i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 4/2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi được thực hiện dưới sư hướng dẫn cua GS.TS Chu Hoang Mâu Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, ngày 10 tháng năm 2015 Tác giả Nguyên Thi Phương Ngân Ban chu nhiêm khoa Can bô hương dẫn khoa hoc GS.TS Chu Hoang Mâu ii LỜI CAM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện đê tơi hồn thành Ban ln văn thac si Tôi xin chân cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiêm khoa va cac thầy cô khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn can bô Phòng ADN ưng dung, Phòng thí nghiệm Trọng điêm cơng nghệ gen, Viên Công nghê sinh hoc, Viên Han lâm Khoa học Công nghê Viêt Nam tao điều kiên va giúp đỡ tơi qua trình tiến hanh thí nghiêm cua đề tài Tơi xin cảm ơn Tiến sỹ Lò Thị Mai Thu Thạc sĩ Lê Thị Hồng giúp đỡ tơi q trình thưc hiên đề tai luận văn Đê tai luận văn thuôc chương trinh đào tao nghiên cưu sinh va cao hoc cua Bô môn Di truyền & Sinh hoc hiên đại, khoa Sinh-Ky thuât nông nghiêp, trương Đai hoc Sư pham - Đai hoc Thai Nguyên Tác giả iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii MUC LUC iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS 1.1.1 Bệnh khảm ở đậu tương 1.1.2 Hệ gen SMV, BYMV Potyvirrus 1.2 ƯNG DUNG KY THUÂT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHANG VIRUS 11 1.2.1 Cây thuốc va bệnh virus thuốc 11 1.2.2 Cơ chế RNA interference (RNAi) 14 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyên gen kháng virus 1.3 ƯNG DUNG KY THUÂT PHÂN TƯ TRONG PHÂN TICH CÂY CHUYÊN GEN Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 18 22 2.1 VÂT LIÊU, HOA CHÂT VÀ THIÊT BI 22 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 iv 2.1.3 Thiết bị 22 2.1.4 Địa điêm nghiên cưu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp chuyên gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 2.2.2 Phân tích sư có mặt cấu trúc chuyên gen pK7GW/SMVBYMV-CPi phương pháp PCR………………………………… 26 2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo SMV BYMV vao la thuốc …… 28 2.2.4 Phân tích số lượng virus thuốc chuyên gen chưa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) ky thuât Real time RT- 29 PCR………………………………………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KÊT QUA CHUYÊN CÂU TRUC pK7GW/SMV-BYMV-CPi VAO THUÔC LÁ 30 3.1.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumeffaciens cảm ứng tạo cum chồi 30 3.1.2 Tạo rễ phát triên chuyên gen hoàn chỉnh …………… 33 3.2 KÊT QUA PHÂN TICH CÂY THUỐC LA CHUYÊN GEN 35 3.2.1 Kết kiêm tra cấu truc RNAi dòng thuốc chuyên gen 35 3.2.2 Phân tích khả kháng virus cac dong chuyên gen CPi (SMV-BYMV) điều kiên lây nhiêm nhân tạo 36 KÊT LUẬN VA ĐÊ NGHI…………………………………… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 41 DANH MỤC CAC TƯ VA CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV BYMV Bean Golden Mosaic Virus Bean yellow mosaic virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng sư ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trường tạo chồi hpRNA IhpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base v LB Luria and Bertani MS PCR Môi trường theo Murashige Skoog (1962) Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ RNA RNAi interference Short siRNA interfering RNA SMV Soybean mosaic virus T0, T6, T12 Các dòng thuốc chuyên gen TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Vir Virulence Region WT1, WT2, WT3 Cây thuốc không chuyên gen DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro………… 24 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………… 26 Bảng 2.3 Trinh tư nucleotide cua căp mồi PCR khuếch đai đoan Cpi 28 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cpi 28 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 31 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh lá……………………………… 33 Bang 3.3 Kết qua tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng………………………………………………………………… 34 Bảng 3.4 Kết định lượng sư có mặt virus SMV thuốc chuyên gen………………………………………………… 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá đậu tương bị nhiễm SMV .5 Hình 1.2 Sơ cấu trúc hệ protein potyvirus Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyên gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) 11 Hình 1.4 Cây thuốc giống C9-1 11 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động RNAi 15 Hinh 3.1 Các mảnh được ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens tai tô hơp 31 Hình 3.2 Hinh anh phat sinh cum chôi .32 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ mơi trường kháng sinh chọn lọc 34 Hinh 3.4 Cac dong thuốc la chuyển gen thê T0 trông châu nha lươi 35 Hình 3.5 Kêt qua điện di kiêm tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyên gen 35 Hình 3.6 Kêt qua điện di kiêm tra san phâm PCR nhân đoan CPi (SMV-BYMV) tư 21 dong thuốc chuyên gen 36 Hinh 3.7 Hinh anh môt sô dong thuôc la chun gen va đơi chưng .37 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoan cDNA tư mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng cạn có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc Ngoài sản phẩm khơ dầu đậu tương được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc trừ sâu Hạt đậu tương được dùng nhiều y học, giúp tránh hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp Ngoài đậu tương trồng ngắn ngày, thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại khác cải tạo đất tốt [4] Việt Nam nước nông nghiệp, đậu tương trồng chủ đạo Mặc dù bắt đầu tiến hành sản xuất quy mô công nghiệp từ năm 2011 Việt Nam vẫn tiếp tục phải nhập phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sư thiếu hụt thực phẩm protein nước đáp ứng nhu cầu ngày tăng ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Năng suất sản lượng đậu tương nước ta ở mức thấp có thê nguyên nhân như: Nhiều giống hiện trồng suất tính ổn định chưa cao, sức biến động lớn miền, vùng; Khả kháng virus sâu bệnh giống đậu tương trồng thấp; Chưa có dư báo thời vụ gieo trồng thích hợp cho vùng Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, ví dụ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại đậu tương nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani 33 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh Cấu trúc RNAi Số mẫu Tổng số Số chồi Tỉ lệ tạo tạo chồi chồi trung chồi (%) bình/manh pK7GW-CPi (SMV- BYMV) ĐC0 25 64 2,62 62,5 - - - - ĐC1 38 102 2,7 95,0 Bang 3.2 cho thây 95% mảnh lô đôi chứng ĐC1 không chuyển gen thu được chồi, với tỉ lệ trung bình 2,7 chồi/mảnh Số lượng mẫu tạo chồi trung bình ở lơ chủn gen 25 số chồi trung bình 2,62 chồi/mảnh Như vậy, có sư khác số lượng mảnh có cảm ứng mơi trường chọn lọc, tỉ lệ tạo chồi khác không đáng kê lô chuyển gen lô không chuyên gen 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyên gen hoàn chỉnh Tạo rễ khâu cuối nuôi cấy in vitro có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyên gen ở thực vật Những nghiên cứu tái sinh chuyên gen thuốc ghi nhận IBA, NAA IAA hormone sinh trưởng được lựa chọn nghiên cứu tạo rễ bổ sung IBA 0,0001g/l Nồng độ chất điều khiên sinh trưởng dao động khoảng 0,1 mg/l Cụm chồi tuần tuổi có chiều cao 1cm được tách nhỏ chuyên sang môi trường tạo rễ Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết chồi (Hình 3.3 Bảng 3.3) Các chồi phát triển xanh tốt tạo nhiều mới Quan sát thấy chồi khơng chun gen mơi trường đối chứng có q trình tạo rễ tương tư Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 34 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc Bang 3.3 Kết qua tạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng Cấu trúc RNAi Số chồi tạo thành Số sống sót Số rễ Số bầu đất Số trồng nhà lưới pK7GW-CPi (SMV- 64 40 35 25 25 ĐC0 - - - - ĐC1 102 87 40 25 BYMV) 80 Bang 3.3 cho thấy với tổng số chồi ở lô thi nghiêm thu đươc 40 sống sot va co 35 rê; bầu 25 va đem trồng tai nha lươi Ơ lô đối chưng co 87 sống, 80 rê, cho bầu 40 va đem trồng 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35 Nhưng thuốc la chuyên gen trồng nha lươi biểu hiện xanh tốt, mập mạp (Hinh 3.4) Hinh 3.4 Cac dong thuốc la chuyên gen thế T0 trồng châu nha lươi 3.2 KÊT QUA PHÂN