BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM GVHD: SVTH: MSSV: Lớp: 03DHDB2 Tp.Hồ Chí Minh, Tháng 5, Năm 2014 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài đồ án giao em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:  Giảng viên hướng dẫn: cô tận tình dẫn trực tiếp, truyền đạt kiến thức chuyên môn kinh nghiệm vô quý báu suốt thời gian thực đề tài đồ án  Ban giám hiệu trường đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM tạo nên môi trường học tập phù hợp, quý thầy cô khoa công nghệ thực phẩm,và khoa khác giảng dạy, hướng dẫn để em có kiến thức ngày hơm  Các bạn sinh viên khóa học 2012- 2016 ngành Đảm Bảo Chất Lượng An Toàn Thực Phẩm giúp đỡ, động viên, chia sẻ kinh nghiệm trao đổi kiến thức chuyên môn nhiệt tình suốt thời gian vừa qua  Cuối em xin cảm ơn ba mẹ người thân đứng đằng sau cổ vũ tinh thần tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đồ án mơn học phân tích thực phẩm Một lần em xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực SVTH: Trang -2 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: LỜI MỞ ĐẦU SVTH: Trang -3 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 SVTH: Trang -4 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN PHẢN BIỆN Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 SVTH: Trang -5 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: MỤC LỤC Chương 1- Tổng quan sữa bột gầy 12 1.1 Sữa bột gầy (skimmed milk powder) 12 1.1.1 Định nghĩa nguyên liệu sữa bột gầy .12 1.2 Lịch sử, nguồn gốc 13 1.3 Tính chất vật lý sữa bột gầy 14 1.4 tiêu 14 1.5 Các chất nhiễm bẩn 15 1.6 Độc tố vi nấm sữa bột gầy: Hàm lượng aflatoxin M1, không lớn 0,5 g/kg 15 1.7 Thành phần hóa học sữa bột gầy: 16 1.8 Cream 24 1.8.1 Định nghĩa 24 1.8.2 Phân loại cream 24 1.9 Quy trình cơng nghệ sản xuất sữa bột gầy 27 1.9.1 Sơ đồ: 27 1.9.2 Thuyết minh quy trình: .28 1.9.2.1 Tách béo: 28 1.9.2.2 Thanh trùng 28 1.9.2.3 Cô đặc 28 1.9.2.4 Sấy 29 1.9.2.5 Rây: .29 1.9.2.6 Bao gói 29 Chương 2- Các tiêu chuẩn Việt Nam, Quy chuẩn Việt Nam sữa bột gầy 29 2.1 Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN): TCVN 7404:2004 29 2.1.1 Các tiêu cảm quan 30 2.1.2 Các tiêu lý - hóa sữa bột gầy .30 2.1.3 Các chất nhiễm bẩn .31 2.1.3.1 Hàm lượng kim loại nặng sữa bột gầy 31 2.1.3.2 Độc tố vi nấm sữa bột gầy: Hàm lượng aflatoxin M1, không lớn 0,5 g/kg 31 SVTH: Trang -6 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: 2.1.4 Yêu cầu vệ sinh sữa bột gầy: 31 2.1.5 Các tiêu vi sinh 31 2.1.6 Phụ gia thực phẩm: .32 2.2 Quy chuẩn Việt Nam (QCVN): .35 2.2.1 QUY ĐỊNH CHUNG 35 2.2.1.1 Phạm vi điều chỉnh .35 2.2.1.2 Đối tượng áp dụng 35 2.2.1.3 Giải thích từ ngữ 35 2.2.2 QUY ĐỊNH VỀ KỸ THUẬT .37 2.2.2.1 Các tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm sản phẩm sữa dạng bột 37 2.2.2.2 Các tiêu lý hoá quy định Phụ lục I Quy chuẩn 37 2.2.2.3 Giới hạn tối đa chất nhiễm bẩn quy định Phụ lục II Quy chuẩn .37 2.2.2.4 Các tiêu vi sinh vật quy định Phụ lục III Quy chuẩn .37 2.2.2.5 Danh mục phụ gia thực phẩm phép sử dụng phù hợp với quy định hành .37 2.2.2.6 Có thể sử dụng phương pháp thử có độ xác tương đương với phương pháp quy định kèm theo tiêu Phụ lục I, Phụ lục II Phụ lục III Quy chuẩn .37 2.2.2.7 Số hiệu tên đầy đủ phương pháp lấy mẫu phương pháp thử quy định Phụ lục IV Quy chuẩn 37 2.2.2.8 Trong trường hợp cần kiểm tra tiêu chưa quy định phương pháp thử Quy chuẩn này, Bộ Y tế định theo phương pháp hành nước nước xác nhận giá trị sử dụng 37 2.2.2.9 Ghi nhãn 37 2.2.3 QUY ĐỊNH VỀ QUẢN LÝ 38 2.2.3.1 Công bố hợp quy 38 2.2.3.2 Các sản phẩm sữa dạng bột nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh nước phải công bố hợp quy phù hợp với quy định Quy chuẩn .38 2.2.3.3 Phương thức, trình tự, thủ tục công bố hợp quy thực theo Quy định chứng nhận hợp chuẩn, chứng nhận hợp quy công bố hợp chuẩn, công bố hợp quy ban hành kèm theo Quyết định số 24/2007/QĐSVTH: Trang -7 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: BKHCN ngày 28 tháng năm 2007 Bộ trưởng Bộ Khoa học Công nghệ quy định pháp luật .38 2.2.3.4 Kiểm tra sản phẩm sữa dạng bột 38 2.2.3.5 Việc kiểm tra chất lượng, vệ sinh an toàn sản phẩm sữa dạng bột phải thực theo quy định pháp luật 38 2.2.4 TRÁCH NHIỆM CỦA TỔ CHỨC, CÁ NHÂN 38 2.2.4.1 Tổ chức, cá nhân nhập khẩu, sản xuất sản phẩm sữa dạng bột phải công bố hợp quy phù hợp với quy định kỹ thuật Quy chuẩn này, đăng ký công bố hợp quy quan quản lý nhà nước có thẩm quyền theo phân cấp Bộ Y tế bảo đảm chất lượng, vệ sinh an toàn theo nội dung công bố 38 2.2.4.2 Tổ chức, cá nhân nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh sản phẩm sữa dạng bột sau hoàn tất đăng ký công bố hợp quy bảo đảm chất lượng, vệ sinh an toàn, ghi nhãn phù hợp với quy định pháp luật 38 2.2.5 TỔ CHỨC THỰC HIỆN 38 2.2.5.1 Giao Cục An tồn vệ sinh thực phẩm chủ trì, phối hợp với quan chức có liên quan hướng dẫn triển khai tổ chức việc thực Quy chuẩn .38 2.2.5.2 Căn vào yêu cầu quản lý, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm có trách nhiệm kiến nghị Bộ Y tế sửa đổi, bổ sung Quy chuẩn 38 2.2.5.3 Trong trường hợp tiêu chuẩn quy định pháp luật viện dẫn Quy chuẩn có thay đổi, bổ sung thay áp dụng theo văn 39 Chương 3- Các tiêu phương pháp kiểm tra 40 3.1 Chỉ tiêu hóa lý 40 3.1.1 Xác định độ ẩm sữa bột gầy theo TCVN 5533:1991 40 3.1.1.1 Nguyên tắc: 40 3.1.1.2 Chuẩn bị mẫu 40 3.1.1.3 Tiến hành thử 40 3.1.1.4 Tính kết 41 3.1.1.5 Đánh giá kết 41 3.1.2 Xác định hàm lượng chất béo, theo TCVN 7084:2010 (ISO 1736 : 2000) 41 3.1.2.1 Nguyên tắc 41 SVTH: Trang -8 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: 3.1.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 41 3.1.3 Cách tiến hành 42 3.1.3.1 Phần mẫu thử 42 3.1.3.2 Phép thử trắng .42 3.1.3.3 Chuẩn bị bình thu nhận chất béo 43 3.1.3.4 Phép xác định .44 3.1.3.5 Tính biểu thị kết 47 3.1.4 Hàm lượng protein, theo TCVN7774:2007 (ISO 5542:1984) 48 3.1.4.1 Nguyên tắc 48 3.1.4.2 Cách tiến hành 48 3.1.4.3 Biểu thị kết 51 3.1.4.4 Trường hợp đặc biệt .51 3.2 Các chất nhiễm bẩn – xác định hàm lượng chì (Pb) theo TCVN 5779:1994 52 3.2.1 Nguyên tắc: 52 3.2.2 Cách tiến hành: 52 3.2.2.1 Chiết dung dịch chuẩn dung dịch mẫu phân tích 52 3.2.2.2 Đo phổ hấp thụ 53 3.2.3 Tính tốn xử lý kết .54 3.3 Độc tố vi nấm theo TCVN 6685:2000 55 3.3.1 Nguyên tắc 55 3.3.2 Cách tiến hành 55 3.3.2.1 Khái quát 55 3.