Đang tải... (xem toàn văn)
dư lượng hóa chấtdư lượng hóa chấtdư lượng hóa chất, Tăng cường công tác thanh tra, kiểm tra và xử lý nghiêm đối với những hành vi vi phạm pháp luật về việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh nuôi trồng, bảo quản, sơ chế và chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh như các thị trường cảnh báo hiện nay. Năm là, Đẩy mạnh nghiên cứu khoa học kỹ thuật và công nghệ, sớm chuyển giao những mô hình nuôi tôm hiệu quả, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm, để tuyên truyền, hướng dẫn và nhân rộng mô hình nuôi trồng thủy sản trong nhân dân, góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển, phát huy thế mạnh và tiềm năng của tỉnh. Đối với tổ chức cá nhân tham gia sản xuất, kinh doanh. Một là, Nâng cao hơn nữa ý thức, trách nhiệm đối với hoạt động nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, hoạt động bảo quản sản phẩm khai thác và sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản. Hai là, Trong quá trình sản xuất, kinh doanh, cần ghi chép và lưu trữ đầy đủ thông tin có liên quan về sử dụng thuốc, hóa chất, nhằm để phục vụ cho công tác truy xuất nguồn gốc đối với những sản phẩm không đảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm. Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất xứ. Bốn là, Phối hợp tốt với cơ quan quản lý chuyên ngành đối với việc thu mẫu phân tích kiểm soát dư lượng, để kịp thời phát hiện và khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu thủy sản trong thời kỳ hội nhập quốc tế. II. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU , Tăng cường công tác thanh tra, kiểm tra và xử lý nghiêm đối với những hành vi vi phạm pháp luật về việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh nuôi trồng, bảo quản, sơ chế và chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh như các thị trường cảnh báo hiện nay. Năm là, Đẩy mạnh nghiên cứu khoa học kỹ thuật và công nghệ, sớm chuyển giao những mô hình nuôi tôm hiệu quả, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm, để tuyên truyền, hướng dẫn và nhân rộng mô hình nuôi trồng thủy sản trong nhân dân, góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển, phát huy thế mạnh và tiềm năng của tỉnh. Đối với tổ chức cá nhân tham gia sản xuất, kinh doanh. Một là, Nâng cao hơn nữa ý thức, trách nhiệm đối với hoạt động nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, hoạt động bảo quản sản phẩm khai thác và sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản. Hai là, Trong quá trình sản xuất, kinh doanh, cần ghi chép và lưu trữ đầy đủ thông tin có liên quan về sử dụng thuốc, hóa chất, nhằm để phục vụ cho công tác truy xuất nguồn gốc đối với những sản phẩm không đảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm. Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất xứ. Bốn là, Phối hợp tốt với cơ quan quản lý chuyên ngành đối với việc thu mẫu phân tích kiểm soát dư lượng, để kịp thời phát hiện và khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu thủy sản trong thời kỳ hội nhập quốc tế. II. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU , Tăng cường công tác thanh tra, kiểm tra và xử lý nghiêm đối với những hành vi vi phạm pháp luật về việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong sản xuất, kinh doanh nuôi trồng, bảo quản, sơ chế và chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh như các thị trường cảnh báo hiện nay. Năm là, Đẩy mạnh nghiên cứu khoa học kỹ thuật và công nghệ, sớm chuyển giao những mô hình nuôi tôm hiệu quả, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm, để tuyên truyền, hướng dẫn và nhân rộng mô hình nuôi trồng thủy sản trong nhân dân, góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển, phát huy thế mạnh và tiềm năng của tỉnh. Đối với tổ chức cá nhân tham gia sản xuất, kinh doanh. Một là, Nâng cao hơn nữa ý thức, trách nhiệm đối với hoạt động nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, hoạt động bảo quản sản phẩm khai thác và sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản. Hai là, Trong quá trình sản xuất, kinh doanh, cần ghi chép và lưu trữ đầy đủ thông tin có liên quan về sử dụng thuốc, hóa chất, nhằm để phục vụ cho công tác truy xuất nguồn gốc đối với những sản phẩm không đảm bảo chất lượng, an toàn thực phẩm. Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất xứ. Bốn là, Phối hợp tốt với cơ quan quản lý chuyên ngành đối với việc thu mẫu phân tích kiểm soát dư lượng, để kịp thời phát hiện và khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và đáp ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu thủy sản trong thời kỳ hội nhập quốc tế. II. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU
I LỜI MỞ ĐẦU Tình trạng: - Vấn đề nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh sản phẩm thủy sản những năm gần được Ngành Nông nghiệp Phát triển nông thôn đặc biệt quan tâm chỉ đạo, hướng dẫn biện pháp khắc phục, nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng đáp ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu - Dư lượng hóa chất, kháng sinh thủy sản: Là tình trạng hóa chất, kháng sinh chứa sản phẩm thủy sản dạng nguyên chất hoặc chuyển hóa, những nguyên nhân gây mất an toàn thực phẩm, gây tác hại đối với sức khỏe của người sử dụng Hiện nay, nuôi trồng thủy sản của tỉnh Bạc Liêu có những bước phát triển nhảy vọt, được đánh giá ngành mũi nhọn chiến lược phát triển kinh tế của tỉnh, nhất mơ hình ni tơm thâm canh, bán thâm canh, đối tượng chủ lực tôm sú tôm thẻ chân trắng được xuất khẩu vào các thị trường lớn như: Thị trường EU, Nhật, Mỹ, v, v, Tuy nhiên những năm gần đây, việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh quá trình phòng ngừa điều trị bệnh gây dư lượng kháng sinh tôm nuôi, bị nhiều thị trường nhập khẩu cảnh báo Chẳng hạn, thị trường Braxin mới có văn bản dỡ bỏ lệnh tạm ngừng cấp phép nhập khẩu thủy sản từ Việt Nam vào tháng năm 2015; thị trường Nhật Bản tiến hành kiểm tra chỉ tiêu Oxytetraxycline đối với 100% số lơ tơm nhập khẩu từ Việt Nam khơng lô hàng bị trả về thị trường EU có văn bản gửi Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thủy sản nêu tên 24 doanh nghiệp chế biến thủy sản của Việt Nam có lô hàng bị phát vi phạm năm 2015, đồng thời cảnh báo đình chỉ nhập khẩu, chất lượng tôm không được cải thiện, nhằm để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Châu Âu Riêng đối với tỉnh Bạc Liêu, định kỳ hàng tháng Chi cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thủy sản có kế hoạch lấy mấu ngẫu nhiên để kiểm tra tồn lưu dư lượng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng hạn chế sử dụng sản phẩm thủy sản nuôi, để kịp thời cảnh báo, hướng dẫn biện pháp khắc phục Năm 2014, thu 197 mẫu, năm 2015 thu 201 mẫu 06 tháng đầu năm 2016 thu 45 mẫu tôm Mẫu tôm sau thu được mã hóa gửi đến Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng để kiểm tra phân tích Kết quả phân tích: Phát 01 mẫu tơm bị nhiễm dư lượng kháng sinh vượt mức giới hạn cho phép vào năm 2014 Chi cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thủy sản phối hợp với Chi cục Nuôi trồng thủy sản tiến hành truy xuất nguồn gốc, xác định nguyên nhân gây nhiễm kháng sinh, đề xuất biện pháp khắc phục báo kết quả về Cơ quan Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thủy sản Nam theo quy định Một số nguyên nhân bản gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh: - Một là, số phận nhỏ người dân chưa nắm được danh mục hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng hoặc lợi nhuận kinh tế lạm dụng hóa chất, kháng sinh phòng chống dịch bệnh ni tơm thâm canh, bán thâm canh không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng kháng sinh trước thu hoạch tôm - Hai là, số sở sử dụng Urê, Hàn the để bảo quản nguyên liệu thủy sản khai thác nhằm giữ độ tươi; sử dụng Trichlorfon diệt ruồi, muỗi, côn trùng dùng để bảo quản sản phẩm khô - Ba là, số sở thu mua, sơ chế, chế biến thực chưa tốt hệ thống quản lý chất lượng, chưa kiểm soát các mối nguy tới hạn tại các công đoạn sản xuất, kiểm soát chưa đầy đủ các loại hóa chất, kháng sinh khâu tiếp nhận nguyên liệu hoặc vô ý gây nhiễm quá trình sơ chế, chế biến công nhân sử dụng thuốc bôi da Một số tác hại của dư lượng hóa chất, kháng sinh: - Một là, Tác hại đối với môi trường nuôi trồng thủy sản: Do số người dân lạm dụng hóa chất xử lý nước, cải tạo ao nuôi tiêu diệt cả vi khuẩn có hại vi khuẩn có lợi, gây mất cân bằng hệ sinh thái môi trường nuôi; sử dụng kháng sinh không đúng cách nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, gây nên tượng lờn thuốc, tôm có bệnh xảy rất khó điều trị - Hai là, Tác hại đối với người tiêu dùng: Khi người tiêu dùng ăn phải sản phẩm thủy sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe, gây ngộ độc, suy tủy, suy gan, suy thận, tích tụ lâu ngày có thể dẫn đến ung thư, đột biến gen - Ba là, Tác hại đối với quá trình xuất khẩu: Nếu các thị trường giới không nhập khẩu tôm nuôi của Việt Nam nhiễm dư lượng kháng sinh, đó thị trường nước tiêu thụ hết sản phẩm tôm nuôi dân, dẫn đến giá thành tôm nguyên liệu giảm mạnh, ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế của nước ta, đặc biệt đối với lĩnh vực thủy sản Biện pháp khắc phục phòng ngừa: Để kịp thời khắc phục tình trạng nhiễm dư lượng kháng sinh sản phẩm thủy sản nuôi khuyến cáo của các thị trường nhập khẩu nay, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng đáp ứng yêu cầu của các thị trường thời kỳ hội nhập quốc tế Trong thời gian tới, cần thực tốt số giải pháp sau: * Đối với Cơ quan nhà nước Một là, Trong thời gian tới, các quan quản lý chuyên ngành, quyền địa phương các tổ chức đoàn thể có liên quan: Cần tăng cường nữa công tác tuyên truyền sâu, rộng nhân dân đối với các văn bản quy phạm pháp luật có liên quan về an toàn thực phẩm bằng nhiều hình thức phương pháp phù hợp, dễ tiếp thu, để người hiểu rõ thực đảm bảo theo quy định hành Hai là, Tổ chức tuyên truyền về tác hại của việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng nuôi trồng thủy sản, sản xuất, kinh doanh thủy sản Ba là, Hướng dẫn sở nuôi trồng thủy sản, thu mua, bảo quản, sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản áp dụng chương trình quản lý chất lượng, áp dụng quy trình sản xuất tốt, sản xuất theo hướng bền vững Bốn là, Tăng cường công tác tra, kiểm tra xử lý nghiêm đối