MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong xã hội cơng nghiệp hóa nay, mặt sống ngƣời ngày đƣợc cải thiện, đời sống đƣợc nâng cao nhƣng cơng nghiệp hóa làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội nhƣ: tiểu đƣờng, mỡ máu, béo phì… Chính vậy, nhà dƣợc học, thực vật học ln mong muốn tìm lồi thực vật dùng làm thuốc hay làm thức ăn phòng chữa trị đƣợc bệnh Cây Nƣa (Amorphophallus spp.) đƣợc dùng làm thức ăn từ lâu đời Trung Quốc nƣớc Đông Nam Á Ở Trung Quốc Nhật Bản, bột từ củ Nƣa đƣợc chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhƣ mì, miến, thạch, bánh, kẹo Hơn nữa, bột Nƣa có chứa đƣờng glucomannan với hàm lƣợng cao, giúp làm giảm mỡ máu, chống béo phì đƣợc chế biến thành viên giảm béo loại thực phẩm chức phổ biến Ngồi ra, bột Nƣa đƣợc sử dụng mỹ phẩm làm đẹp da Theo nghiên cứu viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Việt Nam nơi phân bố số loài Nƣa có hàm lƣợng glucomannan tƣơng đối cao, Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) số Để phát triển nguồn nguyên liệu củ Nƣa krausei thu glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm thực phẩm chức vấn đề nhân giống Nƣa krausei cần thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng phổ biến công nghệ sinh học giúp nhân nhanh giống trồng bảo tồn loài thực vật quý Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) phƣơng pháp nuôi cấy mô” để phục vụ sản xuất Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống lồi Nƣa krausei phƣơng pháp nuôi cấy mô Nội dung nghiên cứu - Xác định điều kiện khử trùng hiệu - Xác định công thức mơi trƣờng thích hợp tạo mơ sẹo tái sinh ống nghiệm - Xác định công thức mơi trƣờng thích hợp tạo đa chồi hồn chỉnh ống nghiệm - Xác định giá thể thích hợp cho ni cấy mơ ni trồng ngồi tự nhiên Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Kết đề tài góp phần bổ sung quy trình ni cấy ống nghiệm nhân giống bảo tồn loài Nƣa krausei - Ý nghĩa thực tiễn: Kết đề tài góp phần nhân giống phục vụ trực tiếp cho ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dƣợc học Điểm đề tài - Đây cơng trình nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei phƣơng pháp nuôi cấy mô Việt Nam Bố cục khố luận: gồm 41 trang, 12 bảng, 16 hình ảnh đƣợc chia thành phần nhƣ sau: Mở đầu (2 trang), chƣơng (Tổng quan tài liệu: 15 trang), chƣơng (Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu: trang), chƣơng (Kết thảo luận: 14 trang), Kết luận kiến nghị (1 trang), Tài liệu tham khảo: 42 tài liệu, phụ lục Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu chi Nƣa giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới Chi Nƣa (Amorphophallus) chi lớn thuộc họ Ráy (Aracae) Trên giới chi Nƣa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới thuộc Châu Phi Châu Á Hiện nhiều loài đƣợc nghiên cứu triển khai trồng với diện tích lớn nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan, In đô nê xi-a, v.v Ở Trung Quốc, riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn hecta đất đồi núi đƣợc sử dụng để trồng Nƣa, ngồi Nƣa đƣợc trồng Nam Ninh, Quảng Đông, Quảng Tây, Trùng Khánh Ở Nhật Bản, vùng Jinnejo Uedama, từ năm 70 kỷ trƣớc, hàng năm khoảng 15 nghìn Nƣa đƣợc trồng với sản lƣợng đạt tới hàng nghìn Do tầm quan trọng nguồn lợi từ củ Nƣa, nên đƣợc nhập trồng từ Nhật Bản vào New Zealand từ hàng chục năm trƣớc [23] Nƣa trồng mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên năm qua có nhiều cơng trình nghiên cứu đặc điểm sinh học nhƣ kỹ thuật canh tác Nƣa Hiroshi Kurihama (1979) đƣa định hƣớng kinh nghiệm trồng trọt Nƣa konjac đất đất dốc tỉnh Jinnejo Uedama Nhật Bản, nhƣ yếu tố nhiệt độ, đất, sâu bệnh thời