BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 62 62 03 01 LÊ THỊ HỒNG GẨM ẢNH HƯỞNG CỦA NITRITE, NHIỆT ĐỘ VÀ NỒNG ĐỘ CO2 CAO LÊN CÁC QUÁ TRÌNH SINH LÝ VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA CÁ THÁT LÁT CÒM (Chitala ornata, Gray 1831) Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: Gs.Ts Nguyễn Thanh Phương Người hướng dẫn phụ: PGs.Ts Mark Bayley Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………….…………… Vào lúc: … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃCƠNG BỐ Gam, L.T.H., Jensen, F.B., Damsgaard, C., Huong, D.T.T., Phuong, N.T and Bayley, M., 2017 Extreme nitrite tolerance in the clown knifefish Chitala ornata is linked to up-regulation of methaemoglobin reductase activity Aquatic Toxicology 187: 9–17 Gam, L.T.H., Jensen, F.B., Huong, D.T.T., Phuong, N.T., and Bayley, M., 2018 The effects of elevated environmental CO2 on nitrite uptake in the air-breathing clown knifefish, Chitala ornata Aquatic Toxicology 196: 124-131 Gam, L.T.H., Vu, N.T.T., Nhu, P.N., Phuong, N.T and Huong, D.T.T., 2018 Effects of nitrite exposure on haematological parameters and growth in clown knifefish (Chitala ornata, Gray1831) Can Tho University Journal of Science 54(2): 1-8 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu thay đổi khí hậu ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp đến hoạt động người, thay đổi kết cấu của khí tồn cầu, khí hậu tự nhiên qua thời gian dài (UNFCCC, 1992) Sự thay đổi xuất phát từ tăng khí độc hại CO2, N20, CH4, nồng độ khí nhà kính gia tăng nhiệt độ 2.5ºF (14 ºC) kỷ (IPCC, 2013).Theo đánh giá mức độ thiệt hại, Việt Nam xếp hạng 27 số 132 quốc gia giới chịu tác động đáng kể biến đổi khí hậu Với đặc điểm địa hình điều kiện địa lý tự nhiên, đồng sông Mê Kông (MD) trở thành số khu vực chịu tác động nhiều giới Sự tăng nhiệt độ làm tăng trao đổi chất động vật thủy sản phân hủy hợp chất độc hại Mặt khác, với dày đặc hệ thống nuôi thâm canh nay, cho ăn mức với sản phẩm thải từ tiết động vật thủy sản gây khí độc hại như: nitrit, CO2, NH3, H2S Đặc biệt, nitrit sản phẩm chu kỳ nitơ, hình thành từ amonia điều kiện oxy hòa tan thấp độc tố hệ thống thủy sản làm giảm oxy máu với hình thành methaemoglobin (hiện tượng máu nâu), ảnh hưởng q trình hơ hấp, sinh lý tăng trưởng (Kroupova ctv., 2005) Tuy nhiên, có nghiên cứu ảnh hưởng thông số môi trường lên q trình sinh lý, sinh học cá hơ hấp khí trời, lồi thủy sản chịu ảnh hưởng nghiên trọng tác động biến đổi khí hậu tồn cầu với hoạt động hơ hấp khí trời Tính đến thời điểm có hai nghiên cứu sinh lý cá hơ hấp khí trời cá tra (Pangasionadon hypophthalmus) Lefevre et al., 2011 cá lóc (Channas striata) Lefevre et al., 2012 với kết tiêu biểu khả chịu đựng nitrit cao giảm hấp thu nitrit qua mang q trình nitrat hóa Ngồi ra, có số nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường cá hơ hấp khí trời nghiên cứu Damsgaard et al., 2015 ảnh hưởng CO2 lên cân acid-base cá tra P hypophthalmus với kết lồi có khả điều hòa acid-base hồn tồn so với lồi hơ hấp khí trời khác Hơn nữa, khơng có độc chất tồn thủy vực, giả định kết hợp độc chất môi trường gây ảnh hưởng xấu cạnh tranh chúng vào thể cá Cá thát lát còm C ornata lồi quan trọng ni trồng thủy sản khu vực Đông Nam Á C ornata khơng có giá trị thương phẩm cao nhờ hàm lượng protein cao mà có giá trị làm cảnh Luận án “Ảnh hưởng nitrit, nhiệt độ nồng độ CO cao lên trình sinh lý tăng trưởng cá thát lát còm (Chitala ornata, Gray 1831)” vấn đề cấp thiết cần nghiên cứu để cung cấp kiến thức ảnh hưởng ảnh hưởng chế thích nghi lồi cá tác động biến đổi khí hậu 1.2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Mục tiêu luận án tìm hiểu ảnh hưởng nitrit, nồng độ CO cao tăng nhiệt độ lên tiêu sinh lý máu tăng trưởng cá thát lát còm từ tiếp xúc bán cấp tính mãn tính đơn lẻ kêt hợp yếu tố để cung cấp kiến thức sinh lý chuyên sâu đề xuất giải pháp để hạn chế ảnh hưởng nitrit kết hợp với thơng số môi trường khác ao nuôi thủy sản tác động biến đổi khí hậu tồn cầu 1.3 Các nghiên cứu luận án a) Khảo sát số yếu tố môi trường ao nuôi cá thát lát còm C ornata b) Xác định giá trị LC50 96 h nitrite ảnh hưởng nitrit lên thông số sinh lý máu tăng trưởng cá thát lát còm C ornata c) Khảo sát hoạt tính enzyme metHb reductase khử metHb tiếp xúc nồng độ nitrit bán cấp tính cá thát lát còm C ornata d) Khảo sát ảnh hưởng kết hợp nitrit nồng độ CO2 cao lên thông số sinh lý cá thát lát còm C ornata nhỏ lớn e) Xác định chịu đựng nhiệt độ ảnh hưởng mức nhiệt độ khác lên thông số sinh lý cá thát lát còm C ornata nhỏ lớn f) Xác định giá trị LC50 96 h nitrite nhiệt độ cao ảnh hưởng nitrit nhiệt độ khác lên thông số sinh lý cá thát lát còm C ornata g) Khảo sát ảnh hưởng nitrit nhiệt độ khác lên thông số sinh lý, tăng trưởng hoạt tính enzyme tiêu hóa cá thát lát còm C ornata 1.4 Giả thiết nghiên cứu luận án a) Trong trình tiếp xúc nitrit, C ornata giảm tốc độ trao đổi ion HCO3-/Cl- và/hay tăng hoạt tính enzyme NADH metHb reductase khử metHb chịu thay đổi đáng kể ion khác để phục hồi sau tiếp xúc b) Sự điều hòa pH hơ hấp acid dẫn đến giảm tốc độ trao đổi ion HCO3-/Cl- ức chế hấp thu nitrite c) Sự tiếp xúc nitrit mãn tính dẫn đến ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng giảm tăng trọng, giảm tỉ lệ sống hệ số chuyển hóa thức ăn FCR cao d) Nhiệt độ cao làm cân acid-base giảm pH tăng PCO2, dẫn đến rối loạn số lượng tế bào máu, nồng độ Hb ion huyết tương e) C ornata có chịu đựng nitrit thấp nhiệt độ cao, dẫn đến ảnh hưởng đáng kể đến thông số sinh lý tăng trưởng so với tiếp xúc nitrit hay nhiệt độ cao riêng lẻ 1.5 Các đóng góp quan trọng tính ứng dụng luận án Luận án cung cấp kiến thức sinh lý chun sâu cá hơ hấp khí trời C ornata bao gồm đề xuất giải pháp hạn chế ảnh hưởng nitrit kết hợp với yếu tố mơi trường hồn cảnh biến đổi khí hậu tồn cầu Với khả chịu đựng cao với nitrit, nhiệt độ CO2 tiếp xúc bán cấp tính mãn tính, C ornata thích nghi với thay đổi khắc nghiệt môi trường nhiệt độ (từ 24-33ºC), PCO2 (dưới 21 mmHg) nồng độ nitrit (dưới 2.5 mM) đóng góp phát triển bền vững động vật thủy sản nhiệt độ dự đoán tăng (1- 4ºC) vào kỷ tới tích lũy khí độc như: nitrit, CO2 hệ thống nuôi thâm canh Các kết luận án tảng tin cậy để xây dựng thí nghiệm chuyên sâu sau sinh lý C ornata loài cá hơ hấp khí trời khác hay so sánh với phản ứng sinh lý loài với loài động vật thủy sản khác thay đổi mơi trường CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Nghiên cứu 1: Khả chịu đựng nitrit cao cá thát lát còm Chitala ornata từ tăng hoạt tính enzyme khử methaemoglobin reductase Cá: 8-10 g; 28-31 ± 0,05 g; Hóa chất: NaNO2 (Merck) Xác định giá trị độ độc cấp tính (LC50 96 h) nitrit: Cá (8-10 g, n=576) phân bố ngẫu nhiên 48 bể 12 cá/bể Cá ngưng cho ăn ngày trước tiếp xúc nitrit nồng độ: 0; 2,6; 3,7; 4,8; 5,9; 7,0; 8,0; 9,1; 10,2; 11,3; 12,4; 13,5 mM Thí nghiệm sinh lý tiếp xúc nitrite bán cấp tính: Cá (31,8 ± 1,8 g, n=300) lấy ngẫu nhiên từ bể dưỡng m3 hệ thống tuần hồn với cá thơng số chất lượng nước tối ưu bố trí vào bể thí nghiệm 200-L có sẵn sục khí trước thí nghiệm bắt đầu Các nồng độ nitrit bao gồm đối chứng, mM 2.5 mM, mật độ 100 cá/bể Nồng độ nitrit nước theo dõi điều chỉnh cách bổ sung thêm nitrit suốt thí nghiệm để đảm bảo nồng độ thí nghiệm Mười cá/bể thu ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5, - Thu mẫu máu: Máu thu từ phần đuôi cá Cá tiếp xúc với nước đá (được xem gây mê tạm thời) để thu mL máu rút từ tĩnh mạch kim tiêm có tráng heparin (chất chống đông máu) Cá thu máu xong đánh dấu cách cắt đuôi Máu chia hai phần Một nửa để đo trực tiếp tiêu dẫn xuất haemoglobin (Hb), haematocrit (Hct, ratio between volume of red blood cells), MCHC (hàm lượng Hb trung bình, Huong and Tu, 2010), pH ngoại bào, PCO2 lactate máy iSTAT (i-STAT Corporation, Princeton, USA) với thẻ xét nghiệm CG4+ Một nửa máu lại ly tâm lấy huyết tương trữ tủ -80°C để sau phân tích ion áp suất thẩm thấu Các giá trị pH, PCO2 HCO3- máu tính theo phương pháp Boulitier et al., 1985, Cameron, 1971) - Phương pháp phân tích + Dẫn xuất Hb: Nồng độ dẫn xuất Hb (oxyHb, deoxyHb, metHb, Hb) tính đường chuẩn quang phổ từ máu cá thát lát còm theo phương pháp Jensen (2007), Lefevre et al (2012) Hvas et al (2016) + Các ion huyết tương: Huyết tương thu từ ly tâm máu 6.000 vòng phút để đo áp suất thẩm thấu nồng độ ion Na+, Cl-, NO2-, NO3- protein Áp suất thẩm thấu đo thiết bị Fiske one-ten osmometer (Fiske® Associates, Two Technology Way, Norwood, Massachusetts, USA) Nồng độ Na + huyết tương đo thiết bị flame photometer (Sherwood Model 420, Sherwood Scientific Ltd., Cambridge, UK) Nồng độ Cl- đo thiết bị chloride titrator (Sherwood model 926S MK II Chloride analyzer) NO2- NO3- huyết tương đo phương pháp so màu quang phổ qua phản ứng Griess (Miranda, 2001; Jensen, 2007; Lefevre et al., 2011) + Hàm lượng protein huyết tương tổng lượng nước thể: Protein huyết tương đo máy so màu quang phổ theo phương pháp Bio-rad protein assay (Bio-Rad Laboratory, Richmond, CA) sử dụng bovine serum albumin làm đường chuẩn (Bradford, 1976) Tổng lượng nước tính từ khối lượng cá tươi ban đầu khơ Khối lượng khô xác định cá tươi đem sấy 60ºC đạt khối lượng không đổi (khoảng ngày) Methaemoglobin reductase activity: Cá (28-30 g, n=216) ngưng cho ăn ngày trước thí nghiệm, sau tiếp xúc với nồng độ nitrit: đối chứng, 1mM 2.5 mM, nồng độ lặp lại, bể/nồng độ Cá thu mẫu ngày 0, Mẫu máu thu lần con/bể đối chứng con/bể có nitrit Nitrit kiểm tra bổ lần ngày Máu (1,5 mL) rút từ cá nhiễm nitrit, rửa lần (tương tự cá đối chứng) pha loãng với dung dịch đệm Ringer để đạt mL hỗn hợp RBC Hỗn hợp lắc bình thủy tinh có chưa hỗn hợp 99% khơng khí 1% khí CO2 để thu mẫu RBC theo giảm metHB để tính tốc độ enzyme metHb reductase (tương tự cá đối chứng) Xử lý thống kê: Tất hình biểu bảng vẽ chương trình Sigma plot 12.5 Tất số liệu phân tích SPSS 18.0 Giá trị trung bình, khoảng trên-dưới (độ tin cậy 95%) giá trị LC50 96 h nitrit phân tích JMP 9.0 Two- way ANOVA (phương pháp so sánh nhiều nhân tố Holm-Sidak) sử dụng để nhận biết khác nghiệm thức thời điểm thu mẫu thời gian thu mẫu nghiệm thức cho tất tiêu sinh lý máu (dẫn xuất Hb, Hct, Hb, MCHC máu, NO2-, NO3-, ions, protein, áp suất thẩm thấu huyết tương tổng lượng nước thể cá Số liệu chuyển sang phân phối chuẩn dựa vào ShapiroWilk test (chuyển sang dạng logarit) Giá trị p