với những hành vi vi phạm pháp luật về việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh sản xuất, kinh doanh nuôi trồng, bảo quản, sơ chế chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh các thị trường cảnh báo Năm là, Đẩy mạnh nghiên cứu khoa học - kỹ thuật công nghệ, sớm chuyển giao những mơ hình ni tơm hiệu quả, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm, để tun trùn, hướng dẫn nhân rộng mơ hình ni trồng thủy sản nhân dân, góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển, phát huy mạnh tiềm của tỉnh * Đối với tổ chức cá nhân tham gia sản xuất, kinh doanh - Một là, Nâng cao nữa ý thức, trách nhiệm đối với hoạt động nuôi tôm thâm canh, bán thâm canh, hoạt động bảo quản sản phẩm khai thác sơ chế, chế biến nguyên liệu thủy sản - Hai là, Trong quá trình sản xuất, kinh doanh, cần ghi chép lưu trữ đầy đủ thông tin có liên quan về sử dụng thuốc, hóa chất, nhằm để phục vụ cho công tác truy xuất nguồn gốc đối với những sản phẩm khơng đảm bảo chất lượng, an tồn thực phẩm - Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất xứ - Bốn là, Phối hợp tốt với quan quản lý chuyên ngành đối với việc thu mẫu phân tích kiểm soát dư lượng, để kịp thời phát khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng đáp ứng yêu cầu của thị trường xuất khẩu thủy sản thời kỳ hội nhập quốc tế II PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU Mục đích u cầu - Trong kiểm nghiệm hóa lí, cơng đoạn lấu mẫu được thực bên ngồi phòng thí nghiệm công đoạn rất quan trọng kiểm định chất lượng thủy sản Mọi sai sót cơng đoạn (Ví dụ: lượng mẫu khơng đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từ mơi trường ngồi, bị nhiễm bẩn từ dụng cụ, bị biến đổi các quá trình lý, hóa, sinh học bảo quản) đều có thể đến những sai lệch nghiêm trọng kết quả phân tích Vì vậy, thực cơng đoạn nghiêm trúc đúng quy cách góp phần không nhỏ vào xác của kết quả phân tích - Việc lấy mẫu phải đảm bảo hai điều kiện sau: + Mẫu lấy phải đại diện được cho lô hàng hoặc nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinh công nghiệp) được nhận dạng rõ ràng + Hàng lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định không được biến đổi kể từ lấy mẫu đến phân tích - Để đáp ứng hai điều kiện trên, ngồi việc xây dựng kế hoạch, chương trình lấy mẫu cho các thơng tin cần thiết, phòng kiểm nghiệm phải thiết lập tuân thủ nghiêm ngặt các quy định thủ tục lấy quản lý mẫu, thành viên có liên quan cần phải đảm bảo trì ổn định các đặc tính của mẫu trước được đưa vào thử nghiệm Thủ tục lấy mẫu quản lý mẫu 2.1 Trách nhiệm người phụ trách phòng kiểm nghiệm - Chỉ định người lấu mẫu cụ thể: người được đào tạo hoặc được hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu - Đảm bảo mẫu được lấy theo đúng yêu cầu: có đầy đủ chương trình/ kế hoạch, phương pháp lấy mẫu thích hợp 2.2.Trách nhiệm người lấy mẫu - Đọc kỹ tài liệu làm lấy mẫu tương ứng - Chuẩn bị đủ các trang bị, dụng cụ lấy mẫu bảo quản mẫu phù hợp - Chuẩn bị biên bản lấy mẫu, nhãm mẫu 3.3 Quy định lấy mẫu - Kế hoạch lấy mẫu: + Lượng mẫu để kiểm tra lô hàng tùy thuộc vào sản phẩm cụ thể, khơng được u cầu kiểm nghiệm Theo quy định của tiêu chuẩn Việt Nam lượng mẫu lấy không lớn 0,1% lô hàng, lô hàng lớn, tỷ lệ lấy mẫu thấp khơng đơn vị sản phẩm + Tùy vào mục đích kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng thủy sản có những phương pháp lấy mẫu cách lấy mẫu khác Và chọn các thiết bị phân tích tối ưu cho từng loại chỉ tiêu đó - Vị trí lấy mẫu + Giá trị kết quả từ các phòng thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào vị trí cách lấy mẫu + Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lô hàng thực phẩm, bằng không phải lấy nhiều mẫu Mẫu kiểm của lô hàng lớn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gói tối thiểu phải đạt 200g, mẫu sản phẩm bao gói tối thiểu chỉ cần 100g, với sản phẩm bao gói, chỉ những sản phẩm nguyên bao gói mới được dùng để phân tích - Dụng cụ lấy mẫu thùng chứa mẫu + Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại vật liệu khác vật dụng dùng để lấy mẫu đông lạnh các khoan tay được vơ trùn, hay các dao, thìa, kéo được hấp, sấy hoặc rửa các dung dịch sát trùng… mẫu vào bình chứa - Ghi ký hiệu – Nhận dạng mẫu thử + Phòng kiểm nghiệm phải có quy định riêng về ghi ký hiệu - mã hiệu của mẫu thử cho có thể nhận dạng được mẫu thử suốt quá trình từ lấy mẫu đến trả phiếu kết quả phân tích, khơng để xảy nhẩm lẫn việc sử dụng ký hiệu không rõ ràng hoặc ghi sai so với nguồn gốc của mẫu, ví dụ: Việc ký hiệu riêng cho từng phân xưởng, ký hiệu riêng bao bì nguyên liệu của khách hàng… + Ký mã hiệu xuất mẫu tất cả các giấy tờ, sổ sách có liên quan đến mẫu thử như: biên bản lấy mẫu, phiếu giao nhận mẫu, sổ nhận mẫu, báo cáo kết quả thử nghiệm, phần mẫu lưu (nếu có) + Ký mã hiệu ghi mẫu phải đảm bảo bền vững với các tác nhân vật lý không bị phai mực, được ghi nhãn có độ bám dính tốt - Bảo quản vận chuyển mẫu + Các mẫu sau lấy được bảo quản tách biệt các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng bao nước đá Nước đá phải được bảo quản cho không được tan chảy quá nhanh quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm, mẫu được chuyển vào