BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGÔ DUY SẠ NGHIÊN CỨU PHÂN ĐOẠN LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC THU NHẬN CELLULOSE SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIOETHANOL LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGƠ DUY SẠ NGHIÊN CỨU PHÂN ĐOẠN LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC THU NHẬN CELLULOSE SỬ DỤNG LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT BIOETHANOL Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Tô Kim Anh TS Phạm Tuấn Anh Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án kết nghiên cứu thời gian làm nghiên cứu sinh Các kết hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Ngô Duy Sạ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh, TS Phạm Tuấn Anh- Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội hƣớng dẫn tận tình giúp đỡ cho tơi suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy, cô giảng viên Bộ mơn Hóa Sinh – Vi sinh Sinh học phân tử thầy, cô giảng viên, cán nghiên cứu Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm truyền thụ kiến thức, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Lê Quang Diễn, TS Nguyễn Thị Minh Phƣơng Bộ môn Cơng nghệ Xenluloza Giấy–Viện Kỹ thuật Hố học Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội hƣớng dẫn, giúp đỡ thực phần nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Cộng đồng Hà Tây gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bạn nghiên cứu phòng thí nghiệm động viên giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến ngƣời “bạn” đồng hành tôi, ln có mặt giúp tơi vƣợt qua hết khó khăn để hồn thành luận án ngày hơm Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh Ngô Duy Sạ MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TỪ LIGNOCELLULOSE 1.2 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE BÃ MÍA 1.2.1 Thành phần, cấu trúc lignocellulose bã mía 1.2.2 Bã mía vấn đề sử dụng bã mía 12 1.3 TIỀN XỬ LÝ LIGNOCELLULOSE TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL 13 1.3.1 Ảnh hƣởng cấu trúc lignocellulose tới khả thủy phân cellulose enzyme14 1.3.2 Các biện pháp tiền xử lý lignocellulose 16 1.3.3.Lựa chọn kỹ thuật phân đoạn lignocellulose axit formic 27 1.4 ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE 29 1.4.1 Các enzyme thủy phân cellulose 29 1.4.2 Hoạt động hệ enzyme cellulase 30 1.5 THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ETHANOL TỪ CELLULOSE 33 1.5.1 Thủy phân lignocellulose lên men dịch thủy phân 33 1.5.4 Các phƣơng pháp thủy phân lên men sử dụng sản xuất ethanol từ lignocellulose 36 1.5.2 Sự ức chế trình thủy phân cellulose cellulase 39 1.5.3 Các chất ức chế hoạt động nấm men 41 1.5.5 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 44 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 46 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 I 2.2.1 Phƣơng pháp phân tích 47 2.2.2 Thiết kế thí nghiệm 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 PHÂN ĐOẠN BÃ MÍA BẰNG AXIT FORMIC 60 3.1.1 Thành phần bã mía nghiên cứu 60 3.1.2 Ảnh hƣởng điều kiện phân đoạn đến hàm lƣợng glucan bã sau phân đoạn tỷ lệ lignin loại bỏ 61 3.1.3 Nghiên cứu tác động đồng thời điều kiện phân đoạn bã mía axit formic theo phƣơng pháp formiline 67 3.1.4 Một số tính chất cellulose bã mía phân đoạn formiline 71 3.1.5 Mối liên hệ hàm lƣợng lignin, số kết tinh cellulose tới khả thủy phân cellulose bã mía phân đoạn 75 3.1.6 Chế độ phân đoạn bã mía axit formic 77 3.1.7 Ảnh hƣởng rửa kiềm tới chất lƣợng cellulose bã phân đoạn axit formic 80 3.1.8 Phân đoạn bã mía axit formic nồng độ bã rắn cao 87 3.1.9 Các thành phần dịch phân đoạn bã