vụ [26] Dhua cs (1988) có nghiên cứu ảnh hƣởng chất hố học đến q trình nảy mầm, phát triển sản lƣợng củ Nƣa chuông (Amorphophallus paeoniifolius Nicols.) [20] Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Liu & cs (1998) nghiên cứu sinh trƣởng phát triển số loài Nƣa Trung Quốc điều kiện sinh thái Nƣa Theo nhóm nghiên cứu, Nƣa khơng phải đòi hỏi nhiều nƣớc, có khả chịu hạn tốt nhƣng không chịu đƣợc ngập úng Về nhiệt độ, Nƣa ƣa ấm, có khả chịu biến thiên nhiệt độ từ - 43oC, nhiệt độ tối thích 20 - 25oC, nhiệt độ xuống dƣới 0oC lên 48oC chết sau ngày Nghiên cứu đƣa số mức nhiệt tối thích cho phát triển củ rễ, khả lai số loài Nƣa thu đƣợc nhiều kết khả quan Cũng theo nghiên cứu cho biết Nhật Bản Trung Quốc hai nƣớc có lịch sử trồng sử dụng bột Nƣa (bột konjac) nhƣ loại thực phẩm truyền thống từ hàng nghìn năm trở trƣớc Dựa nghiên cứu rộng rãi an toàn thực phẩm, Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đƣa bột Nƣa vào thực phẩm quản lý thông thƣờng từ năm 1998 Ở Mỹ ngƣời ta chấp nhận bột Nƣa nhƣ thực phẩm bổ sung (năm 1997), cho phép sử dụng bột Nƣa nhƣ nhân tố làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa chất ổn định thực phẩm Ngày Nhật Bản, Trung Quốc số nƣớc sử dụng bột Nƣa làm nguyên liệu công nghệ dƣợc phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ trợ nhiều bệnh nhƣ đái tháo đƣờng, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ trợ giảm cân [29] Long Chu Lin (1998) có cơng trình nghiên cứu thực vật dân tộc học loài Nƣa, nghiên cứu ngƣời dân Trung Quốc sử dụng Nƣa làm thức ăn từ 3000 - 4000 năm trƣớc, nhiều kiến thức kỹ thuật trồng Nƣa theo lối cổ truyền đƣợc đề cập Theo nghiên cứu này, hạt số lồi Nƣa khó nảy mầm ngồi tự nhiên, nhiên lại nảy mầm dễ dàng sau qua đƣờng tiêu hóa số lồi chim Theo cách nảy mầm nhân tạo, Nƣa chín sau rửa vỏ cơm quả, trộn lẫn với cát ẩm tỉ lệ 1:4 cất vào chỗ tối phủ lớp đất dày dễ dàng nảy mầm [30] Theo Santosa cs (2002) Nƣa chuông lƣơng thực quan trọng Java năm 1940 - 1950, sau thời gian đƣợc sử dụng, Nƣa trở thành lồi có triển vọng kinh tế lớn, có mặt lồi vƣờn nhà Java ngày nhiều Trong nghiên cứu sinh trƣởng ứng dụng Nƣa chng từ 2003 đến 2008 nhóm tác giả cho biết chu kỳ tăng tƣởng Nƣa chuông khác số nƣớc Nam Á nhƣ: Tây nam Trung Quốc, bắc Mianma, bắc Thái Lan chu kì tăng trƣởng tháng 5, kết thúc vào tháng 10, In đô nê xi-a lại tháng 11 kết thúc vào tháng 5, giai đoạn tăng trƣởng kéo dài 160180 ngày tất khu vực [37] Liu (2004) đề cập kỹ nguồn gốc, phân bố chi Nƣa, phân loại học, hình thái học, chu trình sinh trƣởng phát triển, sinh thái, chuyển hóa glucomannan, trồng trọt, nhân giống chế biến nhƣ bảo quản sau thu hoạch… loài Nƣa Theo Liu giới biết khoảng 173 lồi Nƣa, có 20 lồi đƣợc phát triển thƣơng mại Trung Quốc, Nhật Bản, Malaisia, Ấn Độ In đô nê xi-a, hàng năm giới sản xuất khoảng 30 nghìn bột konjac Sản lƣợng củ Nƣa tƣơi đạt tới 30 - 35 tấn/ha nhƣng khoảng 2,5 glucomannan đƣợc chiết xuất từ số lƣợng củ [28] Douglas cs (2005) có cơng trình nghiên cứu kỹ thuật trồng Nƣa konjac New Zealand thu đƣợc nhiều kết trọng lƣợng, chất lƣợng củ Nƣa trồng dƣới tán rừng trồng trực tiếp dƣới ánh sáng mặt trời [22] Theo Zhang Liu (2006) Nƣa phát triển theo mùa, chúng thƣờng rụng vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý Nƣa kéo dài từ 60 80 ngày khơng thể có tác nhân phá vỡ trạng thái ngủ để hình thành chồi giai đoạn Sau ngủ, bắt đầu nảy mầm, Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi phát triển mạnh để hình thành củ mới, lúc củ mẹ hết chất dinh dƣỡng chết Trong tự nhiên, Nƣa cần năm để để phát triển đủ lớn hoa Do đó, Nƣa đƣợc đánh giá sinh trƣởng chậm cho suất thấp [40] Kết