tủ đơng được phân tích thời gian có thể được + Nếu khơng thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản -20oC phân tích Nếu các mẫu bảo quản đông, có thể bảo quản tủ lạnh – 4oC không được quá 36 Các loại thực phẩm đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản nhiệt độ phòng phân tích + Tốt nhất nên giữ mẫu các bao bì ban đầu Nếu phải vận chuyển mẫu qua bao bì khác, mẫu phải được chứa bao bì vơ trùng/sạch làm bằng vật liệu khơng ảnh hưởng đến chất lượng tình trạng ban đầu của mẫu, làm sai lệch kết quả phân tích + Mẫu phải được bảo quản điều kiện thích hợp trước vận chuyển về phòng kiểm nghiệm Các vật dụng chứa mẫu phải được thiết kế cho mẫu không bị nhiễm bẩn tránh các tượng thay đổi khác các yếu tố cơ, lý, hóa học + Chế độ bảo quản mẫu: + Đối với mẫu mau hỏng (Sushi các loại, đông IQF, dạng hút chân không, dạng ướt đá): phải được bảo quản lạnh sau lấy mẫu bằng thùng cách nhiệt có đá để trì mẫu nhiệt độ thấp (0–4oC) Mẫu cần được để bì kín, tránh tiếp xúc trực tiếp với nước đá + Mẫu không thuộc mẫu mau lỏng: sử dụng các bao túi kín, nhiệt độ bảo quản thời gian vận chuyển không vượt quá 45oC + Mẫu dạng đông block: không được để tan đá phần hoặc toàn trước về đến phòng kiểm ngiệm + Yêu cầu về mẫu kiểm nghiệm: Mẫu được chấp nhận + Dụng cụ chứa mẫu khơng rò rỉ, có nắp đậy kín, khơng bị nứt, không gây nhiễm bẩn vào mẫu + Mẫu dạng hút chân khơng: bao bì kín, khơng có khơng khí bên + Mẫu dạng block, dạng nguyên phải nguyên vẹn, không giập nát + Mẫu phải được phân tích vòng 24 từ ấy Trong trường hợp xác định được giời gian sử dụng, yêu cầu về nhiệt độ thời gian chờ kiểm có thể rộng Muẫ kiểm dạng đông phải được bọc để chống mất nước giữ nhiệt độ tối đa 18oC phân tích + Thực phẩm đơng lạnh: Mẫu kiểm dạng đông phải được rã đông 4oC vòng 18 Những mẫu có kích thước nhỏ hoặc dễ tan có thể đặt tủ ấm (< 37oC) để rã đơng Quá trình rã đơng phải được thực vòng 15 phút III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH A Xác định dư lượng th́c kháng sinh nhóm tetracycline phương pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nhóm tetracycline thủy sản sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp có thể áp dụng để xác định các hợp chất: tetracyline (TC), oxytetracyline (OTC) chlortetracyline (CTC) Giới hạn phát của phương pháp 10 µg/kg Nguyên tắc Các kháng sinh nói mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4) Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) cột tách chiết pha đảo Sep-Pak Cartrige C18 Hàm lượng TC, OTC, CTC có dịch chiết được xác định bằng hệ thống HPLC với detector UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương 3.1 Metanol, loại dùng cho HPLC 3.2 Axetonitril, loại dùng cho HPLC 3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước bằng metanol bình định mức 000 ml Định mức tới vạch Dung dịch axit oxalic-metanol không bền, chỉ pha trước sử dụng 3.4 Dung dịch đệm McIlvaine, pH 4,0 ± 0,05, chuẩn bị sau: Hoà tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước bình định mức dung tích 000 ml, định mức tới vạch, thu được dung dịch A Hoà tan 21,0 g axit xitric ngậm phân tử nước bằng nước bình định mức, định mức tới vạch, thu được dung dịch B Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 000 ml dung dịch B Chỉnh pH tới 4,0 ± 0,05 bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1 M (sử dụng máy đo pH) Dung dịch đệm McIlvaine bền vòng tuần nhiệt độ phòng 3.5 Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA Hồ tan 60,5 g dinatri etylendinitrilotetraaxetat (EDTA) ngậm phân tử nước vào 625 ml dung dịch đệm Mcllvaine Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA bền vòng tuần nhiệt độ phòng 3.6 Pha động cho HPLC Hoà tan 1,26 g axit oxalic ngậm phân tử nước bằng nước bình định mức 000 ml Định mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril 166 ml methanol Lọc đuổi khí Dung dịch pha động khơng bền, chỉ pha trước sử dụng 3.7 Các dung dịch chuẩn gốc tetracycline, 000 µg/ml Cân 108 mg ± 0,1 mg loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi giấy chứng nhận) vào bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt Hòa tan định mức tới vạch 100 ml bằng metanol Bảo quản các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc nhiệt độ −20oC Các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc bền vòng tháng 3.8 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp tetracycline, 100 µg/ml Hút xác 10 ml các dung dịch kháng sinh chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml Định mức tới vạch bằng methanol 3.9 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp tetracycline, 25 µg/ml Hút xác 2,5 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch bằng methanol Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0oC đến 5oC Dung dịch bền vòng tuần 3.10 Dung dịch chuẩn hỗn hợp tetracycline, 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 1,00 µg/ml Hút xác 20; 40; 100; 200 400 ml dung dịch kháng sinh ch̉n hỗn hợp 25 µg/ml vào các bình định mức 10 ml Thêm ml dung dịch axit oxalic-metanol) vào bình Định mức tới vạch bằng nước Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ từ 0oC đến 5oC Dung dịch bền vòng