mía axit formic 89 3.2 THỦY PHÂN CELLULOSE BÃ MÍA PHÂN ĐOẠN BẰNG AXIT FORMIC 93 3.2.1 Một số đặc điểm chế phẩm enzyme NS 22192 93 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân cellulose bã mía phân đoạn 95 3.2.3 Ảnh hƣởng nồng độ bã rắn tới thủy phân cellulose bã mía phân đoạn enzyme 96 3.2.4 Động học q trình thủy phân cellulose bã mía phân đoạn 98 3.2.5 Ảnh hƣởng ức chế nồng độ glucose dịch thủy phân 100 3.2.6 Thủy phân cellulose bã mía phân đoạn nồng độ bã rắn cao (20%) 102 3.3 LÊN MEN ETHANOL TỪ BÃ MÍA PHÂN ĐOẠN FORMILINE 107 3.3.1 Khả lên men dịch thủy phân cellulose bã mía phân đoạn 107 3.3.2 Thủy phân lên men gián đoạn (SHF) 20% bã mía phân đoạn 109 3.3.3 Thủy phân lên men đồng thời bã mía phân đoạn formiline 111 3.3.4 So sánh hiệu SSF SHF 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 130 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC ẢNH CHỤP MẪU BÃ MÍA, DỊCH TXL TRONG QUÁ TRÌNH ĐỂ NGUỘI II 1.1 Ảnh chụp mẫu bã mía 1.2 Ảnh chụp dịch TXL trình để nguội PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HĨA LÝ CELLULOSE BÃ MÍA, ẢNH SEM CẤU TRÚC CÁC MẪU BÃ MÍA 2.1 Ảnh FESEM cấu trúc mẫu bã mía 2.2 Kết phân tích số kết tinh: 1.3 Kết phân tích mức formyl hóa cellulose PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA BỞI PHẦN MỀM DESIGN EXPERT CHO CÁC MƠ HÌNH TÁC ĐỘNG ĐỒNG THỜI CỦA ĐIỀU KIỆN PHÂN ĐOẠN 11 3.1 Kết phân tích ANOVA cho mơ hình hàm lƣợng glucan 11 3.2 Kết phân tích ANOVA cho mơ hình hàm lƣợng lignin lại 13 3.1 Kết phân tích ANOVA cho mơ hình hiệu suất thủy phân cellulose bã phân đoạn 14 3.4 Các phƣơng án phân đoạn đề xuất bở phần mềm Design Expert theo mục tiêu hàm lƣợng glucan bã 90% 16 PHỤ LỤC CÁC ĐƢỜNG CHUẨN SỬ DỤNG CHO PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG CÁC CHẤT 19 4.1 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS 20 4.2 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng glucose D glucose GOD-POD kit 20 4.3 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng gluocse, hàm lƣợng ethanol HPLC 21 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC MẪU BÃ MÍA 21 5.1 Kết phân tích HPLC thành phần bã mía 21 5.2 Kết phân tích hàm lƣợng cellulose Viện Công nghiệp giấy xenluylô 26 PHỤ LỤC ẢNH CHỤP MẪU THỦY PHÂN, LÊN MEN 27 6.1 Ảnh chụp hiển vi sợi cellulose trình thủy phân 27 6.2 Ảnh chụp mẫu thí nghiệm thủy phân 27 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG ETHANOL 29 7.1 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng ethanol 29 7.2 Kết phân tích hàm lƣợng ethanol 30 III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ/thuật ngữ viết tắt Ý nghĩa từ/thuật ngữ viết tắt AFEX Nổ ammonia - Ammonia fiber explosion CBD Miền gắn với cellulose enzyme - Cellulose binding domain CBH Enzyme thủy phân liên kết (1-4)-β-D glucosid từ đầu mạch cellulose - Cellobiohydrolase CMC Carboxymethyl cellulose CrI Chỉ số kết tinh cellulose- Cellulose crystallinity index DNS Axit dinitrosalicylic DP Mức độ polyme hóa- Degree of polymeization EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic FESEM Kính hiển vi điện tử quét trƣờng phát xạ - Field-emission scanning electronic microscope FPU Hoạt tính enzyme thủy phân giấy lọc- Filter paper units HL Hàm lƣợng HMF 5-hydroxy-2-methyl furfural NREL OD SHF SSF TAPPI Phòng thí nghiệm lƣợng tái tạo quốc gia Mỹ - National renewable energy laboratory Mật độ quang- Optical density Thủy phân lên men riêng rẽ - Separate hydrolysis and fermentation Thủy phân lên men đồng thời - Simultaneous saccharification and fermentation Hiệp hội kỹ thuật Công nghiệp Giấy Bột giấy (Mỹ) Technical association of the pulp and paper industry TXL Tiền xử lý UI Đơn vị hoạt