TICH CÂY THUÔC LA CHUYÊN GEN 3.2.1 Kết kiểm tra câu truc RNAi dòng thuốc chuyển gen Các dòng thuốc chuyên gen sau trồng nhà lưới được khoảng 3-4 tuần tiến hành thu tach chiết DNA tông số va thực hiện phản ứng PCR kiêm tra sư có mặt đoan gen chuyên CPi Tư mẫu non 21 dòng thuốc chuyên gen ở hệ T0 trồng nhà lưới sau - tuần DNA tổng số được tách chiết điện di gel agarose 0,8%, kết qua đươc thê hiên hinh 3.5 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  Hình 3.5 Kết qua điện di kiêm tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyên gen (1-21: Băng DNA cua 21 dong thuốc chuyên gen) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36 PCR đươc thưc hiên với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R va kết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.6 cho thấy, tất 21 dòng dương tính với phản ứng PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước khoang 500 bp, tương tư kết ở mẫu đối chứng dương Kích thước hoàn toàn phù hợp với kich thươc cua cấu truc CPi (SMV-BYMV) Vì vậy, có thê khẳng định cấu trúc CPi (SMV-BYMV) được chuyên thành công vào thuốc l gi ống C9-1 (+) (-) M 10 11 12 13 14 500 bp M 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 500 bp Hình 3.6 Kết qua điện di kiêm tra san phâm PCR nhân đoan CPi (SMVBYMV) từ 21 dong thuốc chuyên gen 1-21: 21 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-CPi (SMV-BYMV); (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) 3.2.2 Phân tích khả kháng virus cac dong chuyển gen CPi (SMV-BYMV) điêu kiên lây nhiễm nhân tao Đê kiểm tra tính kháng virus kham la, 21 dòng thuốc chuyển gen dương tinh vơi PCR 10 dòng đối chứng khơng chuyên gen được lây nhiễm bằng dich chưa SMV va BYMV qua ba lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm, dòng thuốc được quan sát sư biểu hiện bênh kham Kết qua đa xac đinh đươc dong thuốc la khang bênh, dong nhiêm bênh va cac đối chưng không chuyên gen Những đối chứng cac dong chuyên gen nhiêm bệnh nhiễm hai loai SMV va Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 BYMV biêu hiên co bị kham va xoăn, còi cọc sinh trưởng Trong đó, dòng kháng hồn tồn vẫn sinh trưởng phát triên bình thường, xanh tốt (Hinh 3.7) Như vậy, phương pháp lây nhiễm nhân tao SMV va BYMV nguồn nhiễm bệnh kham có thê áp dụng tốt đê đánh giá khả kháng cho dòng thuốc chuyên cấu trúc CPi (SMVBYMV) T 05 WT1 T 012 WT2 T 019 WT3 Hinh 3.7 Hình anh môt số dong thuốc la chuyên gen va đối chưng T05, T012, T019- Dong thuôc la chuyên gen; WT1, WT2, WT3- Cây thuôc la không chuyên gen Số lượng virus SMV cac dong thuốc chuyên gen chưa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) không chuyên gen (WT) đươc kiêm tra bằng phản ứng Real time RT- PCR Sử dung cua dòng thuốc chun gen khơng có triệu chứng bệnh la T05, T012; T019 thuốc không chuyên gen có triệu chứng bệnh nặng la WT1, WT2, WT3 ở lần lây nhiễm nhân tạo thứ lam vật liệu cho phản ứng Real time RT-PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38 RNA tổng số được tách từ 1g thuốc lá, sau sử dụng µg RNA tổng số cho phản ứng tổng hợp cDNA Đường chuẩn được xây dựng từ phản ứng có số lượng tế bào E coli mang vector pBT-SMV tái tổ hợp được xác định buồng đếm tế bào Hàm lượng DNA mẫu chuẩn có hàm lượng tương ứng là: 1000, 100 10 DNA/µl (1 tế bào tương ứng với sao) Phương trình đường chuẩn được dựng dựa phản ứng Real time RT- PCR với cặp mồi SMVqF/SMVqR, phương trình đường chuẩn tuyến tính đê xác định số DNA theo chu kỳ ngưỡng được lập có dạng: Y= -168,15x + 4202,7 R2 = 0,898 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoan cDNA tư mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR Từ kết ở hình 3.8, số liệu chu kỳ ngưỡng phát hiện virus SMV lượng sao/1 g thuốc được trinh bay ở bảng 3.4 Bảng 3.4 cho thấy, virus SMV có mặt ở mẫu thuốc chuyên gen không chuyên gen sau lây nhiễm virus nhân tạo Trong không chuyển gen số lượng SMV trung bình 810 cao 1,93 lần so với chuyên gen (trung bình 418,67 sao) Do sư hoạt động cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) có mặt hệ gen SMV bị phân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 