nghiên cứu Nedunchezhiyan cs (2006) giới thiệu cụ thể bƣớc nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng, tƣới nƣớc, thu hoạch, nhƣ bảo quản củ Nƣa chuông Ấn Độ Theo tác giả, Nƣa chng hồn tồn nhân giống đƣợc cách cắt củ thành phần khoảng 100gram trọng lƣợng Ở Ấn Độ, Nƣa chng có tên gọi Elephant foot yam, đƣợc biết đến nhƣ rau củ giàu chất dinh dƣỡng trồng lâu đời Tây Bengat, Andhra Pradesh, Tamil Nadu, Bihar… suất Nƣa chuông khoảng 30 - 35 tấn/ha [33], [35] Nedunchezhiyan cs (2012) có cơng trình nghiên cứu phát sinh chồi Nƣa chng, ảnh hƣởng loại giá thể, kích thƣớc củ giống ảnh hƣởng chất nhƣ thiourea, gibberellic acid, kali nitrat đến trình hình thành chồi Nƣa chuông [34] Theo Melinda Chua cs (2010), Trung Quốc, Nƣa đƣợc trồng xen canh với ngô kê đạt xuất cao [31] Zhang cs (2010) công bố kết nghiên cứu nhân giống so le loài Nƣa là: A.bulbifer A muelleri nhằm tìm lồi Nƣa thích hợp cho vùng Nam Á Sau nghiên cứu so sánh với Nƣa konjac (A konjac), nhóm nghiên cứu kết luận lồi A muelleri có khả thích ứng tốt với khí hậu Nam Á, cho hàm lƣợng glucomannan cao (>70%) phát triển trồng bắc Mianma Lào Nghiên cứu giải thích Nam Á ngƣời ta sử dụng củ mà không sử dụng hạt Nƣa làm vật liệu nhân giống Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu khu vực thuận lợi cho phát triển loài cỏ dại, từ hạt thƣờng không đủ sức cạnh tranh Hơn nữa, có nguồn gốc từ hạt cho củ lớn thời gian năm điều kiện tự nhiên [41] Mặc dù có nhiều tác giả nghiên cứu Nƣa nhƣng tài liệu đƣợc công bố chủ yếu tài liệu phân loại học hình thái học tài liệu sinh trƣởng, phát triển nhƣ trồng trọt, nhân giống chủ yếu đƣợc nghiên cứu số loài nhƣ: A konjac, A muelleri, A.bulbifer, A paeoniifolius Các lồi Nƣa khác đƣợc biết đến có Nƣa krausei 1.1.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam, chi Nƣa có khoảng 25 lồi phân bố từ Bắc vào Nam nhƣng hầu hết tập trung tỉnh miền núi, số tỉnh duyên hải hải đảo Một số loài đƣợc dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không làm thực phẩm mà nguồn dƣợc liệu tự nhiên quý giá Ngƣời dân thƣờng trồng Nƣa lấy củ làm lƣơng thực, thân cành dùng chăn nuôi, cuống (bèn hay chột) Nƣa dùng nấu canh muối dƣa ăn Củ đƣợc dùng làm thuốc nhiều thuốc dân gian để chữa trị đờm tích phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau nhức, đầy bụng, tức ngực, ăn uống không tiêu, sốt rét, trục thai chết [14], [42] Tài liệu Nƣa Việt Nam chủ yếu cơng trình phân loại chi Nƣa Các loài Nƣa Việt Nam đƣợc Gagnepain tổng hợp mô tả sách Thực vật chí Đại cƣơng Đơng dƣơng (1942) với lồi Đó Nƣa chng (A campanulatus Bl = A paeoniifolius Nicolson), Nƣa rex (A rex Prain = A paeoniifolius Nicolson), Nƣa đứt đoạn (A interruptus Engl.), Nƣa rivieri (A rivieri Dur = A konjac K Koch) Nƣa Bắc Bộ (A tonkinensis Engl.) [24] Phạm Hoàng Hộ (1993) thống kê mơ tả lồi, từ năm 1994 2000, nhiều loài Nƣa đƣợc số nhà thực vật mô tả từ mẫu thu Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi đƣợc Việt Nam Dựa mô tả Phạm Hồng Hộ (2000) thống kê đƣợc 18 loài Nƣa Việt Nam [4], [5], [10] Cùng với nhà thực vật nƣớc ngoài, Nguyễn Văn Dƣ (2001 & 2004), mơ tả nhiều lồi Nƣa cho khoa học số loài Nƣa bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, làm cho số loài chi lên tới 25 lồi Trong đó, lồi Nƣa phổ biến là: Nƣa chuông (A paeoniifolius), Nƣa bắc (A tonkinensis), Nƣa đầu nhăn (A corrugatus) Nƣa vân nam (A yunnanensis) [4], [5], [6] Gần nguồn glucomannan từ củ số loài Nƣa nƣớc ta đƣợc biết tới Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tiến hành nghiên cứu theo hƣớng này, theo báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên sinh vật hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ cơng bố lồi Nƣa có triển vọng cơng nghiệp thực phẩm Việt Nam là: Nƣa đầu nhăn (A corrugatus), Nƣa vân nam (A yunnanensis) Nƣa krausei (A krausei) [7] Hiện loài đƣợc tiếp tục nghiên cứu Đối với Nƣa krausei, thông tin thành phần hóa học, đặc tính sinh trƣởng phát triển, trồng trọt, nhân giống chế biến chƣa đƣợc tài liệu nƣớc đề cập 1.