BỘ Y TẾ - KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU GHÉP TẾ BÀO GAN PHÔI THAI NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ BỆNH GAN CHUYỂN HÓA DI TRUYỀN Ở TRẺ EM CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: GS.TS.NGUYỄN THANH LIÊM 8729 Hà Nội - 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tiềm ứng dụng 1.2 Tế bào gan phôi thai người 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Nguồn gốc đặc điểm 1.2.3 Tiềm ứng dụng 10 1.3 Các nghiên cứu nước ghép tế bào gan 11 1.3.1 Nghiên cứu nước 11 1.3.2 Nghiên cứu Việt Nam 12 CHƯƠNG II: ĐÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phân lập tế bào gan phôi thai người 13 2.2.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 14 2.2.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang 14 2.2.4 Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro 15 2.2.5 Ghép tế bào mơ hình chuột thí nghiệm 15 2.2.6 Mô tế bào học 16 2.2.7 Thu thập phân tích số liệu 16 2.3 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 16 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 17 3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 17 3.1.2 Quy trình xử lý phân lập tế bào gan phôi thai người 17 3.1.3 Quy trình ni cấy tế bào gan thai người 19 3.1.4 Quy trình phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang 20 3.1.5 Quy trình đánh dấu tế bào gan invitro HOECHST 21 3.1.6 Quy trình ghép tế bào mơ hình chuột thí nghiệm 22 3.1.7 Quy trình phân tích mơ tế bào học 24 3.1.8 Thu thập phân tích số liệu 24 3.2 Kết phân lập tế bào gan phôi thai người 25 3.3 Kết nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 25 3.4 Kết hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào 27 3.5 Kết đánh dấu tế bào invitro HOECHST 28 3.6 Ghép tế bào gan vào mơ hình chuột thí nghiệm 29 3.7 Phân tích mơ bệnh học 32 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 34 4.1 Phân lập tế bào gan phôi thai người 34 4.2 Nuôi cấy tế bào gan phôi thai người 34 4.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào 35 4.4 Kết đánh dấu tế bào invitro HOECHST 36 4.5 Ghép tế bào gan mơ hình chuột thí nghiệm 37 4.6 Phân tích mơ bệnh học 39 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 41 DANH MỤC MỘT SỐ THUẬT NGỮ, VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt Viết tắt Stem cells Tế bào gốc Embryonic stem cells Tế bào gốc phôi ES Adult stem cells Tế bào gốc trưởng thành AS Pluripotent Tế bào gốc vạn tiềm Multipotent Tế bào gốc đa tiềm Hepatoblast Tế bào gan phôi thai HHF người Cord blood stem cells Tế bào gốc tạo máu Cytokeratine CK Fetal Bovine Serum Huyết bào thai bê Hepatocyte Tế bào gan Cholangiocyte Tế bào đường mật Epithelial stem cells Tế bào gốc biểu mô ECs Meschymal stem cells Tế bào gốc trung mô MCs Institut national de la sante and de Viện nghiên cứu quốc la recherche medicale FBS INSERM gia sức khỏe y tế Sinh học phân tử SHPT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG ĐỀ TÀI STT Tên hình vẽ Trang Hình 1.1 Tế bào gốc Hình 1.2 Phân loại tế bào gốc Hình 1.3 Q trình biệt hóa tế bào gan phơi thai người 10 Hình 1.4 Hình ảnh xoang tĩnh mạch qua kính viển vi điện tử 11 Hình 3.1 Tế bào gan thai người ngày thứ sau ni cấy 26 Hình 3.2 Tế bào gan thai người ngày thứ thứ sau ni 27 cấy Hình 3.3 Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào với marker 28 Hình 3.4 Đánh dấu tế bào gan thai người HOECHST 29 Hình 3.5 Bộc lộ vùng gan tĩnh mạch cửa cắt gan thùy 31 phải Hình 3.6 Ghép tế bào gan vào tĩnh mạch cửa 31 Hình 3.7 Các tế bào gan sau ghép mắc lại khoảng cửa 32 Hình 3.8 Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mơ gan chuột 32 trưởng thành Hình 3.9 Các tế bào gan xâm nhập vào nhu mô gan chuột sơ 33 sinh Hình 4.1 Đường tế bào gan sau bơm vào tĩnh mạch cửa 37 MỞ ĐẦU Tế bào gốc nhóm tế bào có khả vơ hạn việc tự thay mới, biệt hoá thành nhiều loại tế bào mô, quan khác thể Vì thế, tế bào gốc xem nguồn tế bào tiềm dùng để khơi phục tái tạo lại tổn thương mô quan Để đạt mục đích này, tế bào gốc cần biệt hoá invitro và/hoặc invivo thành các tế bào mô quan cần tái tạo Gan quan lớn mang nhiều chức thể, đặc biệt chức chuyển hoá giải độc, nên gan quan dễ bị tổn thương nhiều nguyên nhân bẩm sinh mắc phải dẫn đến rối loạn chuyển hoá gan Đây trạng thái bệnh lý không điều trị nhanh chóng dẫn đến tử vong Hiện ghép gan phương pháp điều trị hiệu cho tổn thương gan trầm trọng Tuy nhiên biện pháp gặp nhiều khó khăn kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao đặc biệt hạn chế số lượng người cho gan Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan cấy ghép để chúng tái tạo lại gan tổn thương xem hướng điều trị đầy triển vọng Có nhiều nguồn tế bào gốc sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan, nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc để biệt hoá thách thức với nhà nghiên cứu Bên cạnh sử dụng tế bào biệt hóa từ tế bào gốc để cấy ghép khác gen lồi tính sinh miễn dịch tế bào ghép yếu tố quan trọng định phản ứng thải ghép hay thành công ghép Trong bối cảnh đó, tế bào gan phôi thai người xuất ý tưởng lĩnh vực ghép tế bào gốc, trở thành nguồn cho hứa hẹn với nhiều ưu hình thái, độ biệt hóa tính sinh miễn dịch Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị số bệnh gan chuyển hóa di truyền trẻ em", tiến hành với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình nghiên cứu Phân lập nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người phản ứng miễn dịch tế bào Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người chuột nhắt trắng CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc: 1.1.1 Định nghĩa: Tế bào gốc (stem cells) nhóm tế bào có khả vơ hạn việc tự làm mới, biệt hoá thành nhiều loại tế bào mô, tổ chức khác thể [1] Tế bào gốc có mặt tất giai đoạn phát triển thể, từ giai đoạn phôi, thai, có máu dây rốn, có nhiều loại mơ quan khác thể trưởng thành, nơi tế bào trì dạng chưa biệt hoá suốt đời thể [2] Hình 1.1 Tế bào gốc (Nguồn từ 2001 Teresese Windown Lydia Kibluk) 1.1.2 Phân loại: Có nhiều cách phân loại tế bào gốc Dựa vào nguồn gốc, tế bào gốc chia làm hai nhóm : tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells) Tế bào gốc phôi tế bào giai đoạn phôi hình thành từ 5-7 ngày tuổi sau thụ tinh Đây tế bào gốc vạn tiềm (Totipotent), có khả biệt hố thành tất hầu hết loại tế bào khác thể [3] Tế bào gốc trưởng thành tê bào nhiều loại mô quan thể từ sau sinh đến lúc trưởng thành Đây tế bào gốc vạn tiềm đa tiềm (Multipotent), có khả biệt hố thành số loại tế bào khác thể, tế bào gốc tạo máu tuỷ xương [4] Ngồi ra, có tế bào gốc phân lập từ mô tổ chức giai đoạn thai Những