i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC NI TRỒNG THỦY SẢN Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Mã số : 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS LƯƠNG THỊ HỒNG VÂN TS TRẦN ĐỨC HẠNH THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thùy Linh LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu lớp Cao học công nghệ sinh học trường đại học Khoa Học, nhận giúp đỡ, giảng dạy nhiệt tình thầy giáo, cô giáo nhà trường Nhân dịp xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể thầy giáo, cô giáo; đặc biệt thầy, cô môn Khoa học sống, Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa học PGS TS Lương Thị Hồng Vân TS Trần Đức Hạnh – CTHĐQT công ty cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet trực tếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Cù Hữu Phú ThS Âu Xuân Tuấn cung cấp tài liệu ý kiến q báu để tơi hồn thiện đề tài nghiên cứu Tôi chân thành cám ơn tới Giáo sư, Tiến sỹ trình đọc luận văn có nhận xét tinh tế, sắc sảo, giúp tơi sửa chữa thiếu sót Xin cám ơn ban Giám Đốc, phòng ban đồng nghiệp công ty Cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet tạo điều kiện thời gian cổ vũ, động viên tơi suốt q trình thực đề tài Xin trân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thùy Linh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Vi khuẩn quang hợp : VKQH Bacteriochlorophyll : B chl BT : Bào tử KL : Khuẩn lạc TH : Thu hồi LM : Lên men CFU : Đơn vị khuẩn lạc CP : Chế phẩm CTV : Cộng tác viên 10.OD : Mật độ quang 11.DO : Oxi hòa tan 12.COD : Nhu cầu oxi hóa 13.BOD : Nhu cầu oxi sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i MỤC LỤC vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình phát triển nghề ni trồng thủy sản Việt Nam 1.1.1 Hiện trạng nuôi trồng dịch bệnh hoạt động nuôi trồng thủy sản 1.1.2 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản 1.2 Giới thiệu chung Probiotic 1.2.1 Định nghĩa probiotic 1.2.2 Vai trò probiotic 1.2.3 Những nhóm vi sinh vật thường sử dụng sản xuất probiotic 1.2.4 Vi khuẩn Bacillus 11 1.2.5 Vi khuẩn Lactobacillus 14 1.2.6 Vi khuẩn quang hợp ta 18 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn 20 1.3 Đặc điểm số đánh giá nước nuôi trồng thủy sản 21 1.3.1 Đặc điểm nước nuôi tôm cá 21 1.3.2 Những số đánh giá nước nuôi tôm cá 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.3.3 Yêu cầu nước nuôi tôm cá 24 1.4 Các bệnh thường xảy cho tôm ao nuôi bị nhiễm bẩn 25 1.5 Ứng dụng Chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản 27 1.6 Một số sản phẩm probiotic dùng chăn nuôi thủy sản thị trường 29 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu lý chọn đối tượng nghiên cứu 31 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 32 2.2.1 Hóa chất 32 2.2.2 Thiết bị 32 2.3 Môi trường nghiên cứu 33 2.3.1 Môi trường MRS (g/l) 33 2.3.2 Môi trường SA (g/l) 33 2.3.3 Môi trường MPA (g/l) 33 2.3.4 Dung dịch vi lượng (g/l) 34 2.3.5 Hỗn hợp vitamin (mg/ml) 34 2.4 Phương pháp nghiên cứu xác định tiêu nghiên cứu 34 2.4.1 Phương pháp lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học 34 2.4.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân giống 35 2.4.3.Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 36 2.4.4 Phương pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu 37 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết nghiên cứu tuyển chọn giống sản xuất 39 3.1.1 Chọn chủng có hoạt tính sinh học ổn định, an tồn với vật ni 39 3.1.2 Xác định điều kiện nhân giống 42 3.2 Kết nghiên cứu quy trình lên men sản xuất chế phẩm 47 3.2.1 Lên men chìm 47 3.2.2 Kết nghiên men Bacillus, Lactobacillus mơi trường xốp 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 30 C/ 48h tĩnh, Nhân giống cấp 1; 2; chiếu sáng Lên men chìm Lên men mt xốp Thu hồi sinh khối Làm khô Nghiền Kiểm tra chất lượng Trộn Kiểm tra chất lượng Chất bảo quản Trộn Chất bảo quản Kiểm tra pH