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân nhanh giống trồng 1.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật - Tính tồn tế bào Năm 1902, Haberlandt đƣa giả thuyết tính tồn tế bào thực vật Ông cho tất tế bào có tính tồn (totipotency), nghĩa tế bào mang tồn lƣợng thơng tin di truyền thể có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Đến năm 1922, Kotte Robbins nuôi đƣợc đỉnh sinh trƣởng từ đầu rễ hoà thảo 12 ngày Nhƣ vậy, lần tính tồn tế bào đƣợc chứng minh thực nghiệm Từ đến nay, nhiều cơng trình nghiên cứu tạo đƣợc hồn chỉnh từ tế bào riêng lẻ, khối mô hay phần quan Điều khẳng định tính toàn tế bào thực vật sở khoa học nuôi cấy mô, tế bào thực vật [17], [19] - Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Biệt hố (phân hóa) biến đổi tế bào từ trạng thái tế bào phôi thể chức Các tế bào dùng môi trƣờng nuôi cấy biệt hoá cấu trúc chức Trong điều kiện thích hợp, làm cho tế bào trở lại trạng thái tế bào sinh chúng - tế bào phôi q trình gọi q trình phản phân hố Phân hóa tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Hình 1.1 Mối quan hệ trình phân hóa phản phân hóa Trong thể, tế bào có khả phân hố, phản phân hố triển vọng ni cấy thành công khác Những tế bào chuyên hố chức (đã biệt hố sâu) khó xảy q trình phản phân hoá ngƣợc lại, nhƣ tế bào mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật Ngƣời ta chứng minh rằng: tế bào Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi gần trạng thái tế bào phôi khả ni cấy thành cơng cao nhiêu [8] Sự phân hoá phản phân hố tế bào q trình hoạt hố, ức chế hoạt động gene Trong giai đoạn phát triển định cây, gene trạng thái ức chế không hoạt động đƣợc hoạt hố tính trạng Ngƣợc lại số gene lại bị ức chế đình hoạt động Q trình hoạt hố, ức chế diễn theo chƣơng trình đƣợc lập sẵn cấu trúc hệ gene tế bào, giúp cho sinh trƣởng, phát triển thể thực vật đƣợc hài hoà Khi tách riêng tế bào làm giảm kích thƣớc khối mơ tạo điều kiện cho việc hoạt hố gene tế bào [8] Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật cách có định hƣớng dựa vào phân hố phản phân hoá tế bào thực vật để điều khiển phát sinh hình thái tế bào, ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng thực vật auxin cytokinin Tỷ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng mơ ni cấy khác tuỳ mục đích nghiên cứu (phát sinh chồi, rễ mô sẹo) [8] 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật Vào thời kì Haberlandt tiến hành thí nghiệm ni cấy tế bào biệt lập, hiểu biết nhu cầu dinh dƣỡng khống hạn chế, đặc biệt vai trò chất kích thích sinh trƣởng hầu nhƣ chƣa đƣợc khám phá Chính mà Haberlandt khơng thành cơng [18] Đến có hàng trăm loại mơi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại mơi trƣờng bao gồm thành 10 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi Với có mặt BAP sau ngày cấy, chồi bắt đầu tăng kích thƣớc phần củ, hình thành mơ phơi sinh màu xanh, sau phân hố thành cụm chồi Bảng 3.5 kết thu đƣợc sau 30 ngày nuôi cấy Bảng 3.5 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi CTMT BAP (mg/l) Số chồi cấy Số chồi tạo thành Hệ số nhân chồi ĐC 40 54 1,35 AMORM1 0,5 40 92 2,30 AMORM2 1,0 40 136 3,40 AMORM3 1,5 40 168 4,20 AMORM4 2,0 40 208 5,20 AMORM5 2,5 40 220 5,50 AMORM6 3,0 40 228 5,70 Kết cho thấy: môi trƣờng AMORM1 