ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TỐNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA LỒI NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.) Ở THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TỐNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L.) Ở THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN Hóa hữu Mã số: 44 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài:“Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) Thành phố Thái Ngun” cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Học viên Tống Thị Hoa XÁC NHẬN CỦA NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN KHOA CHUYÊN MÔN HƯỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian qua, em nhận nhiều giúp đỡ thầy cơ, gia đình bạn bè Những điều quý báu giúp em nỗ lực hồn thành khóa luận Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Mai Thanh Nga, giảng viên mơn Hóa hữu trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo em suốt trình hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn, thầy cô kỹ thuật viên mơn Hóa hữu giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em thực khóa luận mơn Do bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học số yếu tố khách quan khác nên đề tài nghiên cứu khoa học em tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý bảo thầy giáo, cô giáo bạn để đề tài hoàn thiện Và cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, người thành bên động viên, giúp đỡ em thực khóa luận Thái Nguyên, tháng năm 2018 Học viên Tống Thị Hoa MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Artemisia 1.2 Tổng quan ngải cứu 1.2.1 Tên khoa học 1.2.2 Đặc điểm thực vật học 1.2.3 Nguồn gốc 1.2.4 Công dụng Ngải cứu 1.2.5 Thành phần hóa học 1.2.6 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.3 Tổng quan tinh dầu 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Phân loại 1.3.3 Vai trò 1.3.4 Cách sử dụng 12 1.3.5 Tính chất vật lý tinh dầu 13 1.3.6 Thành phần chủ yếu tinh dầu 13 1.3.7 Kiểm định cách bảo quản tinh dầu 16 1.4 Tổng quan flavonoid 16 1.4.1.Đại cương 16 1.4.2 Vai trò flavonoid 17 1.4.3.Vai trò flavonoid y học 18 1.4.4 Phân loại 19 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu 26 2.2.1 Hóa chất 26 2.2.2 Thiết bị 26 2.3 Phương pháp định tính chất dịch chiết 27 2.3.1 Định tính flavonoid 27 2.3.2 Định tính cumarine 28 2.3.3 Định tính saponine 28 2.3.4 Định tính alkaloid 29 2.3.5 Định tính tanine 29 2.3.6 Định tính glycosid tim 30 2.3.7 Định tính đường khử 31 2.3.8 Định tính acid amin 31 2.3.9 Định tính polysaccharide 31 2.3.10 Định tính chất béo 32 2.3.11 Định tính sterols 32 2.4 Phương pháp chưng cất lôi nước (tách tinh dầu) 32 2.4.1 Xử lý nguyên liệu 32 2.4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến lượng tinh dầu 33 2.5 Phương pháp chiết tách xác định cấu trúc hợp chất phân lập 35 2.5.1 Xử lý mẫu thực vật 35 2.5.2 Chiết phân lập hợp chất hữu 36 2.5.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc hóa học chất 38 Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Định tính nhóm hợp chất thiên nhiên có thân ngải cứu 39 3.2 Kết nghiên cứu chiết tách tinh dầu 40 3.2.1 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu 40 3.2.2 Kết nghiên cứu xác định thành phần hàm lượng số hợp chất tinh dầu ngải cứu 42 3.3 Kết phân lập hợp chất 47 3.4 Xác định cấu trúc chất phân lập 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT EA Ethyl acetate GC/MS Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ H N-hexane HMBC Phổ tương quan hai chiều H-C HSQC Phổ tương quan chiều H-C Rf Hệ số lưu SKLM Sắc ký lớp mỏng 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 13C H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân nguyên tử 1H DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kết sắc ký cột silicagel cao chiết ethyl acetate 37 Bảng 2.2: Kết sắc ký cột silicagel phân đoạn ET3 38 Bảng 2.3 Kết sắc ký cột silicagel phân đoạn ET 3.2 38 Bảng 3.1: Kết định tính nhóm chất thân ngải cứu 39 Bảng 3.2 Khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỉ lệ tinh dầu 40 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hàm lượng tinh dầu 41 Bảng 3.4 Thời gian chưng cất tinh dầu thân, ngải cứu 42 Bảng 3.5 Thành phần hóa học tinh dầu thân ngải cứu 43 chiết với dung môi nước 43 Bảng 3.6 Thành phần hóa học tinh dầu thân ngải cứu với dung môi chưng cất dung dịch muối ăn NaCl 10% 45 Bảng 3.7 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR H với số liệu phổ 1HNMR 13C-NMR 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavone 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các phận ngải cứu Hình 1.2: Lá hoa ngải cứu Hình 1.3: Dược phẩm sản phẩm dưỡng da Hình 3.2: Phổ 13C-NRM hợp chất H1 48 Hình 3: Khung flavone 49 21 Isbornyl-3-methylbutanoate 22 γ-cadinene 23 α-cedrol 24 (-)-caryophyllene oxide 25 Nerolidol 26 Spathulenol 1,7,7- 27 trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl 28 Bornyl angelate 29 Humulene oxide 30 α-cadinol 31 Juniper camphor 3-m 6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a- oc 32 33 Elemene 34 Isobutyl phthalate 35 Phytol Kết nghiên cứu cho thấy tinh dầu ngải cứu chiết dung môi nước có tới 41 hợp chất 35 hợp chất định danh với thành phần hóa học chủ yếu hợp chất (-)-caryophyllene oxide chiếm 17,38 %, spathulenol 6,32 %, humulene epoxide II 6,20 %; trans-β-caryophyllene 5,98 %; (-)-β- elemene 5,73 % ; αpinene 4,51 % 3.2.3.2 Thành phần hóa học tinh dầu thân ngải cứu với dung môi chưng cất dung dịch muối ăn NaCl 10% Phần thân ngải cứu chưng cất với dung môi dung dịch muối ăn NaCl 10% thu tinh dầu có thành phần sau: Bảng 3.6 Thành phần hóa học tinh dầu thân ngải cứu với dung môi chưng cất dung dịch muối ăn NaCl 10% STT Thành phần α-pinene β-phellandrene β-pinene Cymene D-limonene p-cineole Filifolone p-menta-E-2,8(9)-dien-1-ol 2-pinene-7-one 10 δ-elemene 11 α-copaene 12 (-)-β- elemene 13 Trans-β-caryophyllene 14 α-humulene 15 2-isopropenyl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7- oc 16 Valencene 17 β-selinene 18 Torreyol 19 γ-cadinene 20 Cubebol 21 Calamenene 22 1H-Benzocyclohepten-7-ol,2,3,4,4a,5,6,7,8-octa 1,1,4aα,7β-tetramethyl-cis 23 (-)-caryophyllene oxide 24 Palustrol 25 Spathulenol 26 Veridiflorol 27 Ledol 28 Humulene epoxide II 29 γ-eudesmol 30 Tetracyclo[6.3.2.0E1,8]tridecan-9-ol,4,4-dimethy 31 α-cadinol 32 α-eudesmol 33 Juniper camphor 34 Trans-β-terpineol 35 Longiborneol 6-isopropenyl-4,8a-dimethyl-1,2,3,5,6,7,8,8a-oc 36 37 Cembrebe 38 1-cyclohexanone,2-methyl-2-(3-methyl-2-oxoby 39 Aromadendrenepoxxide-(I) 40 Trans-phytol 46 Kết nghiên cứu cho thấy tinh dầu ngải cứu chiết dung mơi NaCl 10% có tới 52 hợp chất có 40 hợp chất định danh với thành phần chủ yếu (-)-caryophyllene oxide chiếm 32,81%, spathulenol 8,32%, humulene epoxide II 7,52%; trans-β-caryophyllene 7,34%; (-)-β- elemene 4,25% ; α-humulene 3,96% Kết luận: - Thành phần hóa học tinh dầu lồi ngải cứu đa dạng - Khi chiết dung mơi nước có mặt NaCl 10% thu hàm lượng tinh dầu lớn hơn, thành phần hợp chất nhiều dung môi nước - Tách tinh dầu phương pháp chưng cất nước mang lại hiệu kinh tế cao, dung môi rẻ tiền, thiết bị đơn giản 3.3 Kết phân lập hợp chất Từ 2,5 kg bột ngải cứu ngâm chiết nhiều lần dung môi: ethanol, nhexane, ethyl acetate Quá trình phân lập chất từ cao ethyl acetate (36 g) thực săc ký cột silicagel với hệ thống dung mơi thích hợp thu chất ký hiệu H1 3.4 Xác định cấu trúc chất phân lập Cấu trúc H1 xác định dựa vào liệu phổ 1H-NRM, 13C-NRM, HSQC, HMBC so sánh tài liệu tham khảo Phổ 1H NMR có sáu proton vòng thơm, hai tín hiệu proton vòng thơm xuất với cường độ gấp đơi [δH 8,15 (2H, d) 7.02 (2H, d)], có số ghép J = 8,5 cho thấy cặp proton tương đương nằm vị trí ortho với Tín hiệu δH 12,16 ppm phổ 1H NMR khẳng định nhóm –OH phải gắn vào C5 khung flavones (hình 3.1) 47 Hình 3.1: Phổ 1H-NRM hợp chất H1 Hình 3.2: Phổ 13C-NRM hợp chất H1 Phổ 13C-NMR hợp chất H1 xuất 13 tín hiệu, có tín hiệu δC 130,465 ppm δC 116.351 ppm có cường độ gấp đơi Vậy cơng thức cấu tạo hợp chất H1 có tổng cộng 15 carbon, gồm12 carbon vòng thơm [δC 165.02 (C-4’); 162.34 (C-7); 160.5 (C-5); 157.82 (C-9); 130.46 (C-2’ C-6’); 123.34 (C-1’); 116.35 (C-3’ C-5’); 104.17 (C-10); 99.21(C-6) 94.52 (C-8)], carbon olefin mang oxygen [δC 147.06 (C-2) 136.63 (C-3)], carbon carbonyl [δC 176,61 (C- 4)] cho phép dự đốn hợp chất H1 có khung flavone Hình 3: Khung flavone Phổ DEPT NMR kết hợp với phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất H1 có nhóm – CH= nhóm C tứ cấp Phổ HSQC cho tín hệu proton δH 6,26 ppm gắn trực tiếp với C 99,21ppm; H 6,52 gắn trực tiếp với C 94,52 ppm; H δH 7.02 ppm gắn trực tiếp với carbon δC 116.35 ppm tín hiệu proton δH 8,15 ppm gắn trực tiếp với C δC 130.46 ppm .Điều chứng tỏ bốn proton nằm vòng B có tính đối xứng Phổ HMBC (xét vòng A) proton -OH nối tương quan với carbon vòng thơm mang oxygen [δC 162.3 ppm], carbon vòng thơm tứ cấp [δC 104.1ppm] carbon vòng thơm mang hydrogen [δC 99.2 ppm] khẳng định ba tín hiệu carbon C-5, C-10 C-6 Proton H-6 [δH 6,26 ppm] ghép metha với proton δH 6,52 ppm, nên proton H-8 Mặt khác, hai proton H-6 H-8 tương quan với carbon δC 162.3 ppm phổ HMBC, nên carbon phải C-7 Carbon δC 157.8 ppm cho tương quan với với proton H-8 phổ HMBC nên carbon carbon C-9 Phổ HMBC (xét vòng B), tín hiệu proton δH 8,15 ppm cho tương quan với hai carbon sp2 mang oxygen [δC 160.1 ppm 147.0 ppm] carbon sp2 tứ cấp [δC 123.3 ppm] Tín hiệu proton δH 7.02 ppm cho tương quan với hai ba carbon δC 160.2 ppm δC 123.3 ppm Do suy tín hiệu proton [δH 8,15 ppm] ứng với H-2’ H-6’, tín hiệu proton [δH 7.02 ppm] ứng với H-3’ H-5’, ba carbon sp2 δC 130.4 ppm; δC 147.0 ppm δC 123.3 ppm C-6’, C-2 C-1’ Như vậy, 13 tín hiệu carbon khung flavone phổ 13 C NMR tín hiệu carbon sp2 [δC 136.6 ppm] nên carbon phải C-3 Bảng 3.7 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR H với số liệu phổ H-NMR 13C-NMR 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavone [19] H1 Vị trí 6.26 (s 6.52 (s 10 1’ 2’ 8.15 (d, 3’ 7.02 (d, 4’ 5’ 7.02 (d, 6’ 8.15 (d, Từ liệu phổ, kết hợp với kết Rahaman M et al 2006, kết luận hợp chất H1 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones (kaempferol) Các kết nghiên cứu hợp chất 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones cho thấy hợp chất có tác dụng tích cực việc chống ung thư bệnh tim mạch, chống động kinh, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống co thắt, trị đái tháo đường, giảm đau làm giảm ho KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thành phần hóa học lồi ngải cứu, chúng tơi thu số kết sau: 1.1 Định tính có mặt số nhóm hợp chất hữu flavonoid, cumarine, tanin, acid amin… ngải cứu 1.2 Xây dựng điều kiện tối ưu chiết xuất tinh dầu ngải cứu theo phương pháp chưng cất lôi nước - Tỷ lệ nước/ nguyên liệu: 4/1 - Nồng dộ dung dịch NaCl: 10% - Thời gian chưng cất: 180 phút - Tỷ lệ khối lượng tinh dầu ngải cứu là: 0,120% (w/w) 1.3 Xác định thành phần hàm lượng số hợp chất tinh dầu lồi ngải cứu: - Chiết dung mơi nước: 35 hợp chất - Chiết dung môi nước NaCl 10%: 40 hợp chất 1.4 Phân lập 01 hợp chất tinh khiết dịch chiết ethyl acetate xác định cấu trúc hợp chất H1 3,5,7,4’- tetrahydroxy flavones (hay gọi kaempferol) KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc ký cột để tách hợp chất khác dịch chiết thân hoa ngải cứu để so sánh Làm giàu cấu tử chính, đánh giá hoạt tính sinh học ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào… nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng chống số bệnh cho người vật nuôi, NXB Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất giáo dục Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Phạm Hồng Hộ (2000), Cây Cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học tập II, NXB Y học ,Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2003), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh, Lipit axit béo hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, NXB khoa học kỹ thuật, (2006) Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Lê Ngọc Thạch (2003) Tinh Dầu, NXB Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh 10 