tuần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, có thể cân xác đến 0,1 mg 4.2 Bình định mức, dung tích 10; 100 000 ml 4.3 Pipet, tự động điều chỉnh được từ ml đến10 ml 4.4 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 50 ml 4.5 Xơranh thủy tinh, dung tích 100 ml 4.6 Phễu Buchner, đường kính 5,5 cm 4.7 Giấy lọc 4.8 Dụng cụ đo pH 4.9 Máy ly tâm, tốc độ 5000 r/min, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml 4.10 Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min 4.11 Bể siêu âm 4.12 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml 4.13 Cột sắc ký pha đảo C8, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm 4.14 Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính 4,6 mm, kích thước hạt µm 4.15 Hệ thống HPLC, được trang bị detector UV 5 Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân 5,00 g ± 0,05 g mẫu (m) được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh thứ nhất Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống nghiền 30 s bằng máy nghiền Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm 10 tốc độ 3000 r/min 5.1.2 Gạn dịch của ống thứ nhất vào ống ly tâm thủy tinh thứ Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất Trộn đều, ly tâm ống 10 tốc độ 3000 r/min lại gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ nhất Trộn đều ly tâm ống 10 tốc độ 3000 r/min Tiếp tục gạn dịch vào ống ly tâm thủy tinh thứ 5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 20 tốc độ 000 r/min Sau đó, lọc dịch qua giấy lọc phễu Buchner Rửa ống ly tâm lần, lần rửa sử dụng ml dung dịch đệm McIlvaine – EDTA 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thủy sản được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm tetracycline Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống chuẩn bị với mẫu thử 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 ml dung dịch kháng sinh chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml vào 5,00 g mẫu trắng Đồng nhất mẫu bằng máy nghiền Tiến hành chuẩn bị mẫu giống chuẩn bị với mẫu thử 5.4 Làm sạch dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Nối cột Sep-Pak C18 vào đầu của xơranh thủy tinh dung tích 100 ml Thêm lần lượt 20 ml metanol, 20 ml nước vào xơranh thủy tinh Loại bỏ dung dịch chảy qua cột 5.4.2 Làm sạch dịch chiết 5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết ống ly tâm vào các cột Sep-Pak Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine-EDTA Trong giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracycline được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa cột Chú ý không được cột Sep-Pak khô giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột làm sạch dịch chiết Điều chỉnh cho dịch chảy khỏi cột từng giọt 5.4.2.2 Cho 20 ml nước vào xơranh thủy tinh cho chảy qua cột Loại bỏ dịch chảy khỏi cột Làm khơ cột bằng dòng khơng khí sạch 5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracycline bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axit oxalic-metanol chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/min Thu dịch khỏi cột vào bình định mức 10 ml Định mức tới vạch (thể tích V) bằng nước Tiến hành phân tích dịch thu được HPLC 5.5 Tiến hành phân tích HPLC 5.5.1 Điều kiện phân tích – cột sắc ký: – cột pha đảo C8; – nhiệt độ cột: – nhiệt độ phòng; – pha động: hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitril; – tốc độ dòng: 1,2 ml/min; – bước sóng cài đặt cho detector UV: 350 nm; – thể tích tiêm: 60 µl 5.5.2 Ổn định cột sắc ký 30 bằng pha động 5.5.3 Tiêm các dung dịch kháng sinh chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần, tính chiều cao pic trung bình Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được nồng độ (µg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính (y = ax + b) Đường chuẩn đối với kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hoặc bằng 0,995 5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPL Mỗi dung dịch mẫu tiêm lần Tính giá trị trung bình CHÚ THÍCH: Sau phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn hợp: nước - metanol - axetonitril theo tỷ lệ 7:1:2 (thể tích) 30 5.5.5 Đối với các mẫu chứa 0,5 µg/g kháng sinh nhóm tetracycline, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch kháng sinh chuẩn cột C18 chạy chế độ cột C8 so sánh thời gian lưu của pic mẫu pic chuẩn Tính kết quả Hàm lượng của từng kháng sinh nhóm tetracycline có mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam kilogam (µg/kg) được tính theo cơng thức sau: đó Y hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết chiều cao pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài; a, b các hệ số của đường chuẩn y = ax + b; V thể tích dịch chiết thu được sau làm sạch (xem 5.4.2.3), tính bằng mililit m khối lượng mẫu sử dụng (xem 5.1.1), tính bằng gam (g) (ml) Độ lặp lại độ thu hồi 7.1 Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại, CVS, tính theo chiều cao pic sắc ký của lần tiêm dung dịch kháng sinh chuẩn phải nhỏ 0,5 % 7.2 Độ thu hồi Độ thu hồi, R, được xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 % Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không được quy định tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi tự chọn bất kỳ chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; B Xác định dư lượng thuốc kháng sinh nhóm penicillin thủy sản phương pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng các chất kháng sinh nhóm penicillin thuỷ sản sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC) Phương pháp có thể xác định các hợp chất: penicillin G (benzylpenicillin), penicillin V (phenoxymethylpenicillin), amoxicillin, ampicillin, oxacillin, nafcillin, cloxacillin dicloxacillin Giới hạn phát của phương pháp: đối với penicillin G: µg/kg; penicillin V: µg/kg; amoxicillin: 10 µg/kg; ampicillin: µg/kg; oxacillin: µg/kg; nafcillin: µg/kg; cloxacillin: µg/kg dicloxacillin: 11 µg/kg Nguyên tắc Các chất thuộc nhóm penicillin được chiết khỏi mẫu sản phẩm thủy sản bằng dung dịch đệm phosphat pH = 9, sau đó làm sạch cô đặc dịch chiết cột chiết pha rắn C18 Tiến hành tạo dẫn xuất của các chất thuộc nhóm penicillin với anhydrit benzoic nhiệt độ 50 0C, sau đó với 1,2,4-triazol thuỷ ngân (II) clorua nhiệt độ 65 0C định lượng bằng HPLC với detector UV bước sóng 325 nm theo phương pháp ngoại chuẩn Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương 3.1 Axetonitril 3.2 Metanol 3.3 Isooctan 3.4 Dung dịch NaOH, mol/l - Hoà tan 20,0 g NaOH 100 ml nước 3.5 Dung dịch NaOH, mol/l - Hoà tan 4,0 g NaOH 50 ml nước 3.6 Dung dịch NaCl, % - Hoà tan 20,0 g NaCl nước để có l dung dịch 3.7 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = 6,0 - Hoà tan 9,938 g Na2HPO4; 20,278 g NaH2PO4.2H2O; 7,788 g Na2S2O3.5H2O; 13,582 g C16H37NO4S (tetrabutylamoni hydrosulfat) 800 ml nước định mức đến vạch để có 2l Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc Milipore 0,45 µm - Dung dịch có thể bảo quản được ngày nhiệt độ từ +2oC đến +8oC 3.8 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = - Dùng dung dịch NaOH mol/l để chỉnh 250 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l pH = tới pH = - Chuẩn bị dung dịch để sử dụng tuần 3.9 Dung dịch đệm phosphat, 0,1 mol/l, pH = - Hòa tan 14,196 g Na2HPO4 khan nước định mức để có l dung dịch - Chuẩn bị dung dịch chiết để sử dụng tuần giữ nhiệt độ phòng 3.10 Dung dịch anhydrit benzoic, 0,2 mol/l - Hoà tan 2,262 g anhydrit benzoic [(C6H5CO)2O] vào 50 ml axetonitril định mức tới vạch bình thuỷ tinh màu - Bảo quản dung dịch chai màu nâu, tránh ánh sáng 3.11 Dung dịch thuỷ ngân (II) clorua, 0,1 mol/l - Hoà tan 0,2715 g thuỷ ngân (II) clorua (HgCl2) 10 ml nước CẢNH BÁO: Dung dịch HgCl2 rất độc, tránh để da tiếp xúc trực tiếp với HgCl2 3.12 Dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất - Hoà tan 13,78 g 1,2,4-triazol (C2H3N3) với 60 ml nước cốc 100 ml, thêm 10 ml HgCl2 0,1 mol/l Dùng NaOH mol/l để chỉnh pH = 9,0 ± 0,5 Sau đó, chuyển tồn sang bình định mức màu nâu định mức đến 100 ml bằng nước - Dung dịch thu được bão hoà HgCl2 có màu trắng đục, để tối ưu quá trình tạo dẫn xuất dung dịch phải được điều chế trước sử dụng nhất 24 h phải khuấy mạnh trước lần sử dụng - Bảo quản dung dịch phản ứng tạo dẫn xuất nhiệt độ +4oC, nơi tránh ánh sáng Dung dịch bền tháng 3.13 Dung dịch rửa giải cột C18, tỷ lệ 50:50 - Trộn 50 ml nước 50 ml axetonitril - Chuẩn bị dung dịch để sử dụng ngày 3.14 Dung dịch để hoà tan các chất chuẩn, tỷ lệ 50:50 - Trộn 50 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH = 50 ml axetonitril Chuẩn bị dung dịch để sử dụng ngày 3.15 Dung dịch pha động, tỷ lệ 65:35 - Trộn 350 ml axetonitril 650 ml dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l pH = 6,0 - Chuẩn bị pha động để sử dụng ngày hoặc phối trộn qua bơm HPLC 3.16 Các chất chuẩn nhóm penicillin 3.16.1 Chất chuẩn penicillin G, dạng axit, 93,4 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.2 Chất chuẩn penicillin V, dạng axit, 89,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.3 Chất chuẩn amoxicillin ngậm ba phân tử nước, dạng axit, 86,3 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.4 Chất chuẩn natri ampicillin, 92,2 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.5 Chất chuẩn natri oxacillin, 85,5 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.6 Chất chuẩn natri nafcillin, 82,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.7 Chất chuẩn natri cloxacillin, 87,8 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.16.8 Chất chuẩn natri dicloxacillin, 95,3 %, SIGMA Chemical hoặc loại tương đương 3.17 Các dung dịch chuẩn gốc nhóm penicillin 3.17.1 Dung dịch chuẩn gốc penicillin G (SM1), 0,5 g/l Cân xác 0,053 g chất chuẩn penicillin G có 93,4 % hoạt tính vào cốc có mỏ, hoà tan bằng nước Sau đó, chuyển toàn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.2 Dung dịch chuẩn gốc penicillin V (SM2), 0,5 g/l Cân xác 0,055 g chất chuẩn penicillin V có 89,8 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.3 Dung dịch chuẩn gốc amoxicillin (SM3), 0,5 g/l Cân xác 0,057 g chất chuẩn amoxicillin ngậm ba phân tử nước (3.16.3) có 86,3 % hoạt tính vào cốc có mỏ (4.3), hoà tan bằng nước Sau đó, chuyển toàn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml (4.5) định mức bằng nước 3.17.4 Dung dịch chuẩn gốc ampicillin (SM4), 0,5 g/l Cân xác 0,054 