ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHÓM GENE blaOXA Ở A baumannii NGUYỄN TUẤN ANH HUỲNH MINH TUẤN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/ 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHĨM GENE blaOXA Ở A baumannii CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 11 1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu nước 11 1.2 Gene OXA A baumannii 17 1.3 Hiện trạng công trình nghiên cứu liên quan 19 1.4 Đánh giá kết công trình nghiên cứu cơng bố 22 1.5 Lý thực nghiên cứu 24 1.6 Dự báo khả ảnh hưởng kết nghiên cứu 24 1.7 Mục tiêu đề tài 25 CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu 26 2.2 Phương pháp 26 2.2.1 Thu nhận chủng A baumannii gây bệnh 26 2.2.2 Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh 26 2.2.3 Thiết kế mồi mẫu dò 29 2.2.4 Phương pháp tách chiết nucleic acide 31 2.2.5 Phương pháp real-time PCR 31 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 35 3.1 Thu thập chủng vi khuẩn 35 3.2 Thiết kế mồi mẫu dò 36 3.3 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR 36 3.3.1 Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR 37 3.3.2 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR 40 3.4 Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR 43 3.4.1 Độ đặc hiệu quy trình multiplex real-time PCR 43 3.4.2 Độ nhạy quy trình multiplex real-time PCR 44 3.4.3 Độ ổn định quy trình multiplex real-time PCR 44 3.4.4 Động học quy trình multiplex real-time PCR 46 3.5 Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR 46 CHƯƠNG IV – BIỆN LUẬN 51 CHƯƠNG V – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 63 7.1 Phụ lục 1: 63 7.2 Phụ lục 2: 65 7.3 Phụ lục 3: 66 7.4 Phụ lục 4: 68 7.5 Phụ lục 5: 69 7.6 Phụ lục 6: 70 7.7 Phụ lục 7: 71 7.8 Phụ lục 8: 72 7.9 Phụ lục 9: 73 7.10 Phụ lục 10: 84 7.11 Phụ lục 11: 85 7.12 Phụ lục 12: 86 7.13 Phụ lục 13: 87 7.14 Phụ lục 14: 89 7.15 Phụ lục 15: 90 TÓM TẮT Tổng quan: Việc sử dụng kháng sinh không lạm dụng kháng sinh tạo nên áp lực chọn lọc khiến xuất chủng vi khuẩn kháng kháng sinh gia tăng số lượng cách nhanh chóng Carbapenem kháng sinh phổ rộng, mạnh thường sử dụng trường hợp nhiễm trùng đa kháng thuốc Acinetobacter baumannii tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu Đặc biệt, chủng A baumannii sở hữu số nhóm gene bla OXA, có khả biểu tính đa kháng kháng sinh, carbapenem Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình multiplex Taq-Man real-time PCR phát nhóm gene bla OXA-23/-51/-58 điển hình A baumannii, đồng thời với gene 16S rRNA đặc trưng cho Acinetobacter spp Phương pháp: Quy trình sử dụng mẫu dò Taq-Man thiết kế đặc trưng cho nhóm gene với kênh màu khác (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) để phát nhóm gene blaOXA-23/-51/-58 gene 16S rRNA tương ứng phản ứng Phản ứng multiplex real-time PCR tối ưu để đạt hiệu suất nhân tốt cho tất gene đích cần phát Kết quả: Kết cho thấy quy trình có khả phát xác gene bla OXA-23/-51/-58 đặc trưng A baumannii với độ nhạy khoảng sao/phản ứng độ đặc hiệu cao, khơng cho tín hiệu dương tính với DNA nhiều loài vi khuẩn thường thấy bệnh viện Kết khảo sát cho thấy mẫu vi khuẩn thu thập được, có 63 (54,3%) chủng xác định Acinetobacter spp qua diện gene 16S rRNA Trong đó, có 45 (71,4%), 38 (60,3%) (6,3%) chủng mang gene bla OXA-51, bla OXA-23 bla OXA-58 Các chủng mang