Ngơ Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu tập 1, NXB Y học, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 11 Abdul Majeeth Kamarul Haniya and Palghat Raghunathan Padma (2013), antioxidant effect of Artemisia vulgaris leaf extracts on oxda tively stressed precision-cut liver slices, Vol 7,2, international research journal of pharmacy, ISSN 2230 – 8407, pp 55-60 12 Baixiao Zhao, Gerhard Litscher, Jun Li, Lu Wang, Yingxue Cui, Chaxi Huang, Ping Liu (2011), Effects of Moxa (Artemisia vulgaris) Smoke Inhalation on Heart Rate and Its Variability, Chinese Medicine, 2, pp 53-57 13 Gayan S Bamunuarachchi, Wanigasekara D Ratnasooriya, Sirimal Premakumara &Preethi V Udagama1 (2013), Antimalarial properties of Artemisia vulgaris L ethanolic leaf extract in a Plasmodium berghei murine malaria model, J Vector Borne Dis 50, pp 278–284 14 Gayan S Bamunuarachchi, Wanigasekara D Ratnasooriya, Sirimal Premakumara & Preethi V Udagama1 (2014), Artemisia vulgaris L ethanolic leaf extract reverses thrombocytopenia/ thrombocytosis and averts end-stage disease of experimental severe Plasmodium berghei murine malaria, J Vector Borne Dis 51, pp 286–293 15 I.Burzo, V.Ciocalan, Elena Delian, Aurelia Dobrescu, Liliana, Bawdulescu (2008), researches regarding the essential oil composition of some Artemisia L species, University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine Bucharest, Romania, Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al I Cuza” Iaşi, Tomul LIV, fasc 2, s.II a Biologie vegetală, pp.86-91 16 K Abedulla Khan (2015) “A preclinical antihyperlipidemic evaluation of Artemisia vulgaris root in diet induced hyperlipidemic animal model” International Journal of Pharmacological Research, ISSN: 2277-3312, Vol 5, Isue 4, p-110-114 17 Nguyen HT, Nguyen HT, Islam MZ, Obi T, Pothinuch P, Zar PP, Hou de X, Van Nguyen T, Nguyen TM, Van Dao C, Shiraishi M, Miyamoto A (2016), Pharmacological characteristics of Artemisia vulgaris L in isolated porcine basilar artery, J Ethnopharmacol, Apr 22;182:16-26 18 Pandey PB, Thapa R, Upreti A (2017) “Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of essential oil and methanol extract of Artemisia vulgaris and Gaultheria fragrantissima collected from Nepal” Asian Pac J Tropmed,p 952-959 19 Rahaman M S., AJM Moynul Hasan, M Y Ali and M U Ali (2006), “A Flavone from the Leaves of Cassia Alata”, Bangladesh J Sci Ind Res., 41(1-2), 93-96 20 Sang- Jun Lee, Ha- Yull Chung, In- Kyung Lee, Ick- Dong Yoo (1999), Isolation and identification of flavonoids from ethanol extracts of Artemisia vulgaris and their antioxidant activity, Korea J Food Sci Technolol 31: 815-822 21 Shamilak and Padma P.R (2013), Anticancer activity of Artemisia vulgaris on hepatacellular carcinoma cells, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, ISSN-0975-1491 ,Vol 5, Suppl 22 Syed AA Rizvi, Ayman M SalehEmail author, Ahmad Aljada, Amre Nasr, Ahmed S Alaskar and Jack D Williams, In vitro cytotoxicity of Artemisia vulgaris L essential oil is mediated by a mitochondria-dependent apoptosis in HL-60 leukemic cell line, BMC Complementary and Alternative Medicine, The official journal of the International Society for Complementary Medicine Research (ISCMR), Published: July 2014 PHỤ LỤC Hì nh S1: Ph ổ 13 C N M R củ a Hình S2: Phổ HSQC chất H1 Hình S3: Phổ HMBC chat H1 ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TỐNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA L I NGẢI CỨU (ARTEMISIA VULGARIS L. ) Ở THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN Hóa hữu Mã số: 44 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA... trình nghiên cứu l i Do chúng tơi l a chọn đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học loài Ngải cứu (Artemisia vulgaris L. ) Thành phố Thái Nguyên Kết đề tài đóng góp thêm hiểu biết tính chất, thành phần. .. HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học l i Ngải cứu (Artemisia vulgaris L. ) Thành phố Thái Ngun” cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu,