Đang tải... (xem toàn văn)
Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp. BCC 02150 được 4 phân lập từ môi trường biển 4 Tóm tắt: 4 1. Giới thiệu: 4 2. Nguyên liệu và phương pháp 5 2.1. Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase 5 2.2. Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria 6 2.3. Kiểm tra hoạt tính amylase 6 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6 2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 7 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu 7 2.7. Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau 7 2.8. Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau 7 2.9. Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy trắng 7 2.10. Phân tích thống kê 8 3. Kết quả và thảo luận 8 3.1. Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase 8 3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase 8 Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp. BCC 02150 được 4 phân lập từ môi trường biển 4 Tóm tắt: 4 1. Giới thiệu: 4 2. Nguyên liệu và phương pháp 5 2.1. Cách ly và sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase 5 2.2. Điều kiện nuôi cấy Marine Bacteria 6 2.3. Kiểm tra hoạt tính amylase 6 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6 2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 7 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và ảnh hưởng của pH ban đầu 7 2.7. Hoạt tính Amylase và độ ổn định ở các pH khác nhau 7 2.8. Hoạt tính Amylase và tính ổn định ở các nhiệt độ khác nhau 7 2.9. Tính ổn định của enzyme trong chất hoạt động bề mặt, oxy hóa và tẩy trắng 7 2.10. Phân tích thống kê 8 3. Kết quả và thảo luận 8 3.1. Phân lập, sàng lọc và định danh vi sinh vật biển sản xuất Amylase 8 3.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men cho sản xuất Amylase 8
1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO MÔN HỌC: CÔNG NGHỆ LÊN MEN SẢN XUẤT AMYLASE TỪ BACILLUS ƯA NHIỆT SP BCC 021-50 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG BIỂN Sinh viên thực hiện: Phạm Cẩm Duyên Nguyễn Tú Anh Nguyễn Xuân Uyên Phạm Thị Mai Hương 1610531 1610089 1614048 1611470 Giáo viên hướng dẫn: Hoàng Anh Hoàng Contents Sản xuất Amylase từ Bacillus ưa nhiệt sp BCC 021-50 phân lập từ mơi trường biển Tóm tắt: Thiết bị lên men có chi phí cao rào cản kỹ thuật sản xuất amylase từ nguồn vi sinh vật Amylase sử dụng số quy trình, ngành cơng nghiệp Ví dụ, ngành cơng nghiệp thực phẩm, đường hóa, ngành cơng nghiệp tẩy rửa dệt may Trong nghiên cứu này, vi sinh vật biển phân lập để xác định vi sinh vật sản xuất amylase mơi trường thạch Hơn 50 chủng vi khuẩn có hoạt tính amylase dương tính, phân lập từ nước biển đất, sàng lọc để sản xuất amylase mơi trường thạch Bacillussp BCC 021-50 tìm thấy chủng sản xuất amylase tốt môi trường thạch điều kiện lên men chìm Tiếp theo, điều kiện lên men tối ưu hóa cho phát triển vi khuẩn sản xuất enzyme Nồng độ amylase cao 5211 U/mL thu sau 36h ủ 50 ° C, pH 8.0, sử dụng 20 g/L mật rỉ đường làm nguồn lượng 10 g /L peptone làm nguồn nitơ Từ quan điểm ứng dụng, amylase thô đặc trưng nhiệt độ pH Hoạt tính amylase tối đa ghi nhận 70°C pH 7.5 Tuy nhiên, kết cho thấy ưu điểm rõ rệt cho ổn định enzyme môi trường kiềm, nhiệt độ cao độ ổn định có mặt chất hoạt động bề mặt, oxy hóa tẩy trắng Giới thiệu: Các enzyme Amyloglucosidase tham gia