tế bào tế bào gốc vạn tiềm tế bào gốc đa tiềm năng, tế bào gốc gan thai nhi (Hepatoblast), tế bào gốc máu dây rốn (Cord Blood Stem cells) [5] Hình 1.2 Phân loại tế bào gốc (Nguồn từ http://stemcells.nih.gov/StemCells) 1.1.3 Tiềm ứng dụng: Tế bào gốc xem nguồn tế bào tiềm sử dụng việc khơi phục tái tạo lại tổn thương mô quan số bệnh lý mạn tính nan y Với mục đích này, tế bào gốc sử dụng để biệt hoá invitro invivo thành các tế bào mô quan đặc hiệu Các nghiên cứu tế bào gốc tập trung chủ yếu vào việc tìm hiểu làm rõ vai trò tế bào gốc, đặc biệt xây dựng mơ hình biệt hố tế bào gốc invitro invivo thành loại tế bào khác thể như: tế bào da, xương, máu, gan, tuỵ… Trong bối cảnh đó, nghiên cứu biệt hố tế bào gốc thành tế bào gan hướng nghiên cứu quan tâm mang nhiều triển vọng Gan quan lớn mang nhiều chức thể, đặc biệt chức chuyển hố Có nhiều bệnh lý bẩm sinh mắc phải gây nên tình trạng suy tế bào gan, rối loạn chuyển hố gan, khơng điều trị nhanh chóng dẫn đến tử vong Những phương pháp điều trị cắt bỏ gan đến khơng áp dụng lại tế bào có khả đảm nhiệm chức bình thường gan Ghép gan phương pháp điều trị hiệu cho tổn thương gan trầm trọng Theo nghiên cứu thực trạng ghép gan Mỹ năm 2003, năm 1997 có khoảng 500 trường hợp tiến hành ghép gan, đến năm 2002 số dừng lại khoảng 550 trường hợp Trong đó, số trường hợp danh sách chờ ghép gan tăng nhanh từ khoảng 400 năm 1997 lên 700 năm 2002, số trường hợp đăng ký ghép gan tăng từ khoảng 1200 đến 1700 trường hợp Do với số lượng người cho gan ngày hạn chế, kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao, nên phương pháp điều trị khác cần tiếp tục nghiên cứu Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan (hepatocytes like cells) xem hướng điều trị đầy triển vọng Có nhiều nguồn tế bào gốc sử dụng để biệt hoá thành tế bào gan (hepatocyte-like cell), nhiên, lựa chọn nguồn tế bào gốc để biệt hoá thách thức với nhà nghiên cứu Tế bào gốc phôi (ES) lần phân lập từ phôi thai chuột [6] Tế bào gốc phôi mang nhiều đặc điểm ưu việt tế bào gốc, nghiên cứu sử dụng nghiên cứu ghép tế bào gan để thử nghiệm kỹ thuật ghép sau đựoc tiến hành cắt gan 40% thùy phải Nhóm thử nghiệm khơng thành cơng, khơng có chuột sống sau ghép tế bào Nguyên nhân liên quan đến liều gây mê kỹ thuật cắt gan Nhóm thứ hai với cải tiến kỹ thuật cắt gan mối Vicryl cho kết khả quan nhóm Có chuột sống sau ghép Cả hai chuột phát thấy có tế bào ghép nhu mơ gan phân tích mơ bệnh học Chúng tơi nhận thấy tỷ lệ sống sau ghép nhóm chuột sơ sinh (74%) cao nhóm chuột trưởng thành (20%) Lý nhóm chuột trưởng thành phải trải qua phẫu thuật cắt gan, bơm tế bào trực tiếp tĩnh mạch cửa Quá trình gây sang chấn lớn cho chuột Chuột tử vong chảy máu, tắc mạch, nhiễm trùng Trong đó, chuột sơ sinh cần tiêm tế bào qua da vào vùng lách, nên không ảnh hưởng nhiều đến sức sống Tuy nhiên, tỷ lệ phát tế bào ghép nhu mô gan chuột trưởng thành (100%) cao so với chuột sơ sinh (40%) nhóm sống sau ghép Do chuột trưởng thành, tế bào bơm trực tiếp vào tĩnh mạch cửa, nhóm chuột sơ sinh, tế bào đưa qua đường lách tiêm qua da Tại thời kỳ này, lách quan nhìn thấy qua da chuột, để chắn tế bào bơm vào lách không bị tiêm vào ổ bụng kỹ thuật phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm thực Với kết trên, nhận thấy thực nghiệm ban đầu, với số mẫu nhỏ thời gian ni chuột sau ghép ngắn, vòng ngày Vì ghép dị lồi, lấy tế bào gan người ghép vào thể chuột, nên sau ngày thường xảy phản ứng thải ghép Các tế bào ghép bị hệ miễn dịch chuột phá hủy, chuột tử vong hậu phản ứng thải ghép cấp Do vậy, kết nghiên cứu có ý nghĩa kỹ thuật ghép ban đầu mơ hình khả thi, sở để tiến hành 38 nghiên cứu xa Trên giới, thử nghiệm ghép dị loài thường thực mơ hình động vật gây suy giảm miễn dịch, nuôi môi trường đặc biệt Các thử nghiệm mơ hình theo dõi khoảng thời gian dài tùy vào điều kiện nuôi dưỡng đặc điểm vật nuôi Tuy nhiên Việt nam chưa có điều kiện thực thí nghiệm loại mơ hình nên khn khổ nghiên cứu này, đưa kết theo dõi ngắn hạn mơ hình chuột nhắt thường 4.6 Phân tích mơ bệnh học: Qua phân tích mơ bệnh học, chúng tơi ước tính số tế bào ghép phát nhu mô gan chuột trưởng thành chiếm 3.7%, chuột sơ sinh chiếm 7.5% Điều phản ảnh hiệu ghép hai mô hình chuột khác nhau, cao nhóm chuột sơ sinh Tuy nhiên hai mơ hình chuột này, số lượng tế bào mắc lại khoảng cửa nhiều (Hình 8) Các tế bào không xâm nhập vào nhu mô gan để nhân lên thay tế bào nhu mô gan thể nhận, chết sau vài ngày sau ghép Mặc dù kích thước tế bào gan phơi thai người (15µ) nhỏ kích thước tế bào gan người trưởng thành (30µm) Một số yếu tố ảnh hưởng đến số đánh giá hiệu ghép như: kỹ thuật ghép đơn giản hay phức tạp, tỷ lệ sống sau ghép, tỷ lệ phát tế bào ghép nhu mơ gan Tuy nhiên, có số lợi mơ hình chuột sơ sinh so với chuột trưởng thành như: - Cơ thể chuột sơ sinh nhỏ hơn, đạt hiệu ghép tốt với lượng tế bào đưa vào với thể tích hơn, tránh biến chứng liên quan đến tắc mạch Hơn nữa, tránh tình trạng thiếu tế bào ghép so với trọng lượng thể nhận - Về lý thuyết, hệ miễn dịch chuột sơ sinh chưa trưởng thành đầy đủ, phản ứng thải ghép chuột sơ sinh yếu chuột trưởng thành 39 Do vậy, với nghiên cứu nhận thấy thực nghiệm ghép tế bào gan mơ hình chuột sơ sinh có hiệu mơ hình chuột trưởng thành 40 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN: Phân lập thành công tế bào gan phôi thai người: 22/62 (35%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi bà mẹ tự nguyện đình thai nghén từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội phân lập 15/15 (100%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi bà mẹ tự nguyện đình thai nghén từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre Paris phân lập Nuôi cấy thành công tế bào gan phôi thai người môi trường invitro Phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào: Hợp tế bào thu không đồng nhất, bao gồm: tế bào gốc bipotent biểu lúc marker tế bào gan Alpha-1-antitrypsine, C-met, marker tế bào đường mật CK 19 Ngồi có tế bào thể marker tế bào đường mật CK Ghép tế bào thành công mơ hình chuột trưởng thành sơ sinh với đặc điểm sau: - Tỷ lệ sống sau ghép nhóm chuột sơ sinh (74%) cao nhóm chuột trưởng thành (20%) - Tỷ lệ phát tế bào ghép nhu mô gan chuột trưởng thành (100%) cao so với chuột sơ sinh (40%) nhóm sống sau ghép - Hiệu ghép chuột sơ sinh (7.5%) cao chuột trưởng thành (3.7%) II KIẾN NGHỊ Sau thực đề tài nghiên cứu này, chúng tơi có số kiến nghị sau: Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh định hướng nghiên cứu khoa học đại Dựa kết nghiên cứu bước đầu tế bào gan phơi thai người, mở nghiên 41 cứu sử dụng nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành tế bào gan, ứng dụng cho điều trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn Ghép tế bào nói chung ghép tế bào gan cách thức điều trị mới, nghiên cứu rộng rãi nước số ưu điểm phương pháp giảm can thiệp phẫu thuật, giải vấn đề người cho, giảm chi phí thực Do vậy, nghiên cứu chuyên sâu lĩnh vực cần thiết tiếp tục triển khai để đưa nghiên cứu quy mơ phòng thí nghiệm đến gần với thử nghiệm lâm sàng, phục vụ cho mục đích điều trị bệnh 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO IJ, F journal hepatology 40, 878 886 (2004) Allen, K J & Soriano, H E Liver cell transplantation: the road to clinical application J Lab Clin Med 138, 298-312 (2001) Rhim, J A., Sandgren, E P., Palmiter, R D & Brinster, R L Complete reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes Proc Natl Acad Sci U S A 92, 4942-6 (1995) Grompe, M., Laconi, E & Shafritz, D A Principles of therapeutic liver repopulation Semin Liver Dis 19, 7-14 (1999) De Vree, J M et al Correction of liver disease by hepatocyte transplantation in a mouse model of progressive familial intrahepatic cholestasis Gastroenterology 119, 1720-30 (2000) Fausto, N & Campbell, J S The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation Mech Dev 120, 117-30 (2003) Roskams, T A., Libbrecht, L & Desmet, V J Progenitor cells in diseased human liver Semin Liver Dis 23, 385-96 (2003) Wagers, A J & Weissman, I L Plasticity of adult stem cells Cell 116, 639-48 (2004) Lagasse, E et al Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo Nat Med 6, 1229-34 (2000) 10 Camargo, F D., Finegold, M & Goodell, M A Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners J Clin Invest 113, 1266-70 (2004) 11 Susick, R et al Hepatic progenitors and strategies for liver cell therapies Ann N Y Acad Sci 944, 398-419 (2001) 12 Zaret, K S Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis Nat Rev Genet 3, 499-512 (2002) 13 Mahieu-Caputo, D et al Repopulation of athymic mouse liver by cryopreserved early human fetal hepatoblasts Hum Gene Ther 15, 1219-28 (2004) 14 Allain, J E et al Immortalization of a primate bipotent epithelial liver stem cell Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3639-44 (2002) 15 Naldini, L et al The tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene is activated by autophosphorylation Mol Cell Biol 11, 1793-803 (1991) 16 Royal, I & Park, M Hepatocyte growth factor-induced scatter of Madin-Darby canine kidney cells requires phosphatidylinositol 3-kinase J Biol Chem 270, 27780-7 (1995) 17 Cantley, L C The phosphoinositide 3-kinase pathway Science 296, 1655-7 (2002) 18 Ponzetto, C et al Specific uncoupling of GRB2 from the Met receptor Differential effects on transformation and motility J Biol Chem 271, 14119-23 (1996) 19 Boccaccio, C et al Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway Nature 391, 285-8 (1998) 20 Amicone, L et al Temporal and tissue-specific expression of the MET ORF driven by the complete transcriptional unit of human A1AT gene in transgenic mice Gene 162, 323-8 (1995) 21 Amicone, L et al Transgenic expression in the liver of truncated Met blocks apoptosis and permits immortalization of hepatocytes Embo J 16, 495-503 (1997) 22 Rodrigues, G A & Park, M Dimerization mediated through a leucine