Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rất rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc, Châu Á. DTC đã đƣợc sử dụng trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ từ hơn 2000 năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), cho đến nay có hàng trăm nghiên cứu tại Ấn Độ và nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc …liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, trong đó chủ yếu là tác dụng hạ đƣờng huyết cũng nhƣ một số bệnh lý chuyển hóa khác. Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008, trên các khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng huyết, từ đó nghiên cứu phát triển tạo ra nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc và cả dạng dƣợc liệu khô đóng gói để sắc uống. Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC cũng đã đƣợc nghiên cứu nhân giống, trồng trọt. Đến năm 2015, đã có 2 vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP - WHO của công ty Nam Dƣợc tại Hải Hậu (Nam Định) và của công ty DK Natura tại Phú Lƣơng (Thái Nguyên). Trong quá trình phát triển và ứng dụng trong thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên ở Việt Nam, xuất hiện nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣ thành phần hóa học khác so với DTC ở Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu dựa trên hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt nhất trong trồng trọt,... Lý do chính là thiếu các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các chất trong DTC. Từ những lý do trên, đề tài ‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu và động thái tích lũy hoạt chất của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)‖ đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu chính:
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HỒNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC 1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật phân bố chi Gymnema R Br 1.2 Chi Gymnema R Br Việt Nam sơ phân bố loài THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHÍNH CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R Br 2.1 Nhóm hợp chất saponin 2.2 Các nhóm chất khác 19 TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ CHỐNG TĂNG LIPID HUYẾT CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R Br 20 3.1 Tác dụng hạ đƣờng huyết 20 3.2 Tác dụng chống tăng lipid huyết 25 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT SAPONIN TRONG MỘT SỐ DƢỢC LIỆU 28 4.1 Phƣơng pháp định lƣợng đánh giá động thái tích lũy hoạt chất 28 4.2 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo tuổi 28 4.3 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời gian thu hái năm 29 4.4 Đánh giá tích lũy hoạt chất theo thời điểm sinh trƣởng phận 30 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 33 2.1.2 Vật liệu, dung mơi, hóa chất 34 2.1.3 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 35 2.1.4 Động vật thực nghiệm dùng nghiên cứu 37 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 38 2.2.1.2.Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập 38 2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học 38 2.2.2.1 Phƣơng pháp điều chế mẫu dịch chiết DTC cho thử tác dụng hạ đƣờng huyết 39 2.2.2.2.Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết chuột dịch chiết Dây thìa canh 39 2.2.2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết chất phân lập đƣợc 41 2.2.2.3.1 Phƣơng pháp xác định khả ức chế enzym PTP1B hoạt chất 41 2.2.2.3.2 Phƣơng pháp biệt hóa tế bào mơ mỡ 3T3-L1 42 2.2.2.3.3 Phƣơng pháp đo độ hấp thu glucose tế bào mô mỡ 3T3-L1 chất phân lập 43 2.2.2.3.2.4 Phƣơng pháp chụp ảnh tế bào phát huỳnh quang 43 2.2.2.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết 43 2.2.3 Nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất Dây thìa canh 44 2.2.3.1 Phƣơng pháp thủy phân xác định cấu trúc aglycon 44 2.2.3.2.Phƣơng pháp định lƣợng aglycon theo dõi động thái tích lũy hoạt chất 44 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 46 3.1.1 Chiết xuất phân lập chất tinh khiết từ Dây thìa canh 46 3.1.2 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập đƣợc 48 3.1.2.1 Chất 48 3.1.2.2 Chất 52 3.1.2.3 Chất 55 3.1.2.4 Chất 58 3.1.2.5 Chất 61 3.1.2.6 Chất 65 3.1.2.7 Chất 66 3.1.2.8 Chất 69 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 74 3.2.1 Kết nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết chuột 74 3.2.2 Kết nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết chất phân lập 85 3.3.2.1.Hoạt tính ức chế enzym PTP1B 85 3.2.2.2.Hoạt tính hấp thu glucose tế bào 3T3-L1 chất 86 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT 88 3.3.