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 55 3.3.2.3 Chuẩn bị cột sắc ký chọn lọc 56 Chiết làm mẫu thử .56 3.3.2.4 Sắc ký lỏng hiệu cao 56 3.3.2.5 Tính tốn biểu thị kết 58 3.4 Chỉ tiêu vi sinh vật – xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g sản phẩm theo TCVN5165:1990 59 3.4.1 Nguyên tắc 59 3.4.2 Cách tiến hành 59 3.4.2.1 Khái quát 59 SVTH: Trang -9 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: 3.4.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 59 3.4.2.3 Chuẩn bị cột sắc ký chọn lọc 60 3.4.2.4 Chiết làm mẫu thử 60 3.4.2.5 Sắc ký lỏng hiệu cao 61 Tài liệu tham khảo: 63 SVTH: Trang -10 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: − Dựng đồ thị hàm lượng protein thu phương pháp chuẩn theo độ hấp thụ Nếu có sai lệch khỏi tuyến tính protein cao (độ hấp thụ thấp) cuối đường cong, bỏ kết phép tính hồi qui (Qui trình xác định hàm lượng protein cao mô tả 10.2) Cũng bỏ qua giá trị sai lệch nhiều, nghĩa hàm lượng protein xác định phương pháp chuẩn sai khác hai lần độ lệch chuẩn (được suy từ việc tính phương trình hồi qui đây) từ giá trị tương ứng đồ thị − Suy luận phương trình hồi qui hàm lượng protein xác định phương pháp chuẩn (y) dựa vào độ hấp thụ (x) dựng đồ đường chuẩn y x ✓ CHÚ THÍCH: Các sản phẩm sữa xử lý nhiệt (thanh trùng tiệt trùng) sữa hoàn nguyên cần đến đường chuẩn khác Dung dịch so sánh chuẩn Đồng thời với việc dựng đường chuẩn, đo độ hấp thụ hai dung dịch so sánh chuẩn chuẩn bị Kiểm soát hiệu chuẩn Các mẫu sữa kiểm chứng − Vì việc hiệu chuẩn bị ảnh hưởng biến đổi theo mùa phần nitơ khác sữa, cần kiểm tra thường xuyên Việc thực cách sử dụng mẫu đại diện từ lượng sữa lớn (nghĩa từ lượng lớn sữa bò) hàm lượng protein trung bình, hoặc, tốt sử dụng hai mẫu có hàm lượng protein cao hàm lượng protein thấp, xác định phương pháp chuẩn Kjeldahl (IDF Standard 20) Sử dụng mẫu sữa kiểm chứng − Phải lấy đủ mẫu kiểm chứng cách lấy mẫu đại diện từ mẫu kiểm chứng sữa Có thể bổ sung chất bảo quản vào mẫu đại diện cho mẫu sử dụng quãng thời gian mà giá trị hàm lượng protein chuẩn không bị thay đổi Trang - 50 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: − Mẫu mẫu kiểm chứng cần thử nghiệm hai lần giống trước ngày thử nghiệm mẫu Thông thường, chúng phải thực sau dãy xác định tần số 10, vào khoảng định kỳ q trình thử nghiệm liên tục để kiểm sốt "độ trệch" Tương tự, cần kiểm tra số đọc máy đo quang phổ sử dụng dung dịch so sánh chuẩn, số đọc thang đo máy đo quang phổ xác định thời điểm hiệu chuẩn 3.1.4.3 Biểu thị kết Phương pháp tính Từ đường chuẩn, từ độ hấp thụ đo suy hàm lượng protein mẫu biểu thị kết gam protein 100 g mẫu Hiệu chỉnh chênh lệch "hàm lượng protein Kjeldahl" hàm lượng protein đọc từ đường chuẩn mẫu sữa kiểm Độ lặp lại Chênh lệch kết hai phép xác định tiến hành liên tục nhanh, người thực hiện, không vượt 0,03 g protein 100 g mẫu 3.1.4.4 Trường hợp đặc biệt Mẫu bảo quản − Phương pháp áp dụng mà không cần sửa đổi, cho mẫu bảo quản cách bổ sung từ 0,07 % đến 0,1 % (phần khối lượng) thủy ngân (II) clorua (qui định cho phép) từ 0,02 % đến 0,3 % (phần khối lượng) natri azit Đối với mẫu bảo quản kali dicromat 0,1 % (phần khối lượng) phương pháp áp dụng thời gian tính từ lúc bổ sung dung dịch đen amido vào sữa đến lúc lấy số đọc quang phổ ngắn, trường hợp sử dụng phương