AMORM2 cho hệ số nhân chồi thấp (1,35 2,30) Các môi trƣờng AMORM4, AMORM5, AMORM6 cho hệ số nhân chồi cao, lần lƣợt 5,20; 5,50 5,70 Ta thấy nồng độ BAP cao hệ số nhân chồi tăng nhƣng công thức môi trƣờng AMORM5, AMORM6 hệ số nhân chồi tăng chậm môi trƣờng AMORM1, AMORM2, AMORM3 AMORM4 Theo quan sát thấy môi trƣờng AMORM4 chồi phát sinh khoẻ mạnh, đồng nhất, số lƣợng chồi tạo thành thích hợp với khơng gian ống nghiệm Chính vậy, thí nghiệm môi trƣờng AMORM4 (2,0mg/l BAP) môi trƣờng thích hợp để nhân đa chồi Nƣa krausei 35 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi A B Hình 3.6 Nhân đa chồi Nƣa krausei môi trƣờng AMORM5 A Chồi cấy ban đầu B Chồi thu đƣợc sau 30 ngày 3.4 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ Kích thích rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu in vitro Các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin đóng vai trò quan trọng phân chia tế bào hình thành rễ Trong thí nghiệm này, tơi sử dụng chất kích thích sinh trƣởng NAA nồng độ khác là: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1,0 (mg/l) để nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ Nƣa krausei Kết thu đƣợc sau 20 ngày ni cấy đƣợc trình bày bảng 3.6 36 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ CTMT NAA (mg/l) Số chồi cấy Số chồi rễ Tổng số rễ Tỷ lệ chồi rễ (%) Số rễ TB/chồi ĐC 45 35 42 77,78 1,2 AMORN1 0,2 45 45 279 100 6,20 AMORN2 0,4 45 45 308 100 6,84 AMORN3 0,6 45 45 325 100 7,22 AMORN4 0,8 45 45 340 100 7,56 AMORN5 1,0 45 45 365 100 8,11 Kết bảng 3.6 cho thấy tất cơng thức mơi trƣờng thí nghiệm cho tỷ lệ rễ 100%, số rễ trung bình/chồi tăng lên nồng độ NAA tăng Qua thí nghiệm thấy rằng, nồng độ NAA cao rễ nhiều phân hoá rễ phụ nhanh Qua quan sát thấy, phát triển công thức mơi trƣờng AMORN1 tốt, cứng có xanh đậm, rễ mập, đều, phát triển khoẻ mạnh, khơng có q nhiều rễ phụ thuận lợi cho việc chuyển sang giai đoạn trồng bầu Vì vậy, thí nghiệm tơi chọn mơi trƣờng AMORN1 (0,2mg/l NAA) mơi trƣờng tạo rễ thích hợp Hình 3.7 Tạo Nƣa krausei hồn chỉnh môi trƣờng AMORN2 37 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.5 Ảnh hƣởng giá thể đến tỉ lệ sống bầu Cây có đầy đủ thân, rễ đƣợc đƣa trồng bầu, giai đoạn cần có chế độ chăm sóc đặc biệt, cần đảm bảo đƣợc độ ẩm ánh sáng vừa phải để dần thích nghi với điều kiện tự nhiên Khi đƣa ngồi mơi trƣờng để có tỷ lệ sống cao cần có giá thể sống thích hợp Trong thí nghiệm này, tơi thử nghiệm với loại giá thể khác nhau, sau 35 ngày trồng bầu, kết thu đƣợc bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng giá thể đến trồng bầu Loại giá thể Tỷ lệ Số trồng Số sống Tỷ lệ sống sau 15 ngày Cát đen + Trấu hun 1:1 100 88 88,0 Trấu hun 100 95 95,0 Trấu hun + Đất 1:4 100 92 92,0 Từ kết bảng 3.7 cho thấy: Các loại giá thể cho tỷ lệ sống cao, giá cát đen + trấu hun có tỷ lệ sống thấp với 100 thí nghiệm có 88 sống chiếm 88,0% Giá thể trấu hun trấu hun + đất cho tỷ lệ sống cao 95,0% 92,0% với 95 92 sống Tuy giá thể trấu hun thí nghiệm cho tỷ lệ sống cao nhƣng giá thể trấu hun nhẹ tơi xốp nên thích hợp cho sống phát triển giai đoạn đầu Sau 20 ngày, phát triển chậm, chuyển sang vàng, sức sống yếu dần, trồng trấu hun không thuận lợi cho việc vận chuyển trồng ngồi tự nhiên bầu dễ vỡ Vì vậy, nghiên cứu tơi chọn giá thể thích hợp để trồng Nƣa krausei bầu trấu hun + đất với tỷ lệ 1:4 38 Hình 3.8 Cây Nƣa krausei trồng giá thể trấu hun + đất sau 35 ngày Hình 3.9 Cây Nƣa krausei in vitro Hình 3.10 Cây Nƣa krausei invitro trồng trấu hun đất sau 50 ngày sau trồng nhà lƣới 20 ngày 39 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Hình 3.11 Cây Nƣa krausei trồng Hình 3.12 Hoa Nƣa