Kiểm tra độ ẩm Ra chai Đóng túi Hình 3.6: Quy trình sản xuất chế phẩm Nhân giống: Chủng B.subtilis DA từ ống giống giữ glycerol hoạt hóa mơi trường thạch MPA 3, kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 150ml mơi trường MPA lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 37 C, 24 Nhân giống cấp II vào bình trung tính 500ml chứa 250ml mơi trường MPA lỏng, bổ sung giống tỷ lệ 10%, lắc 200 v/p, 37 C, 16-24 Giống cấp III nhân bình nhỏ hệ thống lên men sục khí Bình dung tích 15 lít chứa 10 lít mơi trường MPA lỏng, sục khí nhẹ, khấy 500 v/p Khơng khí cấp từ máy nén khí tự động, qua cột lọc vơ trùng vào bình nhân giống Lên men sục khí 8-10 giờ, 37 C Chủng L.acidophillus TN từ ống giống đơng khơ, hoạt hóa mơi trường thạch MRS, nuôi cấy 34 C 48 Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tnh sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200ml mơi trường MRS lỏng, nuôi tĩnh 34 C, 24 Giống cấp II nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tnh 500ml có 300ml mơi trường MRS lỏng, nuôi tnh 34 C, 24 Giống cấp III nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tnh lít chứa 600ml môi trường MRS lỏng, nuôi tnh 34 C, 24 Chủng R.palustris RD từ ống giống hoạt hóa ống nghiệm chứa môi trường SA lỏng, nuôi cấy tĩnh, chiếu sáng 48 giờ, 30 C Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tnh sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200 ml mơi trường SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 30 C, 48 Giống cấp II nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tính 500ml có 300ml mơi trường SA lỏng, nuôi tĩnh, chiếu sáng, 30 C, 48 Giống cấp III nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tính lít chứa 600ml môi trường SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 30 C, 48 Lên men chìm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD Lên men chìm tiến hành hệ thống lên men sục khí tự động hãng Sartorius – Đức (hình 3.5) Hình 3.7: Hệ thống lên men sục khí hãng Sartorius – Đức Giống B.subtilis DA nhân theo cấp để đạt lượng giống cần cho mẻ lên men (50 lít/ mẻ) Giống chuyển từ bình lên men nhỏ sang bình lên men lớn qua đường dẫn tiệt trùng khép kín Lên men sục khí tiến hành bình lên men lớn, sục khí 130%, khuấy 500 v/p, 37 C, 24 Lên men chìm L.acidophillus TN thực bình nagel tệt trùng có dung tích 20 lít chứa 16 lít mơi trường MRS Hỗn dịch vi khuẩn sau nhân giống cấp III chuyển sang bình lên men tỷ lệ 10% Lên men 24 34 C điều kiện tĩnh Canh trùng R.palustris RD sau nhân giống cấp III chuyển sang bình trung tính dung tch 20 lít có chứa 16 lít mơi trường SA lỏng, ni cấy tĩnh 30 C, chiếu sáng liên tục ngày Lên men chìm B.subtilis DA L.acidophillus TN Lên men B.subtilis DA môi trường xốp thực túi PE kích thước 40×60 cm Giống B.subtilis DA trộn với bột gạo, bột cám loại bỏ trấu, bổ sung giống với tỷ lệ 30% để đảm bảo độ ẩm thích hợp cho q trình lên men Đóng hỗn hợp lên men vào túi PE độ thơng khí 1/3 ( thể tích mơi trường/ thể tích túi), lên men 48 Lên men L.acidophillus TN môi trường xốp thực túi PE, 48 Trộn bột đậu tương, bột gạo, bổ sung đường glucoza sucrose, bổ sung giống tỷ lệ 30%, trộn Đóng vào túi PE với độ thơng khí 1/2 ( thể tích mơi trường/ thể tích túi) Sản xuất chế phẩm Chế phẩm lên men B.subtilis DA làm khô Đồng thời chế phẩm lên men L.acidophillus TN làm khơ Sau nghiền thành bột trộn với cho tổng số tế bào vi khuẩn gam chế phẩm đạt 10 loài B.subtilis DA L.acidophillus TN Đóng túi tráng kẽm 1kg/1 túi Chế phẩm dạng dịch sản xuất từ dịch lên men L.acidophillus TN bổ sung chất bảo quản, sau trộn với dịch lên men B.subtilis DA R.palustris RD tỷ lệ (L.acidophilus TN: R.palustris RD : B.subtlis DA – 4:2:4) chiết chai lít/1 chai Kiểm tra chất lượng chế phẩm Kiểm tra độ tinh khiết chế phẩm môi trường thạch tương ứng chủng B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD Cân 1g chế phẩm, pha loãng với nước muối sinh lý cho trải mặt đĩa