pháp lọc áp dụng qui trình ly tâm Phương pháp khơng thể áp dụng cho mẫu bảo quản formaldehyt − Trong trường hợp bảo quản viên thuốc, thường khoảng 0,5 % (phần khối lượng) natri clorua Điều ảnh hưởng đến độ hấp thụ, kết thu Trang - 51 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: phương pháp Kjeldahl cần phải hiệu chỉnh kết Nên suy hàm lượng protein từ đường chuẩn đặc thù thu với mẫu bảo quản dựa vào kết thu phương pháp Kjeldahl hiệu chỉnh bảo quản (ảnh hưởng pha loãng viên thuốc, nitơ từ azit thuốc nén) Sự lệch khỏi đường tuyến tính đường chuẩn − Đối với loại sữa có hàm lượng protein cao mà cho kết khơng nằm đường chuẩn tuyến tính tiến hành sau: − Pha loãng lượng định mẫu sữa có hàm lượng protein cao với thể tích tương tự mẫu sữa có hàm lượng protein biết (dung dịch chuẩn dung dịch kiểm chứng), trộn xác định hàm lượng protein hỗn hợp − Tính hàm lượng protein mẫu có hàm lượng protein cao (w1) từ hàm lượng protein hỗn hợp (w2) hàm lượng protein sữa chuẩn (w3) công thức sau đây: w1 = 2w2 - w3 3.2 Các chất nhiễm bẩn – xác định hàm lượng chì (Pb) theo TCVN 5779:1994 (Xác định hàm lượng chì phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sau chiết) 3.2.1 Nguyên tắc: − Chì mẫu sữa sau vơ hố theo tiêu chuẩn TCVN 4662 - 1994 chiết amoni 1-pyrrolidinecarbodithiolate (APDC) với dung môi butylaxetat (BuOAc) metylizobutylxêton (MIBX) phun dịch hữu vào lửa đèn C2H2 - không khí, đo cường độ hấp thụ đèn catot rỗng Pb vạch phổ Pb-217 nm (vạch 1) Pb-283,3 nm (vạch 2) 3.2.2 Cách tiến hành: 3.2.2.1 Chiết dung dịch chuẩn dung dịch mẫu phân tích − Lấy vào phễu chiết dung dịch chất sau đây: phễu từ số đến 0,0; 0,1; 0,2; 0,4 0,6 ml dung dịch chuẩn 10 g Pb/ml; phễu số lấy Trang - 52 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: 10 ml dung dịch mẫu phân tích (nếu hàm lượng Pb lớn q đường chuẩn thể tích dung dịch phân tích lấy hơn), thêm vào phễu ml dung dịch MgCl2, thêm nước cất cho đủ thể tích 25 ml − Chiết butylaxetat (BuOAc) : thêm vào bình ml axit xitric, - giọt thị bromocresol lục, điều chỉnh pH đến 5,4 dung dịch NH4OH 1:1 (đến dung dịch có màu xanh), thêm ml dung dịch APDC, lắc đều, thêm tiếp 10ml butylaxetat lắc mạnh khoảng phút, để yên cho tách lớp hoàn toàn Nếu lớp dung mơi hữu vẩn đục tách lấy vào ống nghiệm li tâm có dung tích khoảng 15 ml, bịt giấy nhôm chất dẻo đàn hồi đem li tâm 2000 v/phút khoảng phút, tách lấy phần hữu vào lọ tương ứng có nút kín 3.2.2.2 Đo phổ hấp thụ − Thiết lập chế độ tối ưu máy đo vạch Pb - 217 Pb - 283, nm theo tài liệu hướng dẫn kỹ thuật hãng Ví dụ thơng số sau máy Philipe Pey Unicame SP9/800: − Vạch: Pb - 217 nm; − Khe đo: 0,5 nm; − Cường độ đèn: 80% giá trị cực đại; − Chiều cao lửa (burner): 4,5 mm; − Tốc độ dẫn mẫu: ml/phút; − - Khí đốt: Khơng khí: 4,2 lít/ phút; • axetylen: 1:1 lít/phút; − Cho máy chạy khơng tải 20 - 30 phút để đạt cân nhiệt độ ổn định − Đặt đường (điểm không tín hiệu) cách đốt dung mơi BuOAc MIBX bão hoà nước − Đo phổ từ nồng độ thấp đến nồng độ cao, dung dịch mẫu phân tích đo sau cùng, mẫu đo - lần lấy giá trị trung bình, rửa hệ thống dẫn đốt sau lần đo nước bão hoà dung mơi Trang - 53 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: − Từ kết thu phụ thuộc khối lượng