BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHÍ THỊ THANH MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ XYLOSE, CELLOBIOSE VÀ DỊCH THỦY PHÂN RƠM RẠ BỞI MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHÍ THỊ THANH MAI NGHIÊN CỨU LÊN MEN AXIT LACTIC TỪ XYLOSE, CELLOBIOSE VÀ DỊCH THỦY PHÂN RƠM RẠ BỞI MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 62540101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TẬP THỂ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Trần Liên Hà PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng HÀ NỘI - 2017 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học PGS TS Trần Liên Hà PGS TS Nguyễn Thanh Hằng Phản biện 1: PGS.TS Lê Mai Hương Phản biện 2: GS TS Nguyễn Thị Hiền Phản biện 3: PGS TS Bùi Phương Thuận Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi 30 phút, ngày 02 tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng (2014), Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sản xuất axit lactic từ cellobiose, Hội thảo nghiên cứu phát triển sản phẩm tự nhiên lần thứ IV, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, tr 203 208 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Nguyễn Thị Thùy (2015), Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men sản xuất axit lactic từ xyloza, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, số 10, tr 91 - 94 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố đến trình lên men axit lactic chủng Lactobacillus fermentum Y6 từ xylose, Tạp chí khoa học cơng nghệ, Viện hàn lâm khoa hoc công nghệ Việt Nam, Tập 53, số 4B, tr 282 -289 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Trương Thành Luân (2016), Nghiên cứu điều kiện lên men axit lactic Lactobacillus plantarum HC2 Lactobacillus fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, số 291, tr 83 - 89 Phí Thị Thanh Mai, Trần Liên Hà, Nguyễn Thanh Hằng, Thạch Thị Quyên (2016), Tối ưu hóa q trình lên men axit lactic từ cellobiose chủng Lactobacillus plantarum HC2, Tạp chí khoa học công nghệ, số 114, tr 118 - 125 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực cơng trình nghiên cứu nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình thầy cô, bạn đồng nghiệp quan Trước hết cho gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Trần Liên Hà, PGS TS Nguyễn Thanh Hằng thuộc Bộ mơn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn định hướng cho tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ góp ý cho tơi nhiều trình học tập nghiên cứu Nhân dịp cho gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Học viện Hậu cần, đoàn 871 bạn bè đồng nghiệp, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ chủ tịch hội đồng, phản biện, thư ký ủy viên hội đồng dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp tơi hồn thiện tốt nội dung nghiên cứu luận án Tơi vơ cảm ơn khích lệ, động viên giúp đỡ nhiệt tình gia đình, bè bạn dành cho tơi để tơi hồn thành luận án nghiên cứu Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2017 Phí Thị Thanh Mai i LỜI CAM ĐOAN Là người tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài trình bày luận án này, xin cam đoan số liệu kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2017 GVHD1 PGS.TS Trần Liên Hà GVHD2 NCS PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng Phí Thị Thanh Mai ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ixx DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Axit lactic 1.1.1 Đặc tính hóa học axit lactic 1.1.2 Ứng dụng axit lactic 1.1.3 Các phương pháp sản xuất axit lactic 1.1.3.1 Tổng hợp axit lactic đường hóa học 1.1.3.2 Sản xuất axit lactic phương pháp lên men 1.2 Lignocellulose 1.2.1 Thành phần hóa học lignocellulose 1.2.1.1 Cellulose 1.2.1.2 Hemicellulose 10 1.2.1.3 Lignin 11 1.2.2 Rơm rạ 12 1.3 Lên men axit lactic từ rơm rạ 13 1.3.1 Quá trình tiền xử lý 13 1.3.1.1 Tiền xử lý rơm rạ axit hữu 15 1.3.1.2 Tiền xử lý rơm rạ kiềm 15 1.3.2 Quá trình thủy phân 15 1.3.3 Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ vi khuẩn lactic 17 1.3.3.1 Nguồn chất 18 1.3.3.2 Chủng giống vi sinh vật 23 1.