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc aglycon gymnemagenol 88 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng gymnemagenol theo dõi động thái tích lũy hoạt chất DTC 96 3.3.2.1 Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu khảo sát điều kiện phân tích 96 3.3.2.2 Khảo sát tính thích hợp hệ thống 98 3.3.2.3 Độ lặp lại phƣơng pháp 98 3.3.2.4 Khảo sát khoảng tuyến tính phƣơng pháp 99 3.3.2.5 Độ phƣơng pháp 100 3.3.2.6 Giới hạn phƣơng pháp 101 3.3.2.7 Định lƣợng gymnemagenol mẫu Dây thìa canh theo tháng thu hái102 CHƢƠNG BÀN LUẬN 106 4.1 VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 106 4.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 107 4.3 VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 112 4.3.1 Về tác dụng hạ đƣờng huyết dịch chiết Dây thìa canh 112 4.3.2 Về tác dụng hạ đƣờng huyết chất phân lập từ Dây thìa canh 115 4.4 VỀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT 117 4.5 BÀN LUẬN CHUNG 119 KẾT LUẬN 121 Về thành phần hóa học 121 Về tác dụng sinh học 122 Về động thái tích lũy hoạt chất 122 ĐỀ XUẤT 124 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (DTC) (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.), thuộc chi Gymnema R.Br, phân bố rộng từ Tây Châu Phi sang Châu Úc, Châu Á DTC đƣợc sử dụng Y học cổ truyền Ấn Độ từ 2000 năm để điều trị Đái tháo đƣờng (ĐTĐ), có hàng trăm nghiên cứu Ấn Độ nhiều nƣớc giới nhƣ Ấn Độ, Nhật Bản, M , Trung Quốc …liên quan đến DTC, tập trung vào nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, chủ yếu tác dụng hạ đƣờng huyết nhƣ số bệnh lý chuyển hóa khác Tại Việt Nam, Dây thìa canh bắt đầu đƣợc tập trung nghiên cứu từ năm 2008, khía cạnh đa dạng sinh học, phân bố, độc tính, tác dụng hạ đƣờng huyết, từ nghiên cứu phát triển tạo nhiều sản phẩm hạ đƣờng huyết dƣới dạng viên nang, viên nén, dạng trà túi lọc dạng dƣợc liệu khơ đóng gói để sắc uống Nhằm bảo đảm nguồn nguyên liệu, DTC đƣợc nghiên cứu nhân giống, trồng trọt Đến năm 2015, có vùng trồng đạt tiêu chuẩn GACP - WHO công ty Nam Dƣợc Hải Hậu (Nam Định) công ty DK Natura Phú Lƣơng (Thái Nguyên) Trong trình phát triển ứng dụng thực tiễn DTC có nguồn gốc tự nhiên Việt Nam, xuất nhiều vấn đề chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣ thành phần hóa học khác so với DTC Ấn Độ, khó đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu dựa hàm lƣợng hoạt chất, xác định thời gian thu hái cho chất lƣợng tốt trồng trọt, Lý thiếu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học chất DTC Từ lý trên, đề tài ‖Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu động thái tích lũy hoạt chất Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.)‖ đƣợc thực với mục tiêu chính: Xác định cấu trúc hóa học thành phần hóa học Dây thìa canh Việt Nam Xác định thay đổi hàm lƣợng số hoạt chất theo thời gian thu hái năm Dây thìa canh Để đạt mục tiêu trên, Luận án tiến hành nghiên cứu với nội dung sau: Về thành phần hóa học: - Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc thành phần hóa học Dây thìa canh Về thử tác dụng sinh học: - Thử tác dụng in vivo tác dụng hạ đƣờng huyết dịch chiết toàn phần Dây thìa canh - Thử tác dụng in vitro tác dụng hạ đƣờng huyết chất phân lập đƣợc từ Dây thìa canh Về nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất: - Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất Dây thìa canh - Theo dõi thay đổi hàm lƣợng hoạt chất mẫu Dây thìa canh thu hái năm CHƢƠNG TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC 1.1.Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật phân bố chi Gymnema R Br Vị trí phân loại Có hai quan điểm khác vị trí phân loại chi Gymnema R Br Quan điểm thứ cho chi Gymnema R Br thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) Đa số tài liệu phân loại thực vật kinh điển theo quan điểm [19] Một số tài liệu thực vật Việt Nam xếp chi Gymnema R Br vào họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [2], [7],[8] Tuy nhiên, năm 2009 Takhtajan công bố hệ thống phân loại xếp Gymnema R Br chi phân họ Asclepiadoideae họ lớn Apocynaceae [17] Cho đến nay, quan điểm đƣợc thừa nhận rộng rãi hệ thống phân loại quốc tế [32],[79] Theo đó, Gymnema R Br chi thuộc phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae), họ Trúc đào (Apocynaceae), Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [17] Đặc điểm hình thái chung chi Gymnema R Br Cây leo, khơng có rễ phụ thân Lá mọc đối, không nạc Cụm hoa xim, tán chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, khơng có tuyến Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập nụ, tiền khai hoa vặn phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính tràng, thƣờng có hàng lơng xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau; bao phấn ơ, thƣờng có phần phụ đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn có sáp bao bên ngồi vách khối phấn, khối phấn khơng có mỏm đỉnh; quan truyền phấn có gót dính chi; khối phấn hƣớng lên; có khối phấn phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu khơng thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhịnhụy hình ống nhọn đầu [20],[32] Các loài thuộc chi Gymnema R Br phân bố chúng giới Có nhiều nhận định khác số lƣợng loài chi Gymnema R Br, số tài liệu cho chi có khoảng 25 lồi tồn giới [7], [20], [32] Tuy nhiên, sau tổng hợp sở liệu khác giới, tác giả thuộc dự án ―The plant list‖ xác định đƣợc 144 tên loài thuộc chi Gymnema R Br có 51 tên khoa học đƣợc chấp nhận (35,4%), 66 tên đƣợc xác định tên đồng nghĩa (45,8%) 27 tên chƣa xác định đƣợc xác thơng tin (18,8%) [80] Bảng 1.1 Danh mục loài thuộc chi Gymnema R Br giới STT Tên loài thuộc chi Gymnema R Phân bố Br đƣợc chấp nhận [50] Gymnema acuminatum Wall Nepal, Ấn Độ, Malaysia [80] Gymnema albidum Decne Timor [80] Gymnema albiflorum Costantin Việt Nam [91] Gymnema brevifolium Benth Úc [80] Gymnema calycinum Schltr Luzon [80] Gymnema chalmersii Schltr New Guinea [80] Gymnema cumingii Schltr Philippin [80] Gymnema cuspidatum (Thunb.) Kuntze Gymnema decaisneanum Wight Tamil Nadu [80] 10 Gymnema dissitiflorum Ridl Malaysia [80] 11 Gymnema dunnii (Maiden & Betche) Úc [80] P.I.Forst 12 Gymnema elegans Wight & Arn Tamil Nadu [80] 13 Gymnema erianthum Decne New Caledonia [80] 14 Gymnema foetidum Tsiang Việt Nam [1], Trung Quốc [20] STT Tên loài thuộc chi Gymnema R Phân bố Br đƣợc chấp nhận [50] 15 Gymnema glabrum Wight Myanmar [80] 16 Gymnema griffithii Craib Thái Lan, Việt Nam 17 Gymnema hainanense Tsiang Trung Quốc [20] 18 Gymnema hirtum Ridl Malaysia [80] 19 20 Gymnema javanicum Koord Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á [79] Java [80] 21 Gymnema khandalense Santapau Maharashtra [80] Gymnema inodorum (Lour.) Decne 22 Gymnema kollimalayanum X ( Chƣa xác định) A.Ramach & M.B.Viswan 23 Gymnema lacei Craib Myanmar; Bangladesh [80] 24 Gymnema lactiferum (L.) R.Br ex Ấn Độ, Sri lanka [80] Schult 26 Gymnema littorale Blume Trung Quốc [75]; Ấn Độ, Nepal; Đông Nam Á [80] Java [80] 27 Gymnema longiretinaculatum Tsiang Trung Quốc [20] 25 Gymnema latifolium Wall ex Wight 28 Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Thành phố Assam [80] Wilcock 29 Gymnema macrothyrsa Warb Sulawesi [80] 30 Gymnema maingayi Hook.f Malacca [80] 31 Gymnema mariae Schltr Philipin [80] 32 Gymnema micradenium Benth Queensland [80] 33 Gymnema molle Wall ex Wight Myanmar [80] 34 Gymnema montanum Hook.f Ấn Độ [80] 35 Gymnema muelleri Benth Úc [80] 36 Gymnema pachyglossum Schltr Luzon [80] 37 Gymnema piperii Schltr Mindanao [80] ... alterniflorum (Lour.) Merr., Gymnema foetidum Tsiang, Gymnema griffithii Craib, Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema reticulatum (Moon) Alston, Gymnema sylvestre (Retz.). .. phần 20 Một số loài thuộc chi Gymnema nhƣ Gymnema sylvestre R Br ex Schult, Gymnema montanum Hook.f, Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema ynnansense Tsiang, Gymnema hirsutum Wight & Arn, …... damaran phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult STT Tên hợp chất R1 R2 TLTK Gymnemasid I -glc glc [72] Gymnemasid II -glc2-glc glc [72] Gymnemasid III -Ara2-glc glc [72] Gymnemasid IV