gene bla OXA-51 cho chủng A baumannii xét quan điểm blaOXA-51 thỉ sinh học phân tử đặc trưng vi khuẩn Trong 45 chủng A baumannii (mang gene bla OXA-51), có 84,4% (38/45) mang thêm gene bla OXA-23 2,2% (1/45) chủng mang thêm gene blaOXA-58 Ba chủng mang gene bla OXA-58 lại thuộc nhóm khơng có bla OXA-51, xếp vào nhóm Acinetobacter spp Khơng có chủng mang đồng thời gene bla OXA-51, blaOXA-23 blaOXA-58 Kết luận: Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình multiplex Taq-Man realtime PCR phát số nhóm gene bla OXA-23/-51/-58 A baumannii Quy trình sử dụng để đồng thời phát nhanh chủng A baumannii số nhóm gene kháng kháng sinh bla OXA chúng Quy trình ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử diện nhóm gene blaOXA A baumannii ABSTRACT DEVELOPMENT OF A TAQ-MAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII Backgrounds: Misuse and abuse of antibiotics has created selective pressures on bacteria and consequently antibiotic resistant bacteria quickly increase in number Carbapenem is a strong and extended β-lactam antibiotic which usually used in cases of multidrug resistance Acinetobacter baumannii currently is one of the most leading and dangerous factors causing nosocomial infections In addition, A baumannii harbouring several bla OXA genes could express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem Objectives: To set up a multiplex Taq-Man real-time PCR protocol for the detection of several typical bla OXA-23, bla OXA-51, bla OXA-58 genes in A baumannii, together with 16S rRNA gene specific to Acinetobacter spp Methods: The process was created with Taq-Man probes designed specifically to individual genes with distinguish flourophores (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) to detect bla OXA-23, bla OXA-51, bla OXA-58 and 16S rRNA correspondingly in one reaction The multiplex real-time PCR was optimized to get the highest amplification efficiency for all targeted genes Results: The results showed that the protocol could detect precisely bla OXA-23, bla OXA-51, blaOXA-58 genes specific to A baumannii with high sensitivity (4 copies/reaction) and specificity, not reacting with DNA of many common bacteria in hospital environment The survey result showed that 63 (54,3%) Acinetobacter spp isolates was determined by 16S rRNA gene In there, 45 (71,4%), 38 (60,3%) and (6,3%) isolates contained bla OXA-51, correspondingly The isolates with bla bla OXA-23 and bla OXA-58 genes OXA-51 gene was accepted to be so- called A baumannii isolates based on the existence of the gene as the specific molecular marker In 45 A baumannii isolates (containing were 84,4% (38/45) isolates with extra bla bla OXA-51), there OXA-23 gene and 2,2% (1/45) isolates with blaOXA-58 gene The rest of isolates with blaOXA-58 gene was of the group without bla OXA-51 gene This group was determined as Acinetobacter spp group There was not any isolate containing simultaneously bla OXA-51, blaOXA-23 and blaOXA-58 genes Conclusions: We built up a multiplex Taq-Man real-time PCR protocol successfully for the detection of bla OXA-23, bla OXA-51 and bla OXA-58 genes in A baumannii The protocol can be used to identify A baumannii rapidly and their antimicrobial resistance bla OXA genes Potentially, the protocol might become a tool to study molecular epidemiology of