tính enzyme quốc tế- International unit XRD Nhiễu xạ tia X- X ray diffraction IV DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose từ nguồn khác Bảng 1.2 Các phương pháp phân đoạn lignocellulose dung môi 23 Bảng 1.3 Tính chất đặc tính thủy phân cellululase 32 Bảng 1.4 Các chất ức chế, nồng độ phát nồng độ ức chế S.cerevisiae 43 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác động đồng thời điều kiện phân đoạn bã mía axit formic sử dụng phần mềm Design Expert 53 Bảng 3.1 Bố trí điều kiện thí nghiệm kết hàm lượng glucan, hàm lượng lignin hiệu suất thủy phân bã thu sau phân đoạn formiline 67 Bảng 3.2 Các mơ hình phụ thuộc hàm lượng glucan, hàm lượng lignin hiệu suất thủy phân cellulose bã sau phân đoạn vào nhiệt độ, nồng độ formic thời gian phân đoạn xây dựng phần mềm Design expert 69 Bảng 3.3 Chỉ số kết tinh cellulose bã mía phân đoạn axit formic chế độ khác 71 Bảng 3.4 Kết phân tích hàm lượng formic dịch thủy phân axit H2SO4 mẫu bã mía phân đoạn formiline với chế độ rửa kiềm khác 73 Bảng 3.5 Một số phương án phân đoạn theo mục tiêu 90% glucan đưa phần mềm Design Expert 77 Bảng 3.6 Hàm lượng lignin tối đa dịch phân đoạn nồng độ bã rắn khác 87 Bảng 3.7 Tỉ lệ thu hồi lignin dịch phân đoạn kết tủa 91 Bảng 3.8 So sánh số trình SSF nồng độ bã rắn cao sử dụng chất lignocellulose khác nhau, phương pháp TXL khác 114 V DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số sản phẩm chuyển hóa có giá trị từ cellulose đường Hình 1.2 Sơ đồ cơng nghệ sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose Hình 1.3 Cấu trúc lignocellulose Hình 1.4 Cơng thức hóa học cellulose Hình 1.5 Mơ tả cấu trúc cellulose tế bào thực vật Hình 1.6 Cấu trúc chung lignin 10 Hình 1.7 Cấu trúc hemicellulose 11 Hình 1.8 Biến đổi cấu trúc số loại nguyên liệu lignocellulose trước sau nổ 18 Hình 1.9 Mơ tả cấu trúc lignocellulose TXL với axit siêu máy tính 20 Hình 1.10 Sơ đồ phân đoạn lignocellulose dung môi 21 Hình 1.11 Sơ đồ phân đoạn dung mơi formicodeliTM giới thiệu Chempolis 26 Hình 1.12 Mơ tả tác động phối hợp thủy phân cellulose hệ cellulase với có mặt LMPO 31 Hình 1.13 Hoạt động thủy phân cellobiohydrolase 32 Hình 1.14 Thiết kế thiết bị thủy phân sử dụng cho trình thủy phân lignocellulose nồng độ bã rắn cao (nguồn: nrel.gov) 35 Hình 1.15 Yêu cầu lượng cho chưng cất để thu sản phẩm có hàm lượng ethanol 94% 36 Hình 1.16 Sơ đồ hình thành chất ức chế lên men từ lignocellulose 43 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bố trí thí nghiệm luận án 52 Hình 3.1 Kết phân tích thành phần bã mía nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 60 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ phân đoạn tới hàm lượng glucan, tỷ lệ lignin loại bỏ bã mía phân đoạn axit formic 61 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian phân đoạn tới hàm lượng glucan, tỷ lệ lignin loại bỏ bã mía phân đoạn axit formic 62 Hình 3.4 Ảnh hưởng kích thước bã tới hàm lượng glucan, tỷ lệ lignin loại bỏ bã mía phân đoạn axit formic 63 Hình 3.5 Ảnh hưởng khuấy trộn tới hàm lượng glucan, tỷ lệ lignin loại bỏ bã mía phân đoạn axit formic 64 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ formic tới hàm lượng glucan, tỷ lệ lignin loại bỏ bã mía phân đoạn axit formic 65 VI 4.1 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp DNS 1.2 y = 0.9674x - 0.0059 R² = 0.9947 OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Hàm lƣợng đƣờng khử (g/L) Phƣơng pháp dựng: 300 µl dung dịch có nồng độ glucose từ đến 1g/L (sử dụng glucose phân tích Sigma, độ tinh khiết 99,5%) đƣợc trộn với 600 µl thuốc thử DNS để phản ứng xảy nhiệt độ 95-1000C thời gian phút làm nguội nhiệt độ phòng Tiến hành đo