zipper activates the oncogenic potential of the met receptor tyrosine kinase Mol Cell Biol 13, 6711-22 (1993) 23 Peschard, P et al Mutation of the c-Cbl TKB domain binding site on the Met receptor tyrosine kinase converts it into a transforming protein Mol Cell 8, 995-1004 (2001) 24 Nitou, M., Sugiyama, Y., Ishikawa, K & Shiojiri, N Purification of fetal mouse hepatoblasts by magnetic beads coated with monoclonal anti-e-cadherin antibodies and their in vitro culture Exp Cell Res 279, 330-43 (2002) 25 Thomson, J A et al Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science 282, 1145-7 (1998) 26 Zhen, Z et al Structural and functional domains critical for constitutive activation of the HGF-receptor (Met) Oncogene 9, 1691-7 (1994) 27 Jeffers, M., Koochekpour, S., Fiscella, M., Sathyanarayana, B K & Vande Woude, G F Signaling requirements for oncogenic forms of the Met tyrosine kinase receptor Oncogene 17, 2691-700 (1998) 28 Delgado, J P et al Long-term controlled immortalization of a primate hepatic progenitor cell line after Simian virus 40 T-Antigen gene transfer Oncogene 24, 541-51 (2005) 29 Gropp, M et al Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors Mol Ther 7, 281-7 (2003) BÁO CÁO TÓM TẮT I.MỞ ĐẦU Tế bào gốc nhóm tế bào có khả vơ hạn việc tự thay mới, biệt hoá thành nhiều loại tế bào mô, quan khác thể Vì thế, tế bào gốc xem nguồn tế bào tiềm dùng để khơi phục tái tạo lại tổn thương mô quan Gan quan mang nhiều chức thể, quan dễ bị tổn thương nhiều nguyên nhân bẩm sinh mắc phải, không điều trị nhanh chóng dẫn đến tử vong Hiện ghép gan phương pháp điều trị hiệu cho tổn thương gan trầm trọng Tuy nhiên biện pháp gặp nhiều khó khăn kỹ thuật can thiệp phức tạp, tỷ lệ thải ghép cao đặc biệt hạn chế số lượng người cho gan Trong bối cảnh đó, liệu pháp tế bào sử tế bào gốc biệt hoá thành tế bào gan cấy ghép để chúng tái tạo lại gan tổn thương xem hướng điều trị đầy triển vọng Với mục tiêu lựa chọn nguồn tế bào gốc để ứng dụng cho điều trị, tế bào gan phôi thai người xuất ý tưởng lĩnh vực ghép tế bào gốc, trở thành nguồn cho hứa hẹn với nhiều ưu hình thái, độ biệt hóa tính sinh miễn dịch Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị số bệnh gan chuyển hóa di truyền trẻ em", tiến hành với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình nghiên cứu Phân lập nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người phản ứng miễn dịch tế bào Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người chuột nhắt trắng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: 62 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi sản phụ tự nguyện đình thai nghén Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội 15 mẫu thai khoảng 9-13 tuần tuổi sản phụ tự nguyện đình thai nghén Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng kỹ thuật sinh học phân lập nuôi cấy đánh giá đặc điểm tế bào gan phôi thai người invitro invivo: - Phân lập tế bào gan phôi thai người từ mẫu nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào gan phơi thai người - Hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào - Đánh dấu tế bào gan phôi thai người invitro - Ghép tế bào mơ hình chuột nhắt trắng - Mô tế bào học - Phân tích số liệu Các hóa chất trang thiết bị sử dụng: Hóa chất: PBS 1X x 1000 ml khử trùng, HEPES, Collagenase type III (PAA), Môi trường nuôi cấy: DMEM-HAM'S F12 Williams E (Sigma), kháng sinh Penicilline 100Ul/ml, Streptomycine 100µg/ml (Gibco), 2mM Glutamine (Invitrogen), 0.1% Fetal Bovine Serum (Gibco), 10-8M 3-3"-triiodo-L-Thyronine (T3) (Sigma), 10-6M Hydrocortisol (Merk), 10-8M Insuline (Sigma), 0.24% acid linoleic (Sigma), 1mg/ml apo-transferin (Sigma) 100µg/ml Vitamin C , Triton 0.1%, Paraformaldehyde 4%, Kháng thể kháng albumin, kháng α1-antitrypsin, kháng CK-19, kháng CK-18, kháng CK-17, kháng CK8/18, kháng E-Cadherin Trang thiết bị: Khu vực xử lý mẫu sạch, Tủ an toàn sinh học bậc II, Khay thủy tinh vô trùng, Dao mổ, panh gắp kéo vô trùng, Tube Corning vô trùng, Máy khuấy từ có gia nhiệt, Con khuấy từ, Cóng Scott 100 ml vơ trùng, Màng lọc 70µm vơ trùng dùng lần, Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml,25ml, Máy ly tâm góc văng, Tủ an tồn sinh học bậc 2, Đĩa ni cấy 35mm (Corning), Pipet aid, pipet thủy tinh 5ml,10ml, 25ml, Tủ ấm 370C CO2 5% III DANH MỤC KẾT QUẢ 3.2 Kết phân lập tế bào gan phôi thai người: Trong số 62 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội phục vụ cho thử nghiệm phòng thí nghiệm, có: - 22 mẫu có đủ điều kiện đưa vào xử lý, phân lập gan từ tổ chức thai, thu tế bào gan - 15 mẫu sau thu thập mảnh gan từ tổ chức thai, không đủ điều kiện để tiến hành phân lập, số lượng tế bào mẫu bị nhiễm trùng - 25 mẫu lại khơng thu thập mảnh gan từ tổ chức thai Trong số 15 mẫu thu thập từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre, Paris, tất mẫu đủ điều kiện đưa vào xử lý phân lập tế bào gan 3.3 Kết nuôi cấy tế bào gan phôi thai người: 32 mẫu sau xử lý phân lập collagenase để thu tế bào gan theo quy trình chuẩn Các tế bào ni cấy môi trường cho tế bào gan, nhiên quan sát thấy số lượng tế bào phân chia hạn chế Các tế bào sau phân lập đưa vào nuôi cấy Chúng tiến hành nuôi cấy tế bào phân lập ngày 3.4 Kết hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào: Chúng tơi tiến hành phân tích số marker đặc hiệu tế bào thu thập sau nuôi cấy ngày thứ Chúng quan sát thấy số lượng lớn tế bào tế bào gốc (bipotentes), biểu lúc marker bào gan Alpha-1-antitrypsin C-met marker đường mật CK19 Tuy nhiên, thấy có tỷ lệ định tế bào biểu marker tế bào đường mật CK7 không biểu marker tế bào gan Điều chứng tỏ rằng, tế bào thu hỗn hợp tế bào không đồng nhất, chúng bao gồm tế bào gốc bipotent chưa biệt hóa, tế bào gan tế bào đường mật biệt hóa trưởng thành 3.5 Kết đánh dấu tế bào invitro HOECHST: HOECHST chất đánh dấu nhân huỳnh quang phổ biến nghiên cứu thực nghiệm động vật, với mục đích theo dõi tế bào sau ghép vào thể sống, có ưu điểm: kỹ thuật đơn giản, tỷ lệ đánh dấu tế bào tổng số tế bào cao, dễ phát phân tích 100% tế bào đánh dấu nhân HOECHST phân tích kính hiển vi huỳnh quang 3.6 Ghép tế bào gan vào mơ hình chuột thí nghiệm Chuột trưởng thành: chuột nhắt trưởng thành khoảng tuần tuổi tiến hành nghiên cứu ghép tế bào gan sau cắt gan 40% Chúng tiến hành dùng Vicryl 0.6 khâu cố định thắt vị trí thùy phải, sau cắt 40% thùy phải, tránh làm tổn thương vùng cuống gan Kết sau: chuột chết sau ghép chuột chết vào ngày thứ hai sau ghép không rõ nguyên nhân chuột lại sống sau ghép Chuột sơ sinh: chuột sơ sinh 5-7 ngày tuổi thực ghép tế bào gan qua đường lách Do chuột sơ sinh non kích thước