several popularly in A baumannii bla OXA genes DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ak: Akamicin AmpC: Chromosomally encoded cephalosporinase ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction analysis ATCC: American Type Culture Collection BA: Blood Agar BHI: Brain Heart Infusion BLAST: Basic Local Alignment Search Tool CarO: Carbapenem Resistance Outer Membrane Protein Cip: Ciprofloxacin CLSI: Clinical Laboratory Standard Institute Co: Colistin Cs: Cefoperazon Sulbactam Ct: Threshold Cycle Cx: Ceftriaxone Cz: Ceftazidime dNTP: DeoxyriboNucleotide Triphosphate DNA: DeoxyriboNucleic Acid EMB: Eosin Methylen Blue ESBL: Extended Spectrum β-lactamase GES: Guiana Extended Spectrum IDT: Intergrated DNA Technologies IMP: Imipenemase IND: Chryseobacterium indologenes IS: Insertion Sequence KPC: Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase LB: Luria-Bertani Lv: Levofloxacin Mem: Meropenem MHA: Muller-Hinton Agar MIC: Minimum Inhibitory Concentration NCBI: National Center for Biotechnology Information NDM-1: New-Delhi Metallo-beta-lactamase Nel: Neltimicin OF: Oxidative Fermentative OUCRU: Oxford University Clinical Research Unit OXA: Oxacillin Oxacillinase PCR: Polymerase Chain Reaction PER: Pseudomonas Extended Resistance Pt: Piperacillin Tazobactam rRNA: Ribosomal RiboNucleic Acid RNA: RiboNucleic Acid SME: Serratia Marcescens Enzyme SIM: Sulfite Indole Motility Tc: Ticarcillin Clavuclanic Acid TSI: Triple Sugar Iron Agar VIM: Verona Integron-encoded Metallo-beta-lactamase 16S rRNA (YD72) GGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACT GG 76 bla OXA-51 (YD24) CGACTTGGGTACCGATATCTGCATTGCCATAACCAACACGCTTCAC TT 77 bla OXA-51 (YD29) CTTGGGTACCGATATCTGCATTGCCATAACCAACACGCTTCACTTC 78 bla OXA-51 (YD31) ACTTGGGTACCGATATCTGCATTGCCATAACCAACACGCTTCAC bla OXA-51 (YD47) ACTTGGGTACCGATATCTGCATTGCCATAACCAACACGCTTCAC 79 bla OXA-51 (YD72) ATTTTTGGCTGGTGGGTCCTTTAAAAATTACTCTCTCAGCAATGAGG CA 80 bla OXA-23 (YD24) ACCGATACGTCGCGCAAGTTCCTGATAGACTGGGACTGCAGAAAG CTTCATGGCTTCTCCTAGTGA 81 bla OXA-23 (YD31) GTTCCAGATAGACTGGGACTGCAGAAAGCTTCATGGCTTCTCCTAG T bla OXA-58 (YD047) ATTTTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAGCATCTACAGTGCCTGTATA TCAAGAATTGGCAC 82 83 7.10 Phụ lục 10: Giá trị Ct chi tiết khảo sát độ nhạy quy trình multiplex real-time PCR TN19* bla OXA-51 N/A -1 3,56x10 3,56x10 3,56x10 3,56x102 3,56x10 3,56x104 3,56x105 3,56x106 bla OXA-58 N/A YD132* 16S rRNA N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 37,3 35,9 36,9 36,0 36,4 37,2 33,4 33,9 35,2 34,9 34,6 34,9 33,8 34,9 35,1 31,0 31,3 31,7 30,6 30,4 31,3 30,3 30,1 31,3 26,5 26,7 27,9 27,2 27,2 28,1 27,1 27,0 28,3 23,0 23,4 24,8 22,9 22,3 24,3 23,2 23,1 24,7 19,5 19,7 19,6 19,4 19,4 19,7 19,1 19,0 19,7 16,0 15,6 16,5 16,0 15,9 16,6 16,0 15,8 16,6 5,52x10 -1 5,52x10 bla OXA-23 bla OXA-51 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 34,4 34,1 35,4 34,1 34,4 35,3 34,7 5,52x10 5,52x102 5,52x10 5,52x104 5,52x105 5,52x106 84 16S rRNA 35,6 31,9 31,8 34,8 31,3 31,8 34,1 31,1 31,3 34,3 28,0 29,3 31,3 27,3 28,6 31,1 27,3 27,1 31,3 24,1 26,7 27,7 23,6 25,2 26,4 23,6 25,6 26,3 20,4 22,0 23,4 20,2 21,7 23,1 19,3 21,8 21,5 16,8 18,4 19,6 16,6 18,2 19,8 16,4 18,0 18,4 13,0 14,6 15,6 13,9 15,9 16,2 13,1 15,8 13,8 7.11 Phụ lục 11: Giá trị Ct chi tiết khảo sát độ ổn định quy