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả lên men axit lactic 29 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose dịch thủy phân rơm rạ giới Việt Nam 34 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 iii 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 38 2.1.1 Vật liệu 38 2.1.2 Môi trường 38 2.1.3 Hóa chất enzyme 39 2.1.4 Thiết bị 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phương pháp vi sinh sinh học phân tử 40 2.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn sinh axit lactic từ đường xylose cellobiose 40 2.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh axit lactic 41 2.2.1.3 Quan sát đặc điểm hình thái, sinh lí sinh hóa chủng vi khuẩn chọn 41 2.2.1.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh học phân tử 42 2.2.1.5 Kiểm tra khả đối kháng chủng vi khuẩn Y6 HC2 42 2.2.2 Phương pháp lên men 42 2.2.3 Phương pháp hóa lí - sinh 43 2.2.3.1 Định lượng đường khử DNS 43 2.2.3.2 Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner 43 2.2.3.3 Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) 43 2.2.3.4 Phương pháp tiền xử lý rơm rạ kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín 44 2.2.3.5 Phương pháp thủy phân rơm rạ hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 Cellic® Htec2 44 2.2.3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men axit lactic chủng vi khuẩn lựa chọn 45 2.2.3.7 Ảnh hưởng trì pH trình lên men 47 2.2.3.8 Xác định dạng D, L axit lactic dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ 48 2.2.4 Phương pháp toán học 49 2.2.4.1 Tối ưu hóa q trình lên men axit lactic từ xylose chủng L fermentum Y6 từ cellobiose chủng L plantarum HC2 49 2.2.4.2 Phương pháp thống kê 52 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Lên men axit lactic từ xylose 53 iv 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn định tên chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường xylose 53 3.1.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường xylose 54 3.1.1.3 Định tên chủng vi khuẩn Y6 59 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 61 3.1.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 61 3.1.2.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 62 3.1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 63 3.1.2.4 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 64 3.1.3 Tối ưu điều kiện lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 65 3.1.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc trì pH ban đầu điều kiện tối ưu 68 3.1.4.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 69 3.1.4.2 Ảnh hưởng trì pH đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 70 3.2 Lên men axit lactic từ cellobiose 73 3.2.1 Phân lập, tuyển chọn định tên chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ đường cellobiose 73 3.2.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ cellobiose 74 3.2.1.3 Định tên chủng vi khuẩn HC2 77 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường tỉ lệ cấp giống đến khả lên men axit lactic chủng L plantarum HC2 từ đường cellobiose 80 v 3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 80 3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu đến khả lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 81 3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường đến khả lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 82 3.