nhỏ, khơng thực phẫu thuật cắt gan ghép qua đường tĩnh mạch cửa, nên tế bào đưa vào lách chuột sơ sinh micro sering Hamilton 10µl trực tiếp qua da Trong nhóm chuột có chuột sống sau ghép Trong chuột sống chúng tơi phát có chuột có tín hiệu tế bào gan nhu mơ gan phân tích mơ bệnh học So sánh hai mơ hình chuột thí nghiệm: - Tỷ lệ sống sau ghép nhóm chuột sơ sinh (74%) cao nhóm chuột trưởng thành (20%) - Tỷ lệ phát tế bào ghép nhu mô gan chuột trưởng thành (100%) cao so với chuột sơ sinh (40%) nhóm sống sau ghép 3.7 Phân tích mơ bệnh học: Hai chuột trường thành chuột sơ sinh sống sau ghép ngày lấy gan để phân tích Mảnh gan sau cắt làm đông lạnh cắt lạnh Trên hai mẫu gan chuột trưởng thành 3/5 chuột sơ sinh có phát tế bào ghép kính hiển vi huỳnh quang Nhiều tế bào sau ghép mắc lại khoảng cửa gan, không xâm nhập vào nhu mô gan Tuy nhiên nhiều lát cắt phát thấy nhiều cụm tế bào xâm nhập vào nhu mô gan Trong nghiên cứu chúng tôi, chuột trưởng thành, phần trăm số tế bào gan ghép có nhu mô gan chuột 3.7%, chuột sơ sinh 7.5% IV.KẾT LUẬN Phân lập thành công tế bào gan phôi thai người: 22/62 (35%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi bà mẹ tự nguyện đình thai nghén từ Bệnh Viện Phụ Sản Hà nội phân lập 15/15 (100%) mẫu thai từ 9-13 tuần tuổi bà mẹ tự nguyện đình thai nghén từ Bệnh Viện Kremlin Bicetre Paris phân lập Nuôi cấy thành công tế bào gan phôi thai người mơi trường invitro Phản ứng hóa miễn dịch huỳnh quang tế bào: Hợp tế bào thu không đồng nhất, bao gồm: tế bào gốc bipotent biểu lúc marker tế bào gan Alpha-1-antitrypsine, C-met, marker tế bào đường mật CK 19 Ngồi có tế bào thể marker tế bào đường mật CK Ghép tế bào thành cơng mơ hình chuột trưởng thành sơ sinh với đặc điểm sau: - Tỷ lệ sống sau ghép nhóm chuột sơ sinh (74%) cao nhóm chuột trưởng thành (20%) - Tỷ lệ phát tế bào ghép nhu mô gan chuột trưởng thành (100%) cao so với chuột sơ sinh (40%) nhóm sống sau ghép - Hiệu ghép chuột sơ sinh (7.5%) cao chuột trưởng thành (3.7%) V KIẾN NGHỊ: Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh định hướng nghiên cứu khoa học đại Dựa kết nghiên cứu bước đầu tế bào gan phơi thai người, mở nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào gốc khác với mục đích biệt hóa thành tế bào gan, ứng dụng cho điều trị như: tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc dây rốn Ghép tế bào nói chung ghép tế bào gan cách thức điều trị mới, nghiên cứu rộng rãi nước số ưu điểm phương pháp giảm can thiệp phẫu thuật, giải vấn đề người cho, giảm chi phí thực Do vậy, nghiên cứu chuyên sâu lĩnh vực cần thiết tiếp tục triển khai để đưa nghiên cứu quy mơ phòng thí nghiệm đến gần với thử nghiệm lâm sàng, phục vụ cho mục đích điều trị bệnh ... hiệu tế bào biểu mô E-Cadherine Xét khả ứng dụng ghép tế bào để điều trị số bệnh gan, tế bào gan phôi thai người có nhiều ưu điểm so với tế bào gan trưởng thành [12]: - Tế bào gan phơi thai có... hình thái, độ biệt hóa tính sinh miễn dịch Xuất phát từ thực tiễn này, đề tài " Nghiên cứu ghép tế bào gan phôi thai người để điều trị số bệnh gan chuyển hóa di truyền trẻ em" , tiến hành với... trình nghiên cứu Phân lập nuôi cấy invitro tế bào gan phôi thai người Xác định tế bào gốc định hướng dòng gan người phản ứng miễn dịch tế bào Tiến hành thử nghiệm ghép tế bào gan phôi thai người