krausei Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh hoc Hình 3.13 Thao tác buồng cấy Hình 3.14 Một số sản phẩm từ bột Nƣa 40 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ Kết luận Từ nghiên cứu thử nghiệm nhân giống lồi Nƣa krausei thơng qua kỹ thuật nhân giống mô sẹo nhân đa chồi trực tiếp từ ngun liệu vơ trùng, tơi có số kết luận sau: Đã xác định dung dịch khử trùng javen 70% 10 phút để tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt Nƣa nuôi cấy ống nghiệm Xác định đƣợc phận tạo mô sẹo thích hợp củ Nƣa krausei, mơi trƣờng tạo mô sẹo từ củ hiệu AMORC2 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 2mg/l 2,4D + 0,5g/l BAP) với tỷ lệ tạo mô sẹo 95,0% Mơi trƣờng thích hợp để tái sinh Nƣa krausei từ mô sẹo AMORB1 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 0,2mg/l NAA + 0,5mg/l BAP) với tỷ lệ tái sinh 40%, số chồi trung bình/mẫu tái sinh 1,35 Môi trƣờng tạo đa chồi hiệu AMORM4 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 2,0mg/l BAP) với hệ số nhân chồi 5,2 Mơi trƣờng tạo hồn chỉnh thích hợp môi trƣờng AMORN1 (MS + 30g/l saccharose + 8g/l agar + 0,2mg/l NAA) có tỷ lệ tạo rễ 100%, số rễ trung bình/chồi 6,20; sinh trƣởng tốt Giá thể thích hợp để trồng Nƣa krausei sau giai đoạn nuôi cấy ống nghiệm trấu hun + đất với tỷ lệ 1:4, cho tỷ lệ sống 92,0% Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện khả tạo mơ sẹo, tái sinh nhân đa chồi Nƣa krausei - Nghiên cứu sinh trƣởng phát triển Nƣa krausei ni ống nghiệm trồng ngồi điều kiện tự nhiên 41 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Hà Hồng Hải (2005), "Kết bƣớc đầu nhân giống in vitro Vù hƣơng (Cinamomum balansae Licomte) kỹ thuật ni cấy phơi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học", Kỷ yếu Hội nghị quốc gia Khoa học sống, 450-453, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ (2006), Nghiên cứu phân loại họ Ráy (Araceae) Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ (2005), Araceae Juss - họ Ráy, Danh lục loài thực vật Việt Nam, 3, 871-897, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Dƣ, Nguyễn Khắc Khôi (2004), “Bổ sung ba loài thuộc chi Nƣa-Amorphophallus Blume ex Decne (họ Ráy-Araceae Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 26(4A), 57-60 Nguyễn Văn Dƣ, Hà Tuấn Anh, Trƣơng Anh Thƣ, Bùi Văn Thanh (2011), "Ba loài Nƣa (Amorphophallus) họ Ráy (Aracae) có triển vọng cơng nghiệp thực phẩm", Báo cáo sinh thái tài nguyên sinh vật, Hội nghị Khoa học tồn quốc lần thứ 4, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội Trần Đình Đạt (2006), Cơng nghệ di truyền, NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xn, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình (2004), “Nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) đƣợc tìm thấy Vƣờn Quốc gia Cúc Phƣơng 42 kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4), 479-486 10 Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, 2(2), NXB Montréal 11 Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hồ sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội 12 Vũ Văn Liết, Nguyễn Văn Hoan (2007), Sản xuất hạt giống công nghệ hạt giống, Trƣờng ĐHNN I - Hà Nội 13 Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl chịu nước thuốc (Nicotiana tabacum L.), Luận án phó tiến sĩ sinh học, Hà Nội 14 Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, 136-137, NXB Y học, Hà Nội 15 Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ sinh học, Hà Nội 16 Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Thị Quỳnh (2007),"Nghiên cứu khử trùng, tạo chồi tạo rễ in vitro giống điều cao sản (Anacardium occidebtable L.)", Phần IV - Công nghệ tế