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 82 3.2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả lên men axit lactic chủng L plantarum HC2 83 3.2.3 Tối ưu hóa q trình lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 84 3.2.4 Ảnh hưởng trì pH đến trình lên men axit lactic từ cellobiose chủng L plantarum HC2 87 3.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ 90 3.3.1 Tiền xử lý rơm rạ kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý hỗn hợp enzyme Ctec2 Htec2 90 3.3.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng đơn hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 91 3.3.2.1 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L plantarum HC2 92 3.3.2.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L fermentum Y6 93 3.3.2.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 93 3.3.3 Nghiên cứu động học trình lên men axit lactic hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 từ dịch thủy phân rơm rạ 101 3.3.4 Xác định dạng D, L axit lactic 102 3.3.4.1 Thu hồi tinh axit lactic từ dịch lên men thu từ trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2 102 3.3.4.2 Phân tích sản phẩm axit lactic sắc kí lỏng cao áp HPLC 102 3.3.4.3 Phân tích so sánh xác định thành phần D, L lactic độ quay phân cực axit lactic 103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105 vi 96 Roberto I., Mussatto S., Mancilha I., Fernandes M (2007) The effects of pH and nutrient supplementation of brewer’s spent grain cellulosic hydrolysate for lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii Journal of Biotechnology 131, pp 181 -82 97 Roberto I.C., Mussatto S.I., Rodrigues R.C.L.B (2003) Dilute-acid hydrolysis for optimization of xylose recovery from rice straw in a semi-pilot reactor Industrial Crops and Products 17(3), pp 171 - 176 98 Roland J.S., Johan ET van Hylckama V (2011) Genomic diversity and versatility of Lactobacillus plantarum, a natural metabolic engineer Microbial Cell Factories 10, pp 1- 13 99 Romero- Garcia S., Hernández-Bustos C., Merino E., Gosset G., Martinez A (2009) Homolactic fermentation from glucose and cellobiose using Bacillus subtilis Microbial Cell Factories 8(23), pp - 100 Runcang S., J.Mark L., Banks W.B (1995) Influence of alkaline pretreatments on the cell wall components of wheat straw Industrial Crops and Products 4(2), pp 127 - 145 101 Sara B.C (2004) Lignocellulose biodegradation and applications in biotechnology ACS Symposium Series 889, pp - 34 102 Shahzadi T., Mehmood S., Irshad M., Anwar Z., Afroz A., Zeeshan N., Rashid U., Sughra K (2014) Advances in lignocellulosic biotechnology: A brief review on lignocellulosic biomass and cellulases Advances in Bioscience and Biotechnology 5(3), pp 246-251 103 Sheeladevi A., Ramanathan N (2011) Lactic acid production using lactic aid bacteria under optimized conditions International Journal of pharmaceutical and Biological archives 2(6), pp 1686 - 1691 104 Sheldon J B D., William D M (1996) Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol A review Bioresource Technology 55, pp 1-33 105 Shinkawa S., Okano K., Yoshida S., Tanaka T., Ogino C., Fukuda H., Kondo A (2011) Improved homo L-lactic acid fermentation from xylose by abolishment of the phosphoketolase pathway and enhancement of the pentose phosphate pathway in genetically modified xylose-assimilating Lactococcus lactis Applied Microbiology and Biotechnology 91, pp 1537 - 1544 106 Shuler M.L., Kargi F (1992) Bioprocess Engineering basic Concept New Jersey Prentice Hall Englewood Cliffs 117 107 Singhvi M., Joshi D., Adsul M., Varma A., Gokhale D (2010) D -Lactic acid production from cellobiose and cellulose by Lactobacillus lactis mutant RM2-24 Green Chemistry 12, pp 1106 -1109 108 Smerilli M., Neureiter M., Wurz S., Haas C., Frühauf S., Fuchs W (2015) Direct fermentation of potato starch and potato residues to lactic acid by Geobacillus stearothermophilus under non-sterile conditions Chemical Technology and Biotechnology 90(4), pp 648-657 109 Stanbury P.F., Whitaker A., Hall S.J (1995) Principles of fermentation technology, 2, Butterworth - Heinemann: Oxford Press 110 Sun J., Tian C., Diamond S., Glass N.L (2012) Deciphering transcriptional regulatory mechanisms associated with hemicellulose degradation in Neurospora crassa Eukaryotic Cell 11(4), pp 482-493 111 Taherzadeh M.J., Karimi K (2008) Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review International Journal of Molecular Sciences 9(9), pp 1621 - 1651 112 Tanaka K., Komiyama A., Sonomoto K., Ishizaki A., Hall S.J., Stanbury P.F (2002) Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1 Applied microbiology and Biotechnology 60(1 -2), pp 160 -167 113 Taniguchi M., Hoshina M., Tanabe S., Higuchi Y., Sakai K., Ohtsubo S., Hoshino K., Tanaka T (2005) Production of l-lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation using unsterilized defatted rice bran as a carbon source and nutrient component Food Science and Technology Research 11(4), pp 400 - 406 114 Taniguchi M., Tokunaga T., Horiuchi K., Hoshino K., Sakai K., Tanaka T (2004) Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria Applied Microbiology and Biotechnology 66(2), pp 160 165 115 Tashiro Y., Kaneko W., Sun Y., Shibata K., Inokuma K., Zendo T., Sonomoto K (2011) Continuous D - lactic acid production by a novel thermotolerant Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis QU41 Applied Microbiology and Biotechnology 89, pp 1741 - 50 116 Tayyba G., Muhammad I., Zahid A., Tahir A., Zubia Z., Asma T., Muhammad K., Nudrat E., Sajid M (2014) Recent trends in lactic acid biotechnology: A brief 118 review on production to purification Journal of Radiation Research and Applied Sciences 7(2), pp 222 -229 117 Thomas S (2000) Production of lactic acid from pulp mill solid waste and xylose using Lactobacillus delbrueckii (NRRL B445) Applied biochemistry and Biotechnology 84 - 86, pp 455 - 68 118 Timbuntam W., Tokiwa Y., Piyachomkwan K., Sriroth K (2008) Screening lactic acid bacteria from Thai agricultural products and wastes for potential application on cassava starch Kasetsart Journal 42, pp 328 - 340 119 Tokuhiro K., Ishida N., Kondo A., Takahashi H (2008) Lactic fermentation of cellobiose by a yeast strain displaying β-glucosidase on the cellsurface Appl Microbiol Biotechnol 79(3), pp 481 -88 120 Tolan J.S., Foody B (1999) Cellulases from submerged fermentation Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 65, pp 41 - 67 121 Tu M., Saddler J.N (2010) Potential enzyme cost reduction with the addition of surfactant during the hydrolysis of pretreated softwood Applied Biochemistry and Biotechnology 161(1- 8), pp 247 - 287 122 Tyree R W., Clausen E C., Gaddy J L (1990) The fermentation characteristics of Lactobacillus xylosus on glucose and xylose Biotechnology letters 12(1), pp 51 56 123 Vadlani P.V., Matthews A.P., Karr G.S (2008b) A two-stage fermentation process: production of propionate and acetate salt as road deicer from cheese whey Biological Engineering 1, pp 95-104 124 Vadlani P.V., Mathews A.P., Karr G.S (2008a) Low-cost propionate salt as road deicer: evaluation of cheese whey and other media components World Journal of Microbiology and Biotechnology 24(6), pp 825 - 832 125 Vamanu E., Vamanu A., Popa O., Câmpeanu G (2005) Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation African Journal of Biotechnology 4(5), pp 403 - 408 126 Vijayakumar J., AravindanR., Viruthagiri T (2008) Recent trends in the production, purification and and application of lactic acid Chemical Biochemical Engineering Quarterly 22(2), pp 245 - 264 127 Vlasenko Y.E., Ding H., Labavitch M.J., Shoemaker P.S (1997) Enzymeatic hydrolysis of pretreated rice straw Bioresource Technology 59(2 - 3), pp 109 119 119 128 Wang J., Wang Q., Xu