Pb dịch chiết - số máy (A D), từ suy khối lượng Pb có mẫu phân tích (g) 3.2.3 Tính tốn xử lý kết Hàm lượng Pb sữa (X) tính theo mg/kg, theo cơng thức: m1 x 2,5 m X= Trong đó: m1 - khối lượng Pb có dung dịch phân tích, g m - khối lượng mẫu sữa lấy để vơ hố, g Kết phân tích chấp nhận thực phép phân tích song song điều kiện cho sai lệch tương đối không vượt  25% Trang - 54 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: 3.3 Độc tố vi nấm theo TCVN 6685:2000 3.3.1 Nguyên tắc Cho phần mẫu thử qua cột sắc ký chọn lọc để chiết tách aflatoxin M1 Cột có chứa kháng thể định liên kết với chất phụ trợ rắn Khi mẫu thử qua cột kháng thể kết hợp cách chọn lọc với aflatoxin M1 (kháng nguyên) có mặt tạo phức kháng nguyên – kháng thể Tất thành phần khác mẫu thử rửa khỏi cột nước Sau rửa giải aflatoxin M1 khỏi cột thu lấy dung môi rửa giải Lượng aflatoxin M1 có mặt dung mơi rửa giải xác định sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có detector huỳnh quang 3.3.2 Cách tiến hành 3.3.2.1 Khái quát Thực quy trình tránh xa ánh sáng tốt Các phương pháp hoàn nguyên sữa bột, nạp lên cột sắc ký chọn lọc, rửa cột rửa giải cột có khác nhà sản xuất cột Các hướng dẫn sử dụng cột cụ thể phải thực cách xác Nhìn chung, quy trình đòi hỏi phải hồn ngun sữa bột nước dung dịch đệm muối, li tâm, nạp cột áp suất (có khả rửa trước), rửa cột nước rửa giải aflatoxin metanol axetonitril Nên tuân thủ hướng dẫn tốc độ dòng 3.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thử − Cân 10 g mẫu, xác đến 0,1 g cho vào cốc có mỏ dung tích 250 ml (5.5) Lấy 50 ml nước làm ấm đến 50oC thêm từ từ vào sữa bột Dùng que khuấy để trộn hỗn hợp đồng − Nếu chưa hòa tan hoàn toàn sữa bột, đặt cốc vào nồi cách thủy (5.7) 50oC 30 phút Trộn kỹ − Để dung dịch nguội đến 20oC chuyển hết sang bình định mức dung tích 100 ml (5.6) dùng nước để tráng Pha lỗng nước đến vạch mức 100 ml Trang - 55 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: Lọc sữa hồn ngun qua giấy lọc (5.8) li tâm tốc độ 000 x g 15 phút Thu lấy 50 ml sữa xử lý Tiếp tục theo quy định 7.4 3.3.2.3 Chuẩn bị cột sắc ký chọn lọc Gắn ống xylanh 50 ml (5.1) lên đỉnh cột sắc ký chọn lọc (4.1) Nối dầu cột với hệ thống hút chân khơng (5.2) • Chiết làm mẫu thử − Dùng pipet lấy 50 ml mẫu thử chuẩn bị cho vào xylanh 50 ml (5.1) cho qua cột sắc ký chọn lọc với tốc độ chậm ổn định từ ml/phút đến ml/phút, dùng hệ thống hút chân không (5.2) để kiểm soát tốc độ − Tháo xylanh 50 ml thay xylanh 10 ml Rửa cột 10 ml nước Cho nước qua cột với tốc độ ổn định Sau làm sạch, thổi cột đến khô hoàn toàn − Tháo cột khỏi hệ thống hút chân không Rửa giải aflatoxin M1 từ từ khỏi cột cách dùng xylanh 10 ml cho ml axetonitril (4.2), qua cột khoảng 60 giây Dùng pitong Thổi nhẹ luồng khí ni tơ (4.3) để giảm thể tích dung mơi rửa giải đến Ve từ 500 µl đến 50 µl 30oC − Cảnh báo: Nếu cho bay đến khơ hồn tồn làm thất aflatoxin M1 − Pha lỗng thể tích dung mơi rửa giải cuối Vf 10 lần thể tích Ve (tức dùng từ 500 µl đến 5000 µl nước, xem thích) − Chú thích – Nếu hàm lượng axetonitril chất chiết bơm chứa aflatoxin M1 vượt 10% giới hạn, sắc đồ HPLC xuất việc giãn rộng pic Tuy nhiên, hàm lượng nước 90% không ảnh hưởng lên hình dạng pic 3.3.2.4 Sắc ký lỏng