g chất chuẩn natri ampicillin có 92,2 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.5 Dung dịch chuẩn gốc oxacillin (SM5), 0,5 g/l Cân xác 0,058 g chất chuẩn natri oxacillin có 85,5 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.6 Dung dịch chuẩn gốc nafcillin (SM6), 0,5 g/l Cân xác 0,060 g chất chuẩn natri nafcillin có 82,8 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.7 Dung dịch chuẩn gốc cloxacillin (SM7), 0,5 g/l Cân xác 0,056 g chất chuẩn natri cloxacillin có 87,8 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.17.8 Dung dịch chuẩn gốc dicloxacillin (SM8), 0,5 g/l Cân xác 0,052 g chất chuẩn natri dicloxacillin có 95,3 % hoạt tính, hồ tan bằng nước Sau đó, chuyển tồn dung dịch vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml định mức bằng nước 3.18 Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicillin Hút xác 50 µl dung dịch ch̉n gốc từ SM1 đến SM4 300 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 10 ml định mức bằng nước 3.19 Các dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của nhóm penicillin 3.19.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (ST1) Hút xác 125 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 375 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml định mức bằng nước 3.19.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (ST2) Hút xác 250 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 750 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml định mức bằng nước 3.19.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (ST3) Hút xác 500 µl dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 1,5 ml dung dịch chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml định mức bằng nước 3.19.4 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc (ST4) Hút xác ml dung dịch chuẩn gốc từ SM1 đến SM4 ml dung dịch chuẩn gốc từ SM5 đến SM8 vào các bình định mức màu nâu dung tích 50 ml định mức bằng nước CHÚ THÍCH: Các dung dịch từ ST1 đến ST4 được chuẩn bị hàng tháng phải bảo quản buồng lạnh (nhiệt độ từ 2oC đến 4oC) tối Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, có thể cân xác đến 0,1 mg 4.2 Dụng cụ phân phối dung môi, loại 10 20 ml 4.3 Cốc có mỏ, dung tích 100 ml 4.4 Pipet tự động, 100; 200 µl, được trang bị đầu hút pipetman 4.5 Bình nón nút mài 4.6 Ống nghiệm thuỷ tinh, dung tích 50 ml 4.7 Ống ly tâm, có nút, dung tích 50 ml 4.8 Máy lắc ống nghiệm, Vortex hoặc loại tương đương 4.9 Máy khuấy từ, NUOVA7 hoặc loại tương đương 4.10 Máy khuấy quay, Rheax hoặc loại tương đương 4.11 Máy ly tâm 4.12 Dụng cụ đo pH, Accumet 10 hoặc loại tương đương 4.13 Máy nghiền, Siemens hoặc loại tương đương 4.14 Bể siêu âm, Bransonic 220 hoặc loại tương đương 4.15 Bể điều nhiệt, có thể trì nhiệt độ 50oC 65oC, Polytest hoặc loại tương đương 4.16 Bơm chân không, dùng cho hệ chiết pha rắn, N79KN18 hoặc loại tương đương 4.17 Thiết bị lọc, được trang bị màng lọc HVLP 0,45 µm hoặc loại tương đương 4.18 Cột chiết pha rắn, Bond Elut C18, dung tích ml, 500 mg hoặc loại tương đương 4.19 Hệ chiết pha rắn, VAC-ELUT hoặc loại tương đương 4.20 Hệ thống HPLC, được trang bị sau: – bơm HPLC; – detector UV; – phận tiêm mẫu tự động; – cột pha đảo C8, dài 150 mm, đường kính 3,9 mm, kích thước hạt µm; – tiền cột C8, dài mm, đường kính mm, kích thước hạt µm; – hệ thống xử lý số liệu (Thermo Separation Products) gồm giao diện (loại SN4000), máy tính, phần mềm điều khiển thiết bị xử lý sắc ký (loại PC1000 phiên bản 3.03) hoặc loại tương đương Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Nghiền 200 g mẫu sản phẩm thủy sản bằng máy nghiền Cân 5,0 g mẫu được nghiền, xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm 50 ml 5.1.2 Dùng thiết bị phân phối dung môi cho 30 ml dung dịch đệm phosphat pH = vào ống ly tâm 50 ml chứa g mẫu thử được nghiền lắc máy lắc ống nghiệm 5.1.3 Thêm 20 ml isooctan vào ống ly tâm, tiếp tục lắc Sau đó, đồng nhất toàn máy khuấy quay 10 5.1.4 Ly tâm dung dịch 10 với gia tốc 200 × g, tốc độ 500 r/min nhiệt độ 10oC hút bỏ phần dịch isooctan phía Sau đó, chuyển toàn pha nước sang ống nghiệm sạch 50 ml chỉnh pH về khoảng đến bằng NaOH mol/l 5.1.5 Tiến hành làm sạch mẫu theo 5.5 tạo dẫn xuất theo 5.6 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu sản phẩm thủy sản được xác định không có penicillin Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng, làm sạch tạo dẫn xuât đối với mẫu thử theo 5.1, 5.5 5.6 5.3 Chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi, nồng độ 50 µg/kg 300 µg/kg Thêm xác 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicillin vào 5,0 g mẫu trắng Tiến hành chuẩn bị làm sạch mẫu xác định độ thu hồi (50 µg/kg 300 µg/kg) làm sạch tạo dẫn xuất đối với mẫu thử theo 5.1, 5.5 5.6 5.