bào thực vật, 440 446, Hội nghị Khoa học Công nghệ 17 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 18 Vũ Văn Vụ (2009), Sinh lí học thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu nƣớc ngoài: 20 Dhua RS, Ghosh SK, Biswas J, Mitra SK, Sen H (1988), "Effect of some chemiscals on sprouting, growth and corm yield of Amorphophallus campanulatus", Journal of Root Crops, 14(2), 47-49 43 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 21 Dix PJ (1986), Plant cell culture technology, Oxford, Blackwell Scentific Publiccation, 143-201 22 Douglas JA, Follett JM, Waller JE (2005), "Research on konjac (Amorphophallus konjac) production in New Zealand", Acta Hort, 670, 173180 23 Fang W, Wu P (2004), “Variations of Konjac glucomannan (KGM) from Amorphophallus konjac and its refined powder in China”, Food Hydrocolloids, 18(1), 167-170 24 Gagnepain F (1942), "Araceae", Flore Générale de L'Indo-Chine, 6, 1075-1196 25 Heng L, Guanghua Z, Peter CB, Jin M, Wilbert LAH, Josef B, Niels J (2007), "Araceae", Flora of China, 23, 24-30 26 Hiroshi K (1979), "Trends and problems of Konjac (Amorphophallus konjac) Cultivation in Japan", Japan Agriculture Research, 18(3), 174-179 27 Konzak CK (2001), Breeding in Crop Plant - Mutation and In Vitro Mutation Breeding, Crop Science, 41, 253-256 28 Liu PY (2004) Konjac, China Agriculture Press, Beijing, China 29 Liu PY, Zhang SL, Zhang XG (1998), "Research and utilization of Amorphophallus in China", Acta Botanica Yunnanica, 10, 48-61 30 Long CL (1998), "Ethnobotany of Amorphophallus of China", Acta Botanica Yunnanica, 10, 89-92 31 Melinda Chua, Baldvin C, Hocking J, Kelvin Chan (2010), "Traditional uses and potential health benefits of Amorphophallus konjac K Koch ex N, E Br.", Journal of Ethnopharmacology, 128(2), 268-278 32 Murashige T, Skoog FC (1962), "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture", Physiologia Plantarum, 15, 473-497 44 33 Nedunchezhiyan M (2008), "Seed corm production techniques in elephant foot yam", Orissa Review, 65(2-3), 64-66 34 Nedunchezhiyan M, Jata SK, Misra RS, Mukherjee A (2012), "Sprout bud culture:A rapid multiplication technique for Elephant foot yam (Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson) propagation", Aroideana, 35, 132-143 35 Nedunchezhiyan M, Saurabh A, Ranasingh N (2006), "Elephant foot yam: A commercial crop for Orissa", Orissa Review, 63(1), 71-72 36 Poddar K, Vishnoi RK, Kothari SL (1985), "Plant regeneration from embryogenesis callus", Rice Bio Quar, 35, 37 Santosa E, Sugiyama N, Lontoh AP, Sutoro HS, Kawabata S (2002), "Cultivation of Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson in home garden in Java", Japan Journal Tropical Agriculture, 46, 94-99 38 Singh J, Tiwari KN (2010), "Evaluation of cotyledonary node of Clitoria ternatea L for high frequency in vitro axillary shoot proliferation", Asian Journal of Plant Science, 9(6), 351-357 39 Sugiyama N, Santosa E (2008), "Edible Amorphophallus in Indonesia", Potential Crops in Agroforestry, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, 125 40 Zhang SL, Liu Y (2006), Small konjac could be a big industry in China’s new countryside, The 5th National Konjac Symposium, Janshi, Hubei, China,1-5 41 Zhang D, Wang Q, Srzednicki GS (2010), "Mechanism of staggered multiple seedling production from Amorphophallus bulbifer and Amorphophallus muelleri and its Application to Cultivation in Southeast Asia", Tropical Agriculture Development, 54(3), 84-90 Website: 42 http://www.lrchueuni.edu.vn/dongy/thuocdongy/K/KhoaiNua 45 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu chi Nƣa giới Việt Nam 