vào trình thủy phân nguyên liệu tinh bột thành oligosaccharides sản phẩm cuối đơn phân glucose Amylase có ba loại, bao gồm α-amylase thủy phân liên kết α-1,4 bỏ qua liên kết nhánh, β-amylase phá vỡ α-1,4 bỏ qua liên kết nhánh α-1,6 tạo maltose làm sản phẩm, γ-amylase (glucoamylase) thủy phân α-1,4 α-1,6, giải phóng monosaccharides sản phẩm cuối Amylase áp dụng số quy trình cơng nghiệp, bao gồm đường hóa nguyên liệu tinh bột, dược phẩm, thực phẩm, chất tẩy rửa công nghiệp dệt Amylase sản xuất từ tất nguồn tự nhiên (thực vật, động vật, vi sinh vật) nhu cầu sản xuất liên tục tăng lên có nhiều ứng dụng cơng nghiệp Do đó, nguồn vi sinh vật khai thác cho số sản phẩm sinh học công nghiệp quan trọng Trong số vi sinh vật, chủng vi khuẩn ưu tiên chủng nấm để sản xuất enzyme sản phẩm giá trị gia tăng khác Một số vi sinh vật cạn sử dụng để sản xuất enzyme, ví dụ, protease, xylanase, amylase, chitinase, cellulase, lipase inulinase Tuy nhiên, có nghiên cứu đề cập đến lĩnh vực sản xuất α-amylase từ chủng vi sinh vật biển Hơn nữa, vi sinh vật biển nghiên cứu để sản xuất enzyme có tính chất cơng nghiệp quan trọng, chẳng hạn ổn định nhiệt độ cao điều kiện pH kiềm Những đặc tính vi khuẩn có vai trò quan trọng việc sản xuất amylase cách sử dụng nguyên liệu có hiệu kinh tế làm nguồn lượng Chi phí mơi trường lên men cao mối quan tâm sản xuất amylase từ nguồn vi sinh vật Nhu cầu amylase liên tục tăng lên nhà nghiên cứu cố gắng thiết lập q trình lên men có tính kinh tế Một số phụ phẩm ngành công nghiệp nông nghiệp sử dụng cho sản xuất amylase Các nhà nghiên cứu tìm kiếm chủng vi sinh vật để tạo enzym amylase với đặc tính phù hợp với ngành cơng nghiệp Ví dụ, amylase ổn định pH kiềm, ổn định nhiệt chất hoạt động bề mặt ổn định Ngoài ra, vi sinh vật nên sử dụng nguồn nguyên liệu phế thải nông nghiệp làm nguồn cacbon nitơ để đạt hiệu chi phí Do đó, nghiên cứu này, vi sinh vật biển phân lập sàng lọc để sản xuất amylase Nghiên cứu thực để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho phát triển Bacillus sp BCC 021-50 sản xuất nồng độ amylase cao từ chủng vi khuẩn biển phân lập đóng vai trò hiệu q trình thương mại hóa sản xuất amylase Nguyên liệu phương pháp 2.1 Cách ly sàng lọc sản xuất vi khuẩn Amylase Các chủng vi khuẩn phân lập từ đất biển nước gần bờ biển để sản xuất amylase Bước sàng lọc để có chủng tốt cho việc sản xuất amylase cách cấy môi trường thạch tinh bột Môi trường chứa tinh bột hòa tan (20 g /L), peptone (20 g /L), thạch agar (20 g /L) đĩa ủ 48h Sau 48h ủ, đĩa đổ ngập dung dịch iốt để quan sát hình thành vùng ức chế thủy phân tinh bột Một số chủng vi khuẩn sàng lọc kích thước vùng ức chế 12-40 mm Các chủng cho thấy kích thước vùng 32, 35 40 mm chọn cho thí nghiệm lên men Bacillussp BCC 021-50 xác định sử dụng cho thí nghiệm chủng tốt dựa hình thái (nhuộm đơn nhuộm gram) phản ứng sinh hóa (catalase VogesProskauer) 2.2 Điều kiện ni cấy Marine Bacteria Trong bước đầu tiên, chủng kích hoạt môi trường LB chứa 10 g /L tryptone, g /L cao nấm men, 10 g /L NaCl Sau đó, tế bào vi khuẩn ủ 37°C máy lắc 24 150 vòng/phút 10% v/v ( thể tích chất tan/100ml dd) ni cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy (basal medium : không cần ưu tiên cho loại tế bào phát triển) dùng để nuôi hay dùng để tạo dòng: (glucose (20 g /L), cao nấm men (10 g /L), MgSO 4·7H