hiệu cao Chuẩn bị bơm − Bơm dung mơi rửa giải (4.2.1) với tốc độ dòng ổn định qua cột máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nếu cần (tùy thuộc loại cột sử dụng), điều Trang - 56 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: chỉnh tỷ lệ axetonitril – nước dung môi rửa giải HPLC (4.2.1) để tách hết aflatoxin M1 khỏi thành phần khác − Tốc độ dòng dung môi rửa giải (4.2.1) phụ thuộc vào cột (5.10.3) Theo hướng dẫn cột thơng thường (có chiều dài khoảng 25 cm đường kính khoảng 4,6 mm), tốc độ dòng chảy khoảng ml/phút cho kết tối ưu; cột HPLC có đường kính mm tốc độ dòng chảy khoảng 0,5 ml/phút cho kết tối ưu − Để đạt điều kiện tối ưu cụ thể, nên sử dụng dịch chiết mẫu (tốt không chứa aflatoxin M1) bơm riêng rẽ bơm kết hợp với chuẩn aflatoxin M1 Chạy sắc ký − Kiểm tra độ tuyến tính lần bơm dung dịch chuẩn độ ổn định hệ thống sắc ký Bơm lặp lại dung dịch chuẩn aflatoxin M1 (một lượng cố định) đạt diện tích peak chiều cao peak không đổi Các lần bơm liên tiếp không sai khác 5% tính theo diện tích pic chiều cao pic − Thời gian lưu aflatoxin M1 phụ thuộc vào nhiệt độ Do phải hiệu chỉnh lại sai lệch hệ thống detector Bằng cách bơm lượng cố định dung dịch chuẩn aflatoxin M1 theo khoảng thời gian đặn, kết dung dịch chuẩn hiệu chỉnh cho độ lệch quan sát thấy Dựng đường chuẩn aflatoxin M1 − Bơm dung dịch chuẩn aflatoxin M1, tùy thuộc thể tích vòng bơm, lấy thể tích thích hợp, Vi, có chứa tương ứng 0,05 ng, 0,1 ng, 0,2 ng 0,4 ng aflatoxin M1 Dựng đồ thị chuẩn theo diện tích peak độ cao peak tương ứng với khối lượng aflatoxin M1 bơm Phân tích dịch chiết làm sơ đồ bơm − Bơm thể tích thích hợp, Vi, dung môi rửa giải (7.4) vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao qua vòng bơm Tách tất aflatoxin M1 có mặt, sử dụng điều kiện dung dịch chuẩn Tiến hành bơm dung dịch chuẩn dịch chiết mẫu theo sơ đồ bơm xác định Trang - 57 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: − Khi cần bơm dãy liên tiếp dung mơi rửa giải mẫu, nên sau năm lần bơm dung môi rửa giải mẫu, bơm xen kẽ dung dịch chuẩn aflatoxin M1 − Xác định diện tích độ cao peak aflatoxin M1 dung môi rửa giải mẫu Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định khối lượng aflatoxin M1 (ng) có thể tích dịch chiết mẫu bơm − Nếu diện tích peak độ cao peak aflatoxin M1, dung mơi rửa giải mẫu lớn diện tích peak độ cao peak dung dịch chuẩn cao nhất, pha lỗng định lượng dung mơi rửa giải nước bơm lại dịch chiết pha loãng vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao 3.3.2.5 Tính tốn biểu thị kết Tính tốn Tính hàm lượng aflatoxin M1 mẫu thử, wp, microgam kilogam, theo công thức sau: wp = mA x (Vf / Vi) x (1/m) m: khối lượng sữa bột 50 ml dung dịch thử chuẩn bị (7.4), tính gam; đà làm ntn chứ:DVf Vi giống 8.1.1 Công thức áp dụng khơng pha lỗng dung dịch, dung dịch khác độ pha lỗng phải đưa vào tính toán Biểu thị kết Biểu thị kết microgam kilogam, tính đến ba chữ số sau dấu phẩy Trang - 58 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: 3.4 Chỉ tiêu vi sinh vật – xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g sản phẩm theo TCVN5165:1990 3.4.1 Nguyên tắc Cho phần mẫu thử qua cột sắc ký chọn lọc để chiết tách aflatoxin M1 Cột có chứa kháng