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp các penicillin STD dùng để dựng đường chuẩn 5.4.1 Dung dịch chuẩn được chuẩn bị hàng ngày tiến hành phân tích bằng cách pha lỗng các dung dịch ST1, ST2, ST3, ST4 ống nghiệm với ml dung dịch pha lỗng Tiến hành sau: – STD0: 100 µl dung dịch hồ lỗng chất ch̉n; – STD1: 100 µl ST1 thêm 900 µl dung dịch hồ tan chất chuẩn; – STD2: 100 µl ST2 thêm 900 µl dung dịch hồ tan chất ch̉n; – STD3: 100 µl ST3 thêm 900 µl dung dịch hồ tan chất chuẩn; – STD4: 100 µl ST4 thêm 900 µl dung dịch hòa tan chất chuẩn 5.4.2 Tiếp tục thực bước tạo dẫn xuất theo 5.6 5.5 Làm sạch mẫu 5.5.1 Hoạt hoá cột Gắn cột chiết pha rắn lên giá đỡ, sau đó gắn bình chứa 50 ml lên cột Thêm lần lượt 10 ml metanol, 10 ml nước, ml dung dịch NaCl % ml dung dịch đệm chiết pH = Cho dịch chiết thu được lên bình chiết cột được hoạt hoá CHÚ THÍCH: Khơng để cột bị khơ quá trình hoạt hoá cột Thêm dung dịch cần làm sạch hết dung dịch đệm chiết hoặc chút dung dịch đệm chiết 5.5.2 Hút hỗn hợp với lưu lượng ml/min thêm ml dung dịch NaCl % ml nước Tiến hành hút kiệt vòng min, ngừng hút chân không 5.5.3 Đặt ống ly tâm ml dưới cột rót ml dung dịch rửa giải lên cột Để ngấm pha rắn khoảng trước hút chân không dịch rửa giải với tốc độ ml/min 5.5.4 Sau rửa giải xong, thể tích dịch rửa giải khoảng 900 µl, chỉnh đến ml bằng dung dịch rửa giải bình nón nút mài 5.6 Tạo dẫn xuất 5.6.1 Điều chỉnh pH của dịch rửa giải khoảng đến bằng dung dịch NaOH mol/l Thêm cẩn thận vào dung dịch rửa giải thu được 50 µl dung dịch anhydit benzoic 0,2 mol/l, lắc 10s máy lắc ống nghiệm 5.6.2 Để phản ứng trong bể điều nhiệt nhiệt độ 50oC thêm 500 µl dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất Khuấy mạnh bình chứa dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất hoặc đặt bể siêu âm Đậy nút lắc hỗn hợp thu được máy lắc ống nghiệm 10s 5.6.3 Để phản ứng xảy 10 bể điều nhiệt nhiệt độ 65oC Sau đó, làm lạnh dưới vòi nước đến nhiệt độ bình thường, tránh ánh sáng ly tâm 10 2000 × g 5.7 Tiến hành phân tích HPLC 5.7.1 Điều kiện phân tích a) Pha động: dung dịch pha động; b) Lưu tốc: 1,0 ml/min; c) Bước sóng phát hiện: 325 nm; d) Thể tích tiêm mẫu: 200 µl; e) Nhiệt độ cột: 20oC; f) Thời gian lưu: theo Bảng Bảng − Thời gian lưu của các chất thuộc nhóm penicillin Tên chất Thời gian lưu, Tên chất Thời gian lưu, Amoxiciin 5,5 ± 0,2 Oxacillin 14,2 ± 0,5 Penicillin G 7,6 ± 0,2 Nafcillin 16,9 ± 0,6 Penicillin V 9,0 ± 0,3 Cloxacillin 17,9 ± 0,7 Ampicillin 11,5 ± 0,4 Dicloxacillin 27,5 ± 1,0 5.7.2 Tiêm các dung dịch tạo dẫn xuất Tiêm các dung dịch tạo dẫn xuất theo thứ tự: − dung dịch chuẩn tạo dẫn xuất với mức nồng độ khác Dựng đường chuẩn y= ax + b theo quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic các chuẩn penicillin nồng độ tương ứng (tính theo microgam lit); − dung dịch mẫu trắng tạo dẫn xuất; − dung dịch mẫu xác định độ thu hồi 50 µg/kg 300 µg/kg tạo dẫn xuất; − dung dịch mẫu thử tạo dẫn xuất Quy trình có thể được lặp lại cần thiết CHÚ THÍCH 1: Tiêm 200 µl nước trước lần phân tích mẫu mới CHÚ THÍCH 2: Thay đổi tiền cột sau khoảng 30 mẫu đến 40 mẫu CHÚ THÍCH 3: Sau phân tích xong, dùng hỗn hợp axetonitril nước theo tỷ lệ 50:50 để làm vệ sinh bơm tiêm mẫu Rửa cột với hỗn hợp với tỷ lệ 90:10 60 Nếu ngừng chạy thời gian dài, nên rửa cột với hỗn hợp trên, sau đó với metanol khoảng 30 min, tiếp đến với axetonitril 30 Sau đó, lặp lại với methanol 30 cuối bằng nước 60 Tính kết quả 6.1 Tính hàm lượng các chất thuộc nhóm penicillin Hàm lượng của từng hợp chất nhóm penicillin mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam kilogam (µg/kg) được tính theo cơng thức sau: đó Y diện tích pic của các chất thuộc nhóm penicillin có mẫu thử; b tung độ góc của đường chuẩn; a hệ số góc của đường chuẩn; V thể tích dịch chiết tạo dẫn xuất, tính bằng milinit (ml); m khối lượng mẫu thử nghiền được lấy để đem ly tấm, tính bằng gam (g); hiệu śt thu hồi trung bình tính từ mẫu xác định độ thu hồi 6.2 Tính hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi, R, được tính từ kết quả của mẫu xác định độ thu hồi theo cơng thức sau: đó Ysup diện tích pic của mẫu xác định độ thu hồi; Ystd diện tích pic của chất chuẩn với nồng độ tương ứng Hiệu suất thu hồi trung bình của mẫu xác định độ thu hồi, sau: , được tính theo cơng thức đó R1 R2 hiệu suất thu hồi của mẫu xác định độ thu hồi (nồng độ kháng sinh tương ứng 50 µg/kg 300 µg/kg Độ thu hồi độ lặp lại Độ thu hồi (R) độ lệch chuẩn lặp lại giữa hai lần tiêm (CV) của loạt mẫu phân tích được quy định Bảng Bảng − Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Tên chất Hiệu suất thu hồi % Độ lệch chuẩn lặp lại % Amoxicillin 75 ± 18 Penicillin G 74 ± 17 Penicillin V 75 ± 30 13 Ampicillin 74 ± 13 Mẫu có bổ sung 50 µg/kg Mẫu có bổ sung 300 µg/kg Oxacillin 65 ± 18 Nafcillin 64 ± 22 12 Cloxacillin 60 ±16 Dicloxacillin 48 ± 17 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; d) thao tác không được quy định tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi tự chọn bất kỳ chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được ... lạm dụng hóa chất, kháng sinh sản xuất, kinh doanh nuôi trồng, bảo quản, sơ chế chế biến thủy sản, góp phần khắc phục tình trạng gây nhiễm dư lượng hóa chất, kháng sinh các... những sản phẩm khơng đảm bảo chất lượng, an tồn thực phẩm - Ba là, Tuyệt đối không sử dụng hóa chất, kháng sinh cấm hoặc hóa chất, kháng sinh không rõ nhãn mác, nguồn gốc xuất... việc thu mẫu phân tích kiểm soát dư lượng, để kịp thời phát khắc phục các mối nguy về dư lượng hóa chất, kháng sinh; tạo nên sản phẩm sạch, chất lượng, an toàn, bảo vệ sức khỏe