OD dịch phản ứng bƣớc sóng 540 nm máy so màu UV/Visible GeneQuat 1300 Hàm tuyến tính OD hàm lƣợng đƣờng khử dung dịch đƣợc xây dựng sử dụng đồ thị tuyến tính XY Scatter excel 4.2 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng glucose D glucose GOD-POD kit Phƣơng pháp dựng: Lấy 150 µl thuốc thử GOD-POD vào giếng phản ứng lấy lƣợng xác 15 µl dịch có nồng độ glucose từ đến 1g/L (sử dụng glucose phân tích Sigma, độ tinh khiết 99,5%) vào giếng phản ứng, trộn Để phản ứng xảy nhiệt độ 40-500C thời gian 20 phút điều kiện tối Kết thúc phản ứng, tiến hành đo OD bƣớc sóng 510 nm, sử dụng hệ thống đọc khay vi thể Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader 1.4 y = 1.1889x + 0.0662 R² = 0.9988 1.2 OD 0.8 0.6 OD 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Hàm lƣợng glucose (g/L) 20 4.3 Đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng gluocse, hàm lƣợng ethanol HPLC Các đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng gluocse, hàm lƣợng ethanol đƣợc mô tả với kết phân tích PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC MẪU BÃ MÍA 5.1 Kết phân tích HPLC thành phần bã mía - Đƣờng chuẩn HPLC xác định thơng số thành phần bã mía 21 - Kết phân tích bã mía thơ Hàm lƣợng Glucan 39,91%, lignin 29,07%, hemicellulose 24,15 % 22 - Kết phân tích mẫu Run Phân đoạn tiến hành với chế độ: nhiệt đô 110°C, thời gian 50 phút, nồng độ formic 70% Hàm lƣợng Glucan 79,56%, hemicellulose 1,21% 23 - Kết phân tích mẫu Run Phân đoạn tiến hành với chế độ: nhiệt đô 130°C, thời gian 50 phút, nồng độ formic 60% Hàm lƣợng Glucan 82,73 %, hemicellulose 0% - Kết phân tích mẫu Run Phân đoạn tiến hành với chế độ: nhiệt đô 90°C, thời gian 50 phút, nồng độ formic 70% Hàm lƣợng Glucan 63,92%, hemicellulose 10,47% 24 - Kết phân tích mẫu Run 10 Phân đoạn tiến hành với chế độ: nhiệt đô 130°C, thời gian 90 phút, nồng độ formic 80% Hàm lƣợng Glucan 92,28%, hemicellulose 0% 25 5.2 Kết phân tích hàm lƣợng cellulose Viện Cơng nghiệp giấy xenluylô (theo phƣơng pháp Kürschner-Hoffer - sử dụng axit nitric rƣợu tác nhân phản ứng để tách loại lignin, hemicellulose) 26 PHỤ LỤC ẢNH CHỤP MẪU THỦY PHÂN, LÊN MEN 6.1 Ảnh chụp hiển vi sợi cellulose trình thủy phân 0h 48h 200h 6.2 Ảnh chụp mẫu thí nghiệm thủy phân 0h 96h - Ảnh mẫu thủy phân feed batch 27 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 20%- feed lần 0h 48h 72h - Ảnh chụp mẫu thủy phân thiết bị khuấy trộn 28 0h PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG ETHANOL 7.1 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng ethanol 29 7.2 Kết phân tích hàm lƣợng ethanol - Khả lên men dịch thủy phân - đối chứng (glucose) 30 - Khả lên men dịch thủy phân - đối chứng 48h 31 - Khả lên men dịch thủy phân - đối chứng 72 - Khả lên men dịch thủy phân - 32 - Khả lên men dịch thủy phân - 48 - Khả lên men dịch thủy phân - 72 33 - Kết lên men SSF- mẫu SSF với tiền thủy phân 50°C, nhiệt độ lên men 37°C, tổng thời gian 96 - Kết lên men SSF- mẫu SSF với tiền thủy phân 50°C, nhiệt độ lên men 30°C, tổng thời gian 96 34 ... cứu phân đoạn lignocellulose bã mía axit formic thu nhận cellulose sử dụng làm nguyên liệu sản xuất bioethanol” ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tƣợng nghiên cứu : Bã mía, cellulose thu nhận. .. nhận từ bã mía kỹ thu t phân đoạn - Phạm vi nghiên cứu: Kỹ thu t phân đoạn bã mía axit formic; thủy phân cellulose bã mía phân đoạn thu đƣợc, nghiên cứu lên men ethanol từ cellulose bã mía MỤC... NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu phân đoạn bã mía axit formic + Khảo sát điều kiện trình phân đoạn bã mía axit formic + Nghiên cứu tác động đồng thời điều kiện phân đoạn bã mía axit formic +