O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L) ), CaCl (2 g/L), KH2PO (2 g/L)), ủ 120 vòng/phút, 37°C 18h Cuối cùng, 2% v/v cấy sử dụng môi trường để sản xuất enzyme (glucose (20 g/L), chiết xuất men (10 g/L), MgSO 4·7H 2O (1,0 g/L), NaCl (10 g/L), CaCl (2 g/L), KH2PO 4(2 g/L)) ủ 37°C 120 máy lắc Các mẫu thu nhận khoảng thời gian đặn 12 h OD đo 600 nm sử dụng máy quang phổ UV-VIS Môi trường nuôi cấy ly tâm 10 phút để thu thập phần mặt không chứa tế bào cho hoạt tính α-amylase Tất dụng cụ khử trùng 115 ° C 20 phút trước cấy 2.3 Kiểm tra hoạt tính amylase Hoạt tính amylase kiểm tra dựa việc xác định lượng đường khử: Cho vào ống nghiệm 1.0 mL mẫu môi trường (1.0% w / v tinh bột), lắc kĩ, ủ 37ºC 15 phút nồi cách thủy Sau 10 phút, phản ứng dừng lại cách thêm 2,0 mL thuốc thử DNS giữ nước sôi phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng đo OD 540 nm, dùng mơi trường để set blank Các thuốc thử khác thêm vào nồng độ Đơn vị hoạt độ amylase lượng enzyme thủy phân µmol glucose điều kiện thí nghiệm tối ưu 2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Sản xuất amylase kiểm tra nhiệt độ khác nhau: Chất cấy chuẩn bị trước 24 với nồng độ 2% (v/v) cho vào 50ml mơi trường lên men bình tam giác 250ml Erlen lắc máy lắc nhiệt độ khác từ 30 đến 60ºC pH ban đầu 7,0 Ly tâm 11,300 × g 10 phút 10°C Xác định hoạt tính amylase từ dịch ni cấy 2.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon Bacillus sp BCC 021-50 nuôi erlen 250 ml chứa 50 mL môi trường lên men, bổ sung 20 g / L nguồn carbon bao gồm glucose, siro, rỉ đường, fructose, tinh bột, maltose galactose 2% v/v chất cấy cấy vào bình ni cấy nhiệt độ 50°C 36 h Ly tâm dịch ni cấy (11,300 × g 10 phút 10 ° C) thu nhận mẫu bảo quản 4°C 2.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ ảnh hưởng pH ban đầu Các chất nitơ hữu vô đánh giá nguồn nitơ cho sản xuất amylase Môi trường lên men bổ sung với nitrate amoni, amoni clorua, amoni sulfat, urê, cao nấm men, casein, tryptone, cao thịt peptone nồng độ 10 g/L Ngồi ra, q trình sinh tổng hợp amylase xác định giá trị pH ban đầu khác từ 5,0 đến 11,0 Quá trình lên men phân tích sinh hóa thực mơ tả 2.7 Hoạt tính Amylase độ ổn định pH khác pH 6.0-11.0 dùng để đánh giá hoạt động tối đa amylase cách sử dụng dung dịch đệm khác nhau: đệm phosphat pH 6.0–7.5; dung dịch đệm Tris – HCl pH 8,0–8,5 dung dịch đệm glycine – NaOH pH 9,0–11,0 Độ ổn định xác định cách ủ enzyme dung dịch đệm 40°C sau hoạt tính amylase kiểm tra điều kiện khảo nghiệm 2.8 Hoạt tính Amylase tính ổn định nhiệt độ khác Ảnh hưởng nhiệt độ amylase thô nghiên cứu cách ủ phản ứng dải nhiệt độ khác (30-85 °C) dung dịch đệm glycineNaOH (pH 7,5) Khả chịu nhiệt xác định cách ủ trước enzyme nhiệt độ khác khoảng 30-85 ° C 2.9 Tính ổn định enzyme chất hoạt động bề mặt, oxy hóa tẩy trắng Để ứng dụng amylase thơ q trình công nghệ sinh học “đặc biệt công nghiệp chất tẩy rửa”, tính ổn định xác định chất hoạt động bề mặt chất tẩy trắng Tính ổn định amylase thử nghiệm với có mặt Triton X-100, Tween 20 40, Sodium dodecyl sulfate (chất hoạt động bề mặt) sodium hypochlorite (chất tẩy trắng) điều kiện thí nghiệm tối ưu (pH 7,5 40°C giờ) Hoạt tính amylase với việc bổ sung hợp chất khác đo phần trăm hoạt tính tương đối so với đối chứng 100% (khơng có chất phụ gia) 2.10 Phân tích thống kê Thí nghiệm làm lại lần T-test thực p