trình multiplex real-time PCR Thời điểm [DNA]* 4x108 4x101 4x108 4x10 4x10 4x101 * bla OXA-23 13,0 13,0 12,8 34,8 36,3 35,2 11,9 13,7 13,6 35,4 34,1 bla OXA-51 12,8 13,3 13,1 37,0 35,7 35,5 13,9 13,1 33,0 35,8 35,2 13,8 14,0 14,5 36,4 35,2 13,3 14,9 13,9 35,1 34,7 bla OXA-58 16S rRNA 13,7 14,0 13,9 14,4 13,9 14,2 35,5 36,4 36,1 37,0 35,9 36,0 14,0 15,1 14,0 15,7 37,0 33,2 34,9 14,7 16,2 16,0 36,7 37,2 Nồng độ mẫu DNA: sao/phản ứng 85 35,5 34,0 36,5 14,2 16,5 15,0 34,7 34.5 34.7 7.12 Phụ lục 12: Giá trị Ct chi tiết khảo sát động học quy trình multiplex real-time PCR [DNA] (bản sao/phản ứng) 4x10 4x10 4x10 4x10 4x10 bla OXA-23 37,5 38,0 38,4 32,3 31,8 31,3 26,1 25,8 25,4 20,6 18,6 19,7 12,4 12,4 12,0 bla OXA-51 36,7 37,7 38,2 32,1 32,6 32,6 25,8 25,3 26,2 19,5 19,9 18,7 11,6 12,9 12,6 86 bla OXA-58 16S rRNA 37,5 38,2 36,9 32,1 32,6 32,6 27,4 26,8 27,6 20,5 21,0 19,8 13,5 13,7 12,9 37,5 36,9 36,2 30,9 31,4 31,5 26,9 27,2 27,5 19,4 20,3 20,7 13,9 13,1 13,5 7.13 Phụ lục 13: Số liệu chi tiết kiểu gene blaOXA chủng A baumannii thu thập STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Mã số YD024 YD025 YD029 YD031 YD032 YD033 YD034 YD035 YD036 YD037 YD038 YD040 YD041 YD042 YD043 YD044 YD045 YD046 YD047 YD048 YD049 YD050 YD053 YD055 YD056 YD058 YD059 YD064 YD065 YD068 YD070 YD072 YD075 YD077 YD081 YD085 YD086 YD089 YD091 16S RNA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 bla OXA-23 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 87 bla OXA-51 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 bla OXA-58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 YD095 YD097 YD099 YD100 YD101 YD102 YD103 YD105 YD106 YD107 YD108 YD110 YD111* YD112 YD115 YD120 YD122 YD124 YD126 YD130 YD131 YD132 YD139 YD140 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 88 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.14 Phụ lục 14: Tóm tắt thơng tin kháng sinh đồ chủng A baumannii có gene blaOXA-51 Kháng sinh Pt Tc Cx Cz Co Mem Cs Ak Nel Cip Lv Nhạy 15 17 11 45 16 27 20 20 17 17 Tần số Trung gian Kháng 44 45 51 50 18 47 35 43 42 46 45 89 Nhạy 23,8 27,0 7,9 17,5 71,4 25,4 42,9 31,7 31,7 27,0 27,0 Phần trăm Trung gian Kháng 6,3 69,8 1,6 71,4 11,1 81,0 3,2 79,4 28,6 74,6 1,6 55,6 68,3 1,6 66,7 73,0 1,6 71,4 7.15 Phụ lục 15: Giá trị Ct khảo sát độ ổn định theo người thực khác quy trình multiplex real-time PCR Người [DNA]* 4x101 A 4x108 4x101 B 4x108 4x101 C 4x108 bla OXA-23 34.8 35.0 34.7 13.8 11.9 12.0 34.8 35.0 34.9 13.1 12.9 12.4 35.0 35.4 35.3 13.3 13.8 13.8 bla OXA-51 35.2 34.7 32.7 13.0 12.0 11.9 35.7 34.8 34.6 12.8 13.5 13.0 34.8 35.0 36.0 12.9 14.3 14.9 90 bla OXA-58 16S rRNA 35.9 35.9 35.9 35.8 35.7 35.1 13.7 13.4 12.9 11.9 13.7 13.2 35.6 35.2 35.6 35.6 35.3 35.4 13.3 13.0 13.6 13.0 13.5 13.0 35.4 35.7 35.9 36.3 36.5 36.5 13.8 13.3 13.9 13.9 14.6 14.8 ... multiplex Taq-Man realtime PCR phát số nhóm gene bla OXA-23/-51/-58 A baumannii Quy trình sử dụng để đồng thời phát nhanh chủng A baumannii số nhóm gene kháng kháng sinh bla OXA chúng Quy trình ứng dụng... real-time PCR phát số nhóm gene blaOXA Acinetobacter baumannii Qui trình giúp phát đồng thời số nhóm gene blaOXA quan trọng xuất A baumannii, có liên quan đến tính kháng carbapenem Nội dung thực hiện: ...ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ NHÓM GENE blaOXA Ở A baumannii CHỦ NHIỆM ĐỀ