Z., Zhang W., Xiang J (2015) Effect of fermentation conditions on L-lactic acid production from soybean straw hydrolysate Journal of Microbiology and Biotechnology 25(1), pp 26 - 32 129 Wayman M., Parekh S R (1990) Biotechnology of biomass conversion fuel and chemicals from renewable resources Open University Press, Milton Keynes, pp 181 - 232 130 Wee Y.J., Kim J.N., Ryu H.W (2006) Biotechnological production of lactic acid and its recent applications Food Technology and Biotechnology 44(2), pp 163 172 131 Wei J.H., Song Y.R (2001) Recent advances in study of lignin biosynthesis and manipulation Acta Botanica Sinica 43(8), pp 771 - 780 132 Wessels S., Axelsson L., Bech H E., De V L., Laulund S., Lihteenmiki L., Lindgren S., Mollet B., Salminen S., Von W A (2004) The lactic cid bacteria, the food chain and their regulation Trends in Food Science and Technology 15(10), pp 498 - 505 133 Wyman C.E (1999) Biomass ethanol: Technical progress, opportunities and commercial challenges Energy and the Environmen 24(1), pp 189-226 134 Wyman C.E., Dale B.E., Elander R.T., Holtzapple M., Ladisch M.R., Lee Y.Y (2005) Coordinated development of leading biomass pretreatment technologies Bioresource Technology 96(18), pp 1959 - 1966 135 Yao R., Qi B., Deng S., Liu N., Peng S., Cui Q (2007) Use of surfantants in enzymematic hydrolysis of rice straw and lactic acid production from rice straw by simultaneuos sacharification and fermentation Bioresources 2(3), pp 389 - 398 136 Yokoyama S (2008) The Asian biomass handbook The Iapan institute of energy 137 Yu L., Lei T., Ren X., Pei X., Feng X (2008) Response surface optimization of L(+) lactic acid production using corn steep liquor as an alternative nitrogen source by Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1466 Biochemical Engineering Journal 39(3), pp 496 - 498 138 Yu Z., Zhang H (2004) Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic hyrolysate with Saccharomyces cerevisiae Bioresource Technology 93(2), pp 199 – 204 139 Yumoto I., Ikeda K (1995) Direct fermentation of starch to L-(+)-lactic acid using Lactobacillus amylophilus Biotechnology Letters 17(5), pp 543 - 546 120 140 Yun J.S., Wee Y.J., Ryu H.W (2003) Production of optically pure (+)-lactic acid from various carbohydrates by batch fermentation of Enterococcus faecalis RKY1 Enzyme and Microbial Technology 33(4), pp 416 - 423 141 Zhang M., Su R., Qi.W., He Z (2010) Enhanced enzymatic hydrolysis of lignocellulose by optimizing enzyme complexes Applied Biochemistry and Biotechnology 160(5), pp 1407–1414 142 Zhang Y., Vadlani P.V (2015) Lactic acid production from biomass-derived sugars via co-fermentation of Lactobacillus brevis and Lactobacillus plantarum Journal of Bioscience and Bioengineering 119(6), pp 694 - 699 143 Zhang Y., Vadlani P.V (2013 ) D - lactic acid biosynthesis from biomass-derived sugars via Lactobacillus delbrueckii fermentation Bioprocess and Biosystems Engineering 36(12), pp 1897-1904 144 Zhao Y., Wu B., Yan B., Gao P (2004) Mechanism of cellobiose inhibition in cellulose hydrolysis by cellobiohydrolase Science in China Series C: Life Sciences 47(1), pp 18 -24 145 Zhong X., Qunhui W., Peng W., Guishi C., Yongzhen J., Zhaohua J (2007) Production of lactic acid from soybean stalk hydrolysate with Lactobacillus sake and Lactobacillus casei Process Biochemistry 42(1), pp 89 - 92 146 Zugenmaier P (2001) Conformation and packing of various crystalline cellulose fibers Progress in Polymer Science 26(9), pp 1341 - 1417 121 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Kết giải trình tự 16S rRNA chủng Y6 bảng số liệu lên men axit lactic từ xylose PL1.1 Kết giải trình tự 16S rRNA chủng Y6 ATTTCTGTCACTTAGGCGGCTGGCTCTAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGT TACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGCAGGCGAG TTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGAGATTTGCTTGCCCTCGC GAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATA AGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAG TCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTC GTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCAC CACCTGTCATTGCGTTCCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAG ATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCC ACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTAC TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCC TCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCT GTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGGTAGCCGCC TTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGT TCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTT AAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGAAAACCGCCTGCACTCTCTTTACGC CCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC GTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCT CATACGTGTTCTTCTTTAACAACAGAAGCTTTACGAAGCCGAAACCCTTTCTTC ACTCACGCCGTGGTTGCTTCCTTCAGGGTTTGCGCCCCATTGGTGGAAAAATTC CCTTACTGGCTGCCCTCCCCGTAGGGAGT 122 PL1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Bảng PL1.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Nhiệt độ 24 48 72 96 120 144 30 oC 0,74±0,30 0,9±0,15 1,43±0,02 1,64±0,07 2,48±0,22 2,45±0,02 35 oC 1,56±0,02 2,38±0,16 4,33±0,06 4,85±0,03 5,72±0,01 5,7±0,05 37 oC 2,1±0,03 3,4±0,03 4,85±0,03 5,42±0,01 6,66±0,03 6,64±0,02 40 oC 1,34±0,20 2,31±0,11 3,95±0,03 4,85±0,03 5,94±0,06 5,92±0,04 45 oC 0,95±0,03 0,73±0,16 1±0,06 1,41±0,03 1,67±0,01 1,66±0,05 Bảng PL1.2.2 Ảnh hưởng p ban đầu đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) pH ban đầu 24 48 72 96 120 144 4,0 1,75±0,03 2,68±0,06 3,45±0,02 4,09±0,01 4,5±0,01 4,5±0,02 4,5 1,87±0,02 3,65±0,07 4,85±0,07 5,18±0,09 5,56±0,11 5,5±0,03 5,0 2,01±0,07 3,98±0,01 5,29±0,05 5,89±0,12 6,21±0,10 6,19±0,02 5,5 2,12±0,04 5,91±0,02 6,31±0,08 6,67±0,10 6,66±0,12 6,0 2,95±0,01 5,19±0,07 6,34±0,09 6,93±0,02 7,25±0,02 7,23±0,03 6,5 2,45±0,02 4,93±0,06 5,45±0,03 6,28±0,01 6,72±0,05 6,7±0,02 7,0 2,03±0,03 3,85±0,03 4,95±0,02 5,55±0,04 5,95±0,02 5,95±0,01 7,5 1,66±0,01 2,45±0,01 3,05±0,01 3,86±0,005 4,12±0,002 4,1±0,001 4,2±0,07 123 Bảng PL 1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Nồng độ đường (g/l) Hàm lượng axit (g/l) 24 48 72 96 120 144 1,99±0,03 3,01±0,16 3,59±0,10 3,59±0,07 3,59±0,12 3,54±0,10 10 3,03±0,06 4,4±0,10 5,96±0,06 6,13±0,06 7,27±0,11 7,24±0,05 15 3,25±0,15 4,96±0,03 6,01±0,05 6,29±0,07 7,89±0,09 7,85±0,04 20 3,65±0,02 5,21±0,04 6,35±0,04 7,01±0,05 7,99±0,07 7,95±0,05 25 3,3±0,03 4,55±0,03 5,12±0,05 5,98±0,09 6,45±0,05 6,4±0,05 30 2,9±0,05 3,89±0,1 5,45±0,03 5,45±0,03 4,25±0,03 4,98±0,08 Bảng PL1.2.4 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Tỷ lệ cấp giống % 24 48 72 96 120 144 5% 1,98±0,03 2,21±0,06 2,89±0,07 3,25±0,05 4,02±0,05 4±0,06 10% 3,03±0,03 4,3±0,06 5,92±0,08 6,13±0,06 7,29±0,06 7,25±0,05 15% 3,89±0,05 4,98±0,05 6,05±0,05 6,58±0,07 7,45±0,07 7,4±0,05 20% 4,05±0,02 5,45±0,09 6,55±0,04 7,01±0,06 7,85±0,10 7,75±0,12 25% 3,53±0,08 4,12±0,10 5,56±0,10 6,15±0,05 6,98±0,11 6,95±0,11 Bảng PL1.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men axit lactic từ đường xylose chủng L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Tốc độ vòng lắc 24 vòng/phút 50 vòng/phút 100 vòng/phút 150 vòng/phút 48 72 96 120 144 4,05±0,05 7,08±0,03 7,89±0,02 8,11±0,09 8,51±0,03 8,5±0,20 4,25±0,05 7,52±0,07 8,01±0,04 8,23±0,01 8,78±0,02 8,75±0,01 4,42±0,03 7,98±0,03 8,21±0,03 8,46±0,01 8,89±0,01 8,85±0,05 3,95±0,05 6,98±0,03 7,32±0,04 7,62±0,02 7,98±0,02 7,95±0,10 124 PL2 Kết giải trình tự 16S rRNA chủng HC2 bảng số liệu lên men axit lactic từ cellobiose PL 2.1 Kết giải trình tự 16S rRNA chủng HC2 GAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGC ATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACT TTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATG GCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACG AAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA ACTCTGTTGttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacgg tatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgt aggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttt tttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaact gggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaa tgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaa ctgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggta gtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagt gctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctga aactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaag agattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtc agctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatt atcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaacc ggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctac acacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagcta atctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaa gtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgg gccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcgg tggggtaacctttaggaaccagccgcc 125 PL2.2 Ảnh hưởng yếu tố trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Bảng PL2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) Nhiệt độ 24 48 72 96 120 144 168 25oC 1,6 ± 0,05 2,05 ± 0,08 2,45 ± 0,05 3,05 ± 0,05 3,35 ± 0,08 3,37 ± 0,10 3,35 ± 0,05 30 oC 2,07 ± 0,05 2,28 ± 0,05 2,59 ± 0,08 3,25 ± 0,10 3,89 ± 0,08 3,85 ± 0,01 3,85 ± 0,50 35 oC 2,78 ± 0,10 3,23 ± 0,06 4,88 ± 0,11 5,38 ± 0,13 5,54 ± 0,15 5,58 ± 0,04 5,55 ± 0,11 37 oC 2,85 ± 0,05 3,45 ± 0,03 5,15 ± 0,03 5,52 ± 0,12 5,85 ± 0,06 5,81 ± 0,05 5,85 ± 0,10 40 oC 1,42 ± 0,11 1,94 ± 0,09 2,25 ± 0,10 2,97 ± 0,10 3,33 ± 0,08 3,34 ± 0,05 3,29 ± 0,05 45 oC 1,3 ± 0,13 1,52 ± 0,17 1,95 ± 0,11 2,26 ± 0,10 2,68 ± 0,10 2,65 ± 0,10 2,67 ± 0,03 Bảng PL2.2.2 Ảnh hưởng p ban đầu đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) pH ban đầu 24 48 72 96 120 144 168 4,5 1,82 ± 0,05 2,17 ± 0,1 2,76 ± 0,08 3,4 ± 0,1 3,82 ± 0,12 3,8 ± 0,05 3,8 ± 0,03 5,0 1,9 ± 0,06 2,43 ± 0,05 3,13 ± 0,11 3,74 ± 0,05 4,35 ± 0,11 4,38 ± 0,05 4,35 ± 0,002 5,5 2,13 ± 0,10 3,03 ± 0,10 4,27 ± 0,13 4,96 ± 0,08 5,25 ± 0,10 5,25 ± 0,01 5,18 ± 0,01 6,0 2,86 ± 0,05 3,89 ± 0,05 5,68 ± 0,05 5,83 ± 0,08 6,09 ± 0,08 6,09 ± 0,04 6,08 ± 0,10 6,5 2,43 ± 0,08 3,47 ± 0,08 4,37 ± 0,08 5,08 ± 0,05 5,39 ± 0,10 5,37 ± 0,10 5,36 ± 0,05 7,0 1,86 ± 0,10 2,38 ± 0,08 3,01 ± 0,08 3,58 ± 0,11 4,12 ± 0,05 4,1 ± 0,20 4,1 ± 0,05 7,5 1,81 ± 0,08 2,14 ± 0,05 2,57 ± 0,05 3,27 ± 0,08 3,65 ± 0,08 3,65 ± 0,04 3,64 ± 0,05 126 Bảng PL 2.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Nồng độ đường (g/l) 24 48 72 96 120 144 168 1,22 ±0,08 1,73 ± 0,03 2,21 ± 0,05 2,93 ± 0,10 3,22 ± 0,05 3,22 ± 0,10 3,23 ± 0,05 10 2,92 ± 0,24 3,88 ± 0,02 5,52 ± 0,08 5,92 ± 0,10 6,22 ± 0,05 6,20 ± 0,10 6,19 ± 0,03 15 3,01 ± 0,17 3,97 ± 0,05 5,62 ± 0,08 6,02 ± 0,20 6,35 ± 0,04 6,37 ± 0,05 6,36 ± 0,03 20 2,86 ± 0,15 3,38 ± 0,01 5,11 ± 0,05 5,64 ± 0,03 5,84 ± 0,05 5,86 ± 0,05 5,85 ± 0,03 25 1,84 ± 0,11 2,52 ± 0,01 4,4 ± 0,05 4,9 ± 0,04 5,29 ± 0,05 5,28 ± 0,05 5,29 ± 0,05 Hàm lượng axit (g/l) Bảng PL2.2.4 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) Tỉ lệ cấp giống (%) 24 48 72 96 120 144 24 1,35 ±0,05 1,85 ± 0,12 2,33 ± 0,05 3,15 ± 0,08 3,34 ± 0,10 3,35 ± 0,08 3,35 ± 0,12 10 2,92 ±0,05 3,88 ±0,11 5,52 ± 0,10 5,92 ± 0,08 6,32 ± 0,12 6,32 ± 0,08 6,31 ± 0,11 15 3,02 ±0,07 4,08 ± 0,08 5,78 ± 0,12 6,26 ± 0,08 6,51 ± 0,12 6,5 ± 0,05 6,51 ± 0,11 20 3,11± 0,04 4,13± 0,10 5,97± 0,12 6,46± 0,05 6,86± 0,01 6,86± 