thể định liên kết với chất phụ trợ rắn Khi mẫu thử qua cột kháng thể kết hợp cách chọn lọc với aflatoxin M1 (kháng nguyên) có mặt tạo phức kháng nguyên – kháng thể Tất thành phần khác mẫu thử rửa khỏi cột nước Sau rửa giải aflatoxin M1 khỏi cột thu lấy dung mơi rửa giải Lượng aflatoxin M1 có mặt dung môi rửa giải xác định sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có detector huỳnh quang 3.4.2 Cách tiến hành 3.4.2.1 Khái quát Thực quy trình tránh xa ánh sáng tốt Các phương pháp hoàn nguyên sữa bột, nạp lên cột sắc ký chọn lọc, rửa cột rửa giải cột có khác nhà sản xuất cột Các hướng dẫn sử dụng cột cụ thể phải thực cách xác Nhìn chung, quy trình đòi hỏi phải hồn ngun sữa bột nước dung dịch đệm muối, li tâm, nạp cột áp suất (có khả rửa trước), rửa cột nước rửa giải aflatoxin metanol axetonitril Nên tuân thủ hướng dẫn tốc độ dòng 3.4.2.2 Chuẩn bị mẫu thử − Cân 10 g mẫu, xác đến 0,1 g cho vào cốc có mỏ dung tích 250 ml Lấy 50 ml nước làm ấm đến 50oC thêm từ từ vào sữa bột Dùng que khuấy để trộn hỗn hợp đồng − Nếu chưa hòa tan hồn tồn sữa bột, đặt cốc vào nồi cách thủy Ở 50oC 30 phút Trộn kỹ Trang - 59 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: − Để dung dịch nguội đến 20oC chuyển hết sang bình định mức dung tích 100 ml dùng nước để tráng Pha lỗng nước đến vạch mức 100 ml Lọc sữa hoàn nguyên qua giấy lọc li tâm tốc độ 000 x g 15 phút Thu lấy 50 ml sữa xử lý Tiếp tục theo quy định 3.4.2.3 Chuẩn bị cột sắc ký chọn lọc Gắn ống xylanh 50 ml (5.1) lên đỉnh cột sắc ký chọn lọc (4.1) Nối dầu cột với hệ thống hút chân không (5.2) 3.4.2.4 Chiết làm mẫu thử − Dùng pipet lấy 50 ml mẫu thử chuẩn cho vào xylanh 50 ml cho qua cột sắc ký chọn lọc với tốc độ chậm ổn định từ ml/phút đến ml/phút, dùng hệ thống hút chân khơng để kiểm sốt tốc độ − Tháo xylanh 50 ml thay xylanh 10 ml Rửa cột 10 ml nước Cho nước qua cột với tốc độ ổn định Sau làm sạch, thổi cột đến khơ hồn tồn − Tháo cột khỏi hệ thống hút chân không Rửa giải aflatoxin M1 từ từ khỏi cột cách dùng xylanh 10 ml cho ml axetonitril.đi qua cột khoảng 60 giây Dùng pitong xylanh để kiểm sốt tốc độ dòng Thu lấy dịch rửa giải vào ống hình Thổi nhẹ luồng khí ni tơ − để giảm thể tích dung mơi rửa giải đến Ve từ 500 µl đến 50 µl 30oC − Cảnh báo: Nếu cho bay đến khơ hồn tồn làm thất aflatoxin M1 Trang - 60 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: − Pha lỗng thể tích dung mơi rửa giải cuối Vf 10 lần thể tích Ve (tức dùng từ 500 µl đến 5000 µl nước, xem thích) − Chú thích – Nếu hàm lượng axetonitril chất chiết bơm chứa aflatoxin M1 vượt 10% giới hạn, sắc đồ HPLC xuất việc giãn rộng pic Tuy nhiên, hàm lượng nước 90% không ảnh hưởng lên hình dạng pic [8] 3.4.2.5 Sắc ký lỏng hiệu cao − Chuẩn bị bơm − Bơm dung mơi rửa giải (4.2.1) với tốc độ dòng ổn định qua cột máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nếu cần (tùy thuộc loại cột sử dụng), điều chỉnh tỷ lệ axetonitril – nước dung môi rửa giải HPLC để tách hết aflatoxin M1 khỏi thành phần khác − Tốc độ dòng dung mơi rửa giải giả phụ thuộc vào cột Theo hướng dẫn cột thơng thường (có chiều dài khoảng 25 cm đường kính khoảng 4,6 mm), tốc độ dòng chảy khoảng ml/phút cho kết tối ưu; cột HPLC có đường kính mm tốc độ dòng chảy khoảng 0,5 ml/phút cho kết tối ưu − Để đạt điều kiện tối ưu cụ thể, nên sử dụng dịch chiết mẫu (tốt không chứa aflatoxin M1) bơm riêng rẽ bơm kết hợp với chuẩn aflatoxin M1 − Chạy sắc ký − Kiểm tra độ tuyến tính lần bơm dung dịch chuẩn độ ổn định hệ thống sắc ký Bơm lặp lại dung dịch chuẩn aflatoxin M1 (một lượng cố định) đạt diện tích pic chiều cao pic không đổi Các lần bơm liên tiếp khơng sai khác q 5% tính theo diện tích pic chiều cao pic − Thời gian lưu aflatoxin M1 phụ thuộc vào nhiệt độ Do phải hiệu chỉnh lại sai lệch hệ thống detector Bằng cách bơm lượng cố định dung dịch chuẩn aflatoxin M1 theo khoảng thời gian đặn, kết dung dịch chuẩn hiệu chỉnh cho độ lệch quan sát thấy − Dựng đường chuẩn aflatoxin M1 Trang - 61 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: − Bơm dung dịch chuẩn aflatoxin M1, tùy thuộc thể tích vòng bơm, lấy thể tích thích hợp, Vi, có chứa tương ứng 0,05 ng, 0,1 ng, 0,2 ng 0,4 ng aflatoxin M1 Dựng đồ thị chuẩn theo diện tích pic độ cao pic tương ứng với khối lượng aflatoxin M1 bơm − Phân tích dịch chiết làm sơ đồ bơm − Bơm thể tích thích hợp, Vi, dung mơi rửa giải vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao qua vòng bơm Tách tất aflatoxin M1 có mặt, sử dụng điều kiện dung dịch chuẩn Tiến hành bơm dung dịch chuẩn dịch chiết mẫu theo sơ đồ bơm xác định − Khi cần bơm dãy liên tiếp dung môi rửa giải mẫu, nên sau năm lần bơm dung môi rửa giải mẫu, bơm xen kẽ dung dịch chuẩn aflatoxin M1 − Xác định diện tích độ cao pic aflatoxin M1 dung môi rửa giải mẫu Dựa vào đồ thị chuẩn, xác định khối lượng aflatoxin M1 (ng) có thể tích dịch chiết mẫu bơm − Nếu diện tích pic độ cao pic aflatoxin M1, dung môi rửa giải mẫu lớn diện tích pic độ cao pic dung dịch chuẩn cao nhất, pha lỗng định lượng dung môi rửa giải nước bơm lại dịch chiết pha loãng vào thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao Tính tốn biểu thị kết − Tính: − Tính hàm lượng aflatoxin M1 mẫu thử, wp, microgam kilogam, theo công thức sau: wp = mA x (Vf / Vi) x (1/m) − − m: khối lượng sữa bột 50 ml dung dịch thử chuẩn , tính gam; − mA: khối lượng aflatoxin M1 tương ứng với diện tích độ cao pic dung mơi rửa giải mẫu, tính nanogam; − Vi: thể tích dung mơi rửa giải mẫu bơm, tính microlit; − Vf; thể tích cuối dung mơi rửa giải mẫu, tính microlit; Trang - 62 ĐỒ ÁN MƠN HỌC GVHD: − Cơng thức áp dụng khơng pha lỗng dung dịch, dung dịch khác độ pha lỗng phải đưa vào tính toán Biểu thị kết − Biểu thị kết microgam kilogam, tính đến ba chữ số sau dấu phẩy CHƯƠNG 4- TÀI LIỆU THAM KHẢO: Trang - 63 ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: Trang - 64 ... Chương 2- Các tiêu chuẩn Việt Nam, Quy chuẩn Việt Nam sữa bột gầy 29 2.1 Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN): TCVN 7404:2004 29 2.1.1 Các tiêu cảm quan 30 2.1.2 Các tiêu lý - hóa sữa bột gầy... 63 SVTH: Trang -10 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 – số WPNI loại sữa bột gầy 12 Bảng 1.2 – tiêu cảm quan sữa bột gầy 14 Bảng1 – tiêu hóa lý sữa bột gầy 15... -13 ĐỒ ÁN HỌC PHẦN GVHD: biến thành loại sữa tươi tiệt trùng, sữa trùng, sữa đặc và sản phẩm từ sữa với loại − Theo tiêu chuẩn trên, ta thấy sữa gầy có hàm lượng béo thấp nên nhiều người tiêu