hủy theo RNAi số lượng SMV thuốc chuyên gen thấp Tuy nhiên, chuyên gen số lượng SMV khác nhau, dong T01 co 386 sao, T02 lên tới 466 sao, T03 có 404 Như vậy, mức độ biêu hiên cua tính kháng bệnh cac dong chuyên gen có sư khác Kết qua phân tich Real time PCR đa cho thấy cấu truc RNAi CPi(SMV-BYMV) đa biêu hiên tăng cương tinh khang SMV cac dong thuốc la chuyên gen Bảng 3.4 Kết định lượng sư có mặt virus SMV thuốc chuyên gen Tên mẫu CP Số ban copy/1 g (-) 28.68 - WT1 20.66 729 WT2 19.66 897 WT3 20.21 804 T01 22.70 386 T02 22.22 466 T03 22.59 404 1x 19.52 1000 10x 23.21 100 100x 25.65 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Trung binh 810,00 418,67 http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 KÊT LUẬN VA ĐỀ NGHI Kêt luân 1.2 Cấu trúc RNAi pK7GW-SMV-BYMV-CPi đa đươc chuyên công vao mô la thuốc la giống C9-1 thông qua lây nhiễm A tumefaciens 1.3 Phân tích cac dong th́c la chuyên gen đa xac đinh đươc 21/21 dong thuốc chuyên gen thế T0 dương tinh vơi phan ưng PCR 1.4 Cac dong thuốc chuyển gen va WT đa đươc lây nhiêm nhân tao virus kham, ky thuât Real time RT-PCR đa xác đinh đươc WT số lượng SMV cao 1,93 lần so với chuyên gen Như cấu truc CPi (SMV-BYMV) biểu hiện tăng cương tinh khang SMV ở cac dong thuốc la chuyên gen Đê nghi Tiếp tuc theo doi, phân tich va đanh gia tinh khang vơi SMV cua cac dong thuốc chuyên gen ở cac sau Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tư nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyên, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen, Nxb Đại học Sư phạm, Huế Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam: 316 – 326 Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), Đánh giá tính đa dạng dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dòng, xác định so sánh trình tư gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4):451-459 Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đốn nhanh bệnh hại thực vật, Nxb Nơng nghiệp Vu Triệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chuyên khoa Đại học Nơng Nghiệp Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 10 Chu Hồng Mậu, Phương pháp phân tích di trùn đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên năm 2008 11 Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn bệnh virus hại trồng, Nxb Giáo dục 12 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tư nhiên Công nghệ 13 Lò Thị Mai Thu, Hồng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen ma hoa coat protein phân lâp tư Soybean Mosaic Virus Tap chi sinh hoc 36 (1se), tr 283-292 14 Lò Thị Mai Thu, Lê Hờng Trang, Chu Hồng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cưu tao đậu tương chuyên gen kháng soybean mosaic virus va bean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học & Cơng nghê- Đai hoc Thai Nguyên, 115 (02), tr 111-115 15 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Trồng chế biên thuốc NXB T/p Hơ Chí Minh 16 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265275 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Afanasiev M M., Morris H E (1952), “Bean Virus (yellow) on Great Northern bean in Montana”, Phytopathology, 42, pp 101-104 18 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: 161-165 19 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl Acad Sci USA 88:7887-7891 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 20 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis sion J Gen Virol 76:265-270 21 Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall, l.,Arya N., Patel H.R.H 2005 Basic principles of real – time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn.,5:1-11 22 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 35663 23 Bubner B., Gase K., Baldwin I T (2004), “Two - fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real - time PCR”, BMC Biotechnology, 4, pp 4-14 24 Bustin S.A., Nolan T.2004 Pìfalls of quantitative real – time Reversetranscription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Biomolecular Techniques 15:155-166 25 Brunt A A., Crabtree