0,08 6,85± 0,12 25 3,24± 0,05 4,22± 0,08 6,05± 0,13 6,55± 0,05 6,93± 0,13 6,93± 0,05 6,92± 0,13 Bảng PL 2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men axit lactic từ đường cellobiose chủng L plantarum HC2 Hàm lượng axit (g/l) Tốc độ lắc (vòng/phút) 24 48 72 96 120 144 2,94±0,05 3,89±0,10 5,54±0,05 6,34±0,04 6,33±0,10 6,31±0,05 50 3,05±0,05 3,99±0,11 5,58±0,05 6,38±0,05 6,38±0,10 6,37±0,05 100 3,1±0,04 4,11±0,12 5,65±0,08 6,45±0,08 6,45±0,05 6,43±0,10 150 2,8±0,02 3,67±0,11 5,01±0,08 6,12±0,05 6,12±0,05 6,11±0,10 127 PL3 Các bảng số liệu lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 PL3.1 Kiểm tra tính kháng chéo chủng HC2 Y6 Hình PL3.1 Khả kháng chéo chủng C2 Y6 PL3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Bảng PL3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Nhiệt độ 12 24 36 48 60 33 oC 5,5±0,10 12,95±0,13 16,8±0,20 18,3±0,17 20,1±0,52 20,1±0,52 35 oC 6,5±0,26 13,95±0,10 17,35±0,13 19,9±0,10 21,95±0,15 21,95±0,15 37 oC 6,95±0,08 14,32±0,15 18,5±0,20 21,3±0,26 23±0,70 23±0,70 39 oC 5,45±0,05 13,02±0,02 17±0,50 19,95±0,50 20,15±0,43 20,15±0,43 128 Bảng PL 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng cao nấm men, g/l Hàm lượng axit (g/l) 12 24 36 48 60 2,98±0,03 5,5±0,03 7,8±0,03 10,98±0,03 12,5±0,03 12,5±0,10 6,98±0,03 14,35±0,03 18,84±0,03 21,33±0,01 23,4±0,03 23,4±0,05 7,94±0,01 16,83±0,03 19,82±0,01 22,99±0,03 24,3±0,06 24,3±0,03 11,15±0,03 14,01±0,05 21,54±0,02 24,15±0,04 25,4±0,04 25,4±0,03 10,87±0,03 14,81±0,03 22,23±0,06 24,85±0,05 26,2±0,05 26,2±0,05 Bảng PL 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Nồng độ đường ( g/l) Hàm lượng axit (g/l) 12 24 36 48 60 10 6,25±0,03 7,65±0,05 8,87±0,01 8,87±0,03 8,85±0,10 8,85±0,10 20 6,5±0,03 12,9±0,03 17,5±0,01 19,4±0,05 19,38±0,11 19,38±0,11 30 6,85±0,01 14,01±0,03 18,19±0,05 20,5±0,03 22,65±0,05 22,65±0,05 38 6,93±0,03 14,37±0,05 18,42±0,03 21,43±0,05 23,5±0,12 23,5±0,12 76 7,02±0,03 15,06±0,03 19,05±0,06 21,78±0,08 23,85±0,12 23,85±0,12 Bảng PL 3.2.4 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Tỉ lệ giống 12 24 36 48 60 1:1 6,95±0,03 14,34±0,05 18,42±0,03 21,43±0,12 23,43±0,13 23,4±0,13 2:1 10,95±0,05 20,51±0,05 24,55±0,05 27,25±0,12 30,6±0,13 30,6±0,13 3:1 11,14±0,03 21,94±0,05 23,94±0,05 25,53±0,11 26,85±0,11 26,85±0,11 4:1 13,15±0,10 22,95±0,12 23,55±0,03 24,9±0,10 25,12±0,05 25,12±0,05 129 Bảng PL 3.2.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 Hàm lượng axit (g/l) Tốc độ lắc vòng/phút 12 24 36 48 60 7,65±0,05 15,3±0,08 19,7±0,05 23,5±0,05 50 10,95±0,03 20,51±0,06 24,55±0,05 27,25±0,12 28,7±0,08 28,7±0,08 100 13,5±0,03 25,45±0,05 29,25±0,06 31,15±0,12 32,3±0,08 32,3±0,08 150 13,95±0,05 24,5±0,20 26,5±0,05 27,7±0,11 31,5±0,08 31,5±0,08 200 11,5±0,08 19,2±0,10 20,8±0,06 23,1±0,10 26,8±0,05 26,8±0,05 26,4±0,05 26,4±0,05 PL4 Phƣơng trình đƣờng chuẩn Mật độ quang học 2.5 y = 3.7186x - 0.274 R² = 0.9982 1.5 0.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ đường (g/l) 0.6 0.7 PL5 Một số hình ảnh trình tiền xử lý thủy phân rơm rạ, lên men dịch thủy phân rơm rạ Hình PL5.1 ình ảnh rơm rạ qua trình xử lý 130 Hình PL5.2 Mẫu rơm rạ sau tiền xử lý Hình PL5 Dịch thủy phân rơm rạ enzyme Hình PL5 Thiết bị lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 131 ... 3.3.2.2 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L fermentum Y6 93 3.3.2.3 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L plantarum HC2 L fermentum Y6 93 3.3.3 Nghiên. .. rơm rạ chủng L plantarum HC2 92 Hình 3.45 Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chủng L fermentum Y6 92 Hình 3.46 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm. .. tinh axit lactic từ dịch lên men thu từ trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ hỗn hợp chủng L fermentum Y6 L plantarum HC2 102 3.3.4.2 Phân tích sản phẩm axit lactic sắc