thạch , vi khuẩn mọc riêng rẽ Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm tế bào quan sát kính hiển vi Chế phẩm bao gồm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD mà khơng có loại khác Kiểm tra số lượng tế bào 1g ml chế phẩm Cân 1g hút 1ml chế phẩm, pha loãng theo bậc đến 10 -8 với nước muối sinh lý Nhỏ 0,1 ml dung dịch chế phẩm pha loãng nồng độ pha lỗng sang đĩa thạch mơi trường tương ứng chủng vi khuẩn Nuôi cấy 48 L.acidophillus TN R.palustris RD, 24 B.subtilis DA Đếm số khuẩn lạc có đĩa petri KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính tính chất phù hợp để sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học: Chủng B.subtlis DA có hoạt lực enzyme phân hủy hữu mạnh; Chủng L.acidophillus TN có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn; Chủng R.palustris RD có khả sử dụng nguồn hữu nguồn nước thải, cải thiện màu nước Các chủng lựa chọn có đặc tính chịu mặn cao an tồn động vật thí nghiệm Xác định điều kiện tối ưu lên men sản xuất chế phẩm - Mơi trường điều kiện thích hợp để nhân giống B.subtilis DA MPA3, nhiệt độ 28-37 C, tỷ lệ giống từ 7,5% Độ thông khí 130% oxy - Điều kiện ni cấy thích hợp với L.acidophillus TN môi trường MRS, nhiệt độ 34 C, tỷ lệ giống 5-10%, độ thơng khí 12-16/20 (lít) - Điều kiện ni cấy tối ưu để nhân giống R.palustris RD môi trường SA bổ sung biotin, p-aminobenzoix acid, pH môi trường 6-8,5 Nhiệt độ nuôi cấy 25-30 , độ thơng khí 12-16/20 (lít) Tạo chế phẩm probiotic từ sinh khối bảo quản chế phẩm - Lên men chìm tạo chế phẩm dạng dịch: L.acidophillus TN, B.subtlis DA, R.palustris RD đạt chất lượng 10 CFU/ml - Lên men môi trường xốp tạo chế phẩm dạng bột: L.acidophillus TN, B.subtilis DA đạt chất lượng 10 CFU/ml - Đã xây dựng công thức bảo quản chế phẩm thời gian 12 tháng Xây dựng têu chuẩn sở quy trình kiểm nghiệm chế phẩm probiotc Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng nghiên cứu Kiến nghị - Nghiên cứu thêm thành phần bổ sung vào chế phẩm nhằm đa dạng hóa nâng cao hiệu sử dụng sản phẩm - Thử nghiệm đánh giá chất lượng chế phẩm thực địa TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Chính (2004), “Một số suy nghĩ vấn đề nuôi tôm sú (P.monodon) bền vững Việt Nam”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản Vũng Tàu, tr.75-78 Nguyễn Tử Cương (2005), Sổ tay hướng dẫn thực hành nuôi tốt tôm sú (GAP) thâm canh Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr.15-20 Nguyễn Văn Hảo (2004), Một số bệnh thường gặp tôm sú (Pemacus monodon), phương pháp chuẩn đốn biện pháp phòng trị, Nxb Nơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Giáo trình thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế Lê Thành Lựu (2004), “Thành tựu, thách thức, định hướng kiến nghị công tác Khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.25-39 Lương Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, Nxb Giáo dục, tr.322-328 Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Xuân Sinh, Nguyễn Thị Phương Nga (2004) “Những nhận xét liên quan đến việc cung cấp sử dụng hóa chất, thuốc ni trồng thủy sản Đồng Bằng sơng Cửu Long”, Tuyển tập hội thảo tồn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.229-256 Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Bùi Quang Mạnh (2004), “Nghiên cứu xây dựng giải pháp kỹ thuật nuôi tôm sú, cá basa cá tra đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.117-132 10 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tơm biện pháp phòng trị, Nxb Nơng Nghiệp 11 Nguyễn Văn Thành (2000), “Đánh giá trình độ công nghệ nuôi tôm bán thâm canh Việt Nam”, Các cơng trình nghiên cứu khoa học ngành thủy sản 1996-2000, tr.151-166 12 Võ Thị Thứ (2003), “Đặc điểm sinh học số chủng Bacillus Lactobacillus có khả ứng dụng để xử lý môi trường nuôi tôm cá”, Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr.388-391 13 Võ Thị Thứ , Trương Ba Hùng, Nguyễn Minh Dương, La Thị Nga, Lệ Thị Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trường Sơn, Đào Thị Thanh Xuân, Nguyễn Liêu Ba (2004), “Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis, Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nước nuôi thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.815-821 Tiếng Anh 14 Aralampalam P.(1998), “Water quality and Bacterial populatons in a Tropical marine eage culture farm”, In Aquaculture Reseach 29, pp.617-624 15 Austn F., Stuckey L S (1995), A probiotc strains of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases cáued by Aeromonas salnimonicisa, Vibrio anguillarum and Vibrio ordallii, Journal of Fish Disease 18, pp.93-96 16 Ian L B., Kenneth J., Robert N G (2000), Probiotic compositons, US patent No: 6, 060, 050 17 Fekelharing G., Van L (2003), “Method of preparing a probiotc preparation”, Patent Cooperation Treaty (PCT): WO 03/085097 18 Imhoff J.F., Truper H.G., and Pfennig N.(1984), “Rearrangement of the species and genera of the phototrophic purplr non – sunfur bacteria”., Int J.Syst Bacteriol 34., pp.340-343 19 Keeton J A., Williams D P (2003), Probiotic formulaton and Method for reduction of Pathogenic bacteria US Patent No: US 200310491 20 Gordon R E., Hayner W C., Pang N H (1973), The genus Bacillus, United states Deparment of Agriculture Washington DC 70 21 Gordon R E (1981), One hundred and seven years of the genus Bacillus, The aerobic endospore forming bacteria, Clasification and identification: 115 London Academic Press 22 Molin G., Jeppsson B., Johansson L M, Ahrne S., Noback S., Stahl M and Bengmark S (1993), Numerial Taxonomy of Lactobacillus sp, Associated with healthy and diseased of the human intestines 23 Logan Walter T, Barlett Stephen L (1998), Water treatment with larger numbers of nonpathogenic bacteria to improve yield of aquatc animals, US patent No: US 5746155 24 Mark O., Genadi B (2001), Bacterial strain, prrocessed plant extracts, compositon containing sam, processed for their preparaton and their therapeutc and industrial applicaton, US patent No: 2001/0001711A1 25 Sirirat Dengripat et al (1998), Effects of probiotic bacterium on black tger shimp penaeus monodon survival and growth, in Aquaculture167,pp.301-313 26 Watson Brenda F., Watson T S (2002), Probiotic formulation, US patent No: US 6468525 27 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66, pp 65–78 28 Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1−8 29 Schillinger U (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64, pp 158-164 30 Pfenning N (1969), “Rhodopseudomonas acidophila sp.n., a new species of budding nonsulfua bacteria”, J.bacteria 99, pp.507-602 Website 31 http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi-trong-thuy-san/b-nuoi-thuy-san/tinhhinh- san-xuat-nuoi-trong-thuy-san-6-thang-111au-nam-2013/ 71 PHỤ LỤC Hình 1: Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtillis thạch máu Hình 2: Hình thái vi khuẩn Bacillus kính hiển vi ( phóng đại 1000 lần) 72 Hình 3: Hình thái khuẩn lạc L.acidophillus thạch MRS Hình 4: Hình thái vi khuẩn L.acidophillus kính hiển vi ( phóng đại 1000 lần) 73 Hình 5: Khả sinh Cellulase B.lichenifomis (5), B.subtllis (6), L.acidophillus (7), B.megaterium (8) Hình 6: Khả sinh Protease B.subtlis DA, B.lichenifomis G1, B.megaterium PA 74 Hình 7: Khả sinh Amylase B.lichenifomis (5), B.subtllis (6), L.acidophillus (7), Đối chứng dương (8) ... Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Lactobacillus, Bacillus Rhodospirillaceae dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản ” Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn chủng. .. HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI TRƯỜNG... trường nước nuôi thủy sản Nội dung nghiên cứu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tnh tính chất phù hợp để sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học xử lý môi trường nước nuôi trồng thủy sản - Xác định