K., Dallwitz M J., Gibbs A J., Watson L., Zurcher E J (2003), Plant Viruses Online, Descriptions and Lists from the VIDE Database Version: 20th August 1996 26 Chicas., Macino, 2001 Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO (11): 992-6 27 Dahmer M L., Hildebrand D F., Collin, G B (1992), “Comparative protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos”, In Vitro Cell Dev Biol, 28, pp 106–114 28 DeCleene M., DeLey J (1976), “The host range of crown gall”, Bot Rev pp 389–466 29 Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 98994 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 30 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., Raccah, B 1992 A zucchini yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:21832187 31 Gibbs A., Harrison B.(1976), Plant virology the principles, Edward Amold 32 Gough K H., Shukla D D (1992), “Major sequence variations in the N - terminal region of the capsid protein of a severe strain of passion fruit woodiness potyvirus”, Arch Virol., 124, pp 389-396 33 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), “Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition”, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 34 Hartman G L., West E D., Herman, T K (2011), “Crops that feed the World Soybean-worldwide production, use and constraints caused by pathogens and pests”, Food Sec., 3, pp 5–17 35 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 36 Hill J H (1999), Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean Diseases, 4th edn, pp 70–71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society 37 Hunt M.Real-time PCR Microbiology and Immunology On-line 38 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:2067-2077 39 Jayaram, Ch., Hill, J.H., Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus J Gen Virol 72:1001-1003 40 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 41 Kirichenko A N (2013), “The characterization of bean yellow mosaic virus isolated from soybean”, Mikrobiol Z., 75 (3), pp 68-73 42 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 43 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 44 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 45 Selvaraj T., Nisha M C., Rajeshkumar S (2009), “Effect of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal of science and technology, (1), pp 222-234 46 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM(2000)Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature, 407, pp 319-323 47 Shukla D D., Ward C W (1988), “Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group”, J Gen Virol., 69, pp 2703-2710 48 Shukla D D., Ward C W., Brunt, A A (1994), The Potyviridae, CAB International, University Press, Cambridge, UK Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 49 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 50 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 51 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 52 Vanderveken J J., Harris K F.,Maramorosch K (1977), Oils and other inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus Vectors Academic Press, London, pp 435-454 53 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 54 Won S L, Yul H K., Kook H K (2003), “Complete Genome Sequences of the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, Plant Pathol., 19 (3), pp 171-176 55 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... tài: Nghiên cứu tạo dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV BYMV Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng chun gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus gây bênh kham từ giống thuốc. .. RNAi vào thuốc đánh giá tính kháng đối với hai lồi SMV, BYMV thuốc chuyên gen sở đê thực hiện mục tiêu tạo đậu tương chuyên gen kháng đồng thời hai loài SMV BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi. .. Hệ gen SMV, BYMV Potyvirrus 1.2 ƯNG DUNG KY THUÂT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHANG VIRUS 11 1.2.1 Cây thuốc va bệnh virus thuốc 11 1.2.2 Cơ chế RNA interference (RNAi)