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân nhanh giống trồng 1.2.1 Cơ sở khoa học kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 10 1.3.3 Những tồn kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phương hướng giải 17 Chƣơng VẬT LIỆU, THỜI GIAN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Vật liệu thực vật 19 2.1.2 Thiết bị hoá chất 19 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei 19 46 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thí nghiệm 20 2.3.2.1 Thu thập mẫu 20 2.3.2.2 Khử trùng mẫu, tạo nuôi in vitro 21 2.3.2.3 Tái sinh Nưa krausei thông qua mô sẹo 21 2.3.2.4 Tạo đa chồi 23 2.3.2.5 Tạo in vitro hoàn chỉnh 24 2.3.2.6 Trồng bầu 25 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân loại đặc điểm sinh học Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.) Việt Nam 27 3.1.1 Một số thơng tin phân loại lồi Nưa krausei 27 3.1.2 Đặc điểm hình thái Nưa krausei 27 3.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái 28 3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh Nƣa krausei qua mô sẹo 29 3.2.1 Tạo mẫu Nưa krausei in vitro 29 3.2.2 Cảm ứng tạo mô sẹo từ mảnh lá, cuống lá, bẹ lá, củ rễ 30 3.2.3 Ảnh hưởng 2,4D BAP đến khả tạo mô sẹo củ Nưa krausei 32 3.2.4 Tái sinh Nưa krausei thông qua mô sẹo 33 3.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi 35 3.4 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ 36 3.5 Ảnh hƣởng giá thể đến tỉ lệ sống bầu 38 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 47 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ 2,4D BAP công thức môi trƣờng tạo mô sẹo 22 Bảng 2.2 Môi trƣờng tái sinh từ mô sẹo 23 Bảng 2.3 Môi trƣờng tạo đa chồi 24 Bảng 2.4 Môi trƣờng rễ nƣa krausei 25 Bảng 2.5 Giá thể trồng Nƣa krausei 26 Bảng 3.1 Kết tạo nguyên liệu vô trùng từ hạt 30 Bảng 3.2 Kết tạo mô sẹo từ mảnh lá, cuống lá, bẹ lá, củ rễ 31 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng 2,4D BAP đến khả tạo mô sẹo củ 32 Bảng 3.4 Kết tái sinh Nƣa krausei thông qua mô sẹo 33 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi 35 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng NAA đến khả tạo rễ 37 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng giá thể đến trồng bầu 38 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mối quan hệ q trình phân hóa phản phân hóa Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 20 Hình 3.1 Cây Nƣa krausei 27 Hình 3.2 Cây Nƣa krausei vơ trùng từ hạt ống nghiệm 30 Hình 3.3 Mô sẹo từ số phận Nƣa Krausei 31 Hình 3.4 Mơ sẹo từ củ Nƣa krausei môi trƣờng AMORC2 33 Hình 3.5 Cây Nƣa krausei tái sinh mơi trƣờng AMORB1 34 Hình 3.6 Nhân đa chồi Nƣa krausei môi trƣờng AMORM5 36 Hình 3.7 Tạo Nƣa krausei hồn chỉnh mơi trƣờng AMORN2 37 Hình 3.8 Cây Nƣa krausei trồng giá thể trấu hun + đất sau 35 ngày 39 Hình 3.9 Cây Nƣa krausei in vitro trồng trấu hun đất sau 50 ngày 39 Hình 3.10 Cây Nƣa krausei invitro sau trồng nhà lƣới 20 ngày 39 Hình 3.11 Cây Nƣa krausei trồng Trại thực nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh hoc 40 Hình 3.12 Hoa Nƣa krausei 40 Hình 3.13 Thao tác buồng cấy 40 Hình 3.14 Một số sản phẩm từ bột Nƣa 40 49 ... chồi, rễ mô sẹo) [8] 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào... Nam 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 05/2012 đến tháng 05/2013 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái Nưa krausei - Thu thập, nghiên cứu kế thừa tài liệu... vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Một mầm (Liliopsida) Bộ: Ráy (Arales) Họ: Ráy (Araceae) Chi: Nƣa (Amorphophallus) Loài: Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl. ) [6] Hình 3.1