯƠNG K ẾT QUẢ NGHIÊN C Ứ U 53 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 53 3.1.1 Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 DTX2 M S 53 3.1.1.1 Điều kiện detector M S/M S 53 3.1.1.2 Điều kiện sắc k ý 59 3.1.2 Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 DTX2 từ nhuyễn thể 65 3.1.2.1 Đồng m ẫu 65 3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết độc tố 65 3.1.2.3 Lựa chọn thể tích dung môi chiết 67 3.1.2.4 Khảo sát điều kiện làm dịch chiết 68 3.1.2.5 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố dạng tự 73 3.1.2.6 Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 DTX2 tồn phần nhuyễn thể 74 3.1.3 Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể 79 3.1.3.1 Đánh giá độ ổn định độc tố nhuyễn thể số điều kiện nhiệt độ 79 3.1.3.2 Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể 82 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 82 3.2.1 Điều kiện phương pháp thẩm định 82 3.2.1.1 Phương pháp phân tích độc tố tự cột Cortecs 82 3.2.1.2 Phương pháp phân tích độc tố tự toàn phần cột Zorbax 84 3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích độc tố cột Cortecs 85 vi 3.2.2.1 Độ đặc hiệu 85 3.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống 87 3.2.2.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc 88 3.2.2.4 Độ xác 88 3.2.2.5 Độ 91 3.2.2.6 Độ nhậy 92 3.2.3 Thẩm định phân tích độc tố tự toàn phần cột Zorbax 94 3.2.3.1 Độ đặc hiệu 94 3.2.3.2 Độ thích hợp hệ thống 96 3.2.3.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc 97 3.2.3.4 Độ xác phân tích độc tố tự 98 3.2.3.5 Độ xác xác định độc tố tồn phần 101 3.2.3.6 Độ phân tích độc tố tự 103 3.2.3.7 Độ phân tích độc tố toàn phần 104 3.2.3.8 Độ nhậy 104 3.3 PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ 107 3.3.1 Lấy mẫu nhuyễn thể phân tích độc tố 107 3.3.2 Kết phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể 109 3.3.2.1 Kết phát độc tố tự 109 3.3.2.2 Kết phát độc tố sau thuỷ phân 111 3.3.3 Sự phân bố mẫu phát có độc tố 113 3.3.3.1 Phân bố mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể 113 3.3.3.2 Phân bố mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu 116 vii 3.3.3.3 Phân bố mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu 119 CHƯƠNG BÀN LU ẬN 122 4.1 BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG 122 4.1.1 Điều kiện phân tích độc tố LC - MS/M S 122 4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể 126 4.1.2.1 Cỡ mẫu nhuyễn thể 126 4.1.2.2 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự 126 4.1.2.3 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tồn phần 127 4.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ 129 4.2.1 Loại độc tố phát được, tỷ lệ xuất mức độ hàm lượng nhuyễn thể 129 4.2.2 Dao động xuất độc tố nhuyễn thể yếu tố ảnh hưởng 131 4.3 NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SOÁT ĐỘC TỐ NHÓM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI 140 KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 142 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT Ký hiệu Nội dung ACN Acetonitril ADAM 9-anthryldiazomethan ALP Alkaline phosphatase AOAC Hiệp hội cộng đồng phân tích (Association Of Analytical Communities) ASP Mất trí nhớ ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Amnesic Shellfish Poisoning) AZA Azaspiracid AZP Ngộ độc azaspiracid thuỷ sinh vật vỏ cứng (Azaspiracid Shellfish Poisoning BAP 1-bromoacetylpyren BNNVPTNT Bộ nông nghiệp phát triên nông thôn BrDMEQ 3-bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinon BSA Huyêt bò (Bovine Serum Albumin) CA 9-cloromethylanthracen CI Ion hoá hoá học (Chemical Ionization) CE Năng lượng băn phá ion sơ cấp (Collision Energy) CEFAS Trung tâm khoa học môi trường, ngư nghiệp nuôi trồng hải sản Anh (Centre for Environtment, Fisheries and Aquaculture Science) CTX Ciguatoxin CXP Thê khỏi buồng va chạm (Collision Cell Exit Potential) DP Thê tách chùm (Declustering Potential) DSP Tiêu chảy ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Diarrhetic Shellfish Poisoning) DTX Dinophysistoxin DTX1 Dinophysistoxin-1 DTX2 Dinophysistoxin-2 EC Uỷ ban châu Au (European Commission) EI Ion hoá điện tử (Electron Ionization) ELISA Định lượng băng găn miên dịch liên kêt enzym (Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay) ESI Ion phun điện tử (Electrospray Ionization) EU Liên minh châu Au (European Union) FAB Băn phá nhanh nguyên tử (Fast-Atom Bombardment) GC Săc ký khí (Gas Chromatography) HPLC Săc ký lỏng hiệu cao (High Performace Liquid Chromatograph HRP Horseradish Peroxidase IP Điên định danh (Identification Point) KB Tê bào ung thư biêu mô LC Săc ký lỏng (Liquid Chromatography) LC-MS Săc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LC-MS/MS Săc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry) 11 LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MBA Định lượng sinh học chuột (Mouse Bioassay) MEKC Săc ký điện động mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography) MeOH Methanol MRM Theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring) MU Đơn vị chuột (Mouse Unit) NAFIQAD Cục quản lý chất lượng nông lâm sản thuỷ sản (National AgroForestry-Fisheries Quality Assurance Department) NSP Ngộ độc thần kinh thuỷ sinh vật vỏ cứng (Neurotoxic Shellfish Poisoning) NRCC Hội đồng nghiên cứu quốc gia Canada (National Research Council Canada) NT2MV Nhuyên thê hai mảnh vỏ OA Acid Okadaic PP Protein Phosphatase PSP Tê liệt ngộ độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Paralytic Shellfish Poisoning PTX Pectenotoxin SD Độ lệch chuân (Standard Deviation) SDS Sodium DodecylSulfate SIM Chê độ chọn lọc ion (Select Ion Monitoring) S/N Tín hiệu nhiêu nên (Signal/Noise) SOP Quy trình thao tác chuân (Standard Operation Procedure) iii ... mặt độc tố nhóm OA nhuyễn thể Việt Nam, luận án: “NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỒ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DINOPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN -2 TRONG M Ộ T SỒ NHUYỄN THỂ HAI M ẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT... phương pháp sắc ký lỏng khối phổ M ục tiêu 2: Xác định hàm lượng độc tố kể số nhóm nhuyễn thể hai mảnh vỏ lấy vùng biển Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN 1.1.1 Nguồn gốc Các loại... VIỆT NAM BẰNG SẮC K Ý LỎNG KHỒI PHỔ " thực nghiên cứu với mục tiêu sau: M ục tiêu 1: Xây dựng phương pháp định lượng độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin -2 phương
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 trong một số nhuyễn thể 2 mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ, Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin-1, dinophysistoxin-2 trong một số nhuyễn thể 2 mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khối phổ

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn