BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HỒI NGUN Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TƠ PLUTELLA XYLOSTELLA TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH4 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1311100520 : TRƯƠNG HỒI NGUN Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoài Hương ( Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM) Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm khóa luận tốt nghiệp TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người nuôi nấng dạy dỗ 23 năm qua, người trải qua biết khó khăn sống ln qua tâm con, chăm sóc cho Người ln bên lúc khó khăn Em xin cảm ơn anh chị gia đình định hướng ủng hộ em đường học tập Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tận tâm dạy bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt năm đại học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến cô Nguyễn Hồi Hương, người ln nhiệt tình với học trò, định hướng cung cấp kiến thức bổ ích cho chúng em, người trực tiếp hướng dẫn em xun suốt q trình thực tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai người cho em lời khuyên trình ni sâu tơ thí nghiệm cung cấp cho em giống nấm thí nghiệm Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Trung Dũng, cô Nguyễn Trần Thái Khanh, anh Trần Thiện Đức tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Đồng thời, xin cảm ơn đến bạn Đỗ Thị Cẩm Lụa, Cao Thị Thanh Thúy hổ trợ thực tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất bạn thực đồ án thời gian thực đồ án phòng thí nghiệm giúp đỡ suốt q trình làm thí nghiệm Cảm ơn em Hồ Trung Lộc lớp 14DSH, em Trần Nguyễn Tuấn Minh 14DSH, em Bùi Nhật Minh 14DSH phụ giúp anh trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 TRƯƠNG HOÀI NGUYÊN Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học thị trường 1.1.3 Những ưu điểm hạn chế thuốc trừ sâu sinh học 10 1.1.4 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học Abamectin 10 1.1.4.1 Ưu điểm .11 1.1.4.2 Nhược điểm .11 1.1.4.3 Cơ chế tác động 12 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 12 1.2.1 Lịch sử phát 12 1.2.2 Phân loại 13 1.2.3 Đặc điểm Serratia marcescens 13 1.2.4 Đặc điểm sinh lí .14 1.1.3.1 Đặc điểm sinh hóa 15 1.1.3.2 Đặc điểm phân bố .16 1.2 Giới thiệu Prodigiosin 17 1.3.1 Khái niệm prodigiosin 17 1.3.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin .17 1.3.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 20 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens 20 1.4 Enzyme 25 1.5 Yếu tố độc lực Serratia marcescens 25 1.6 Một số nghiên cứu giới 26 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 26 Đồ án tốt nghiệp 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 27 1.6.3 Tình hình nghiên cứu nấm gây bệnh 27 1.6.3.1 Nấm Fusarium solani sp 27 1.6.3.2 Nấm Paecilomyces sp 28 1.6.3.3 Nấm Trichoderma .28 1.6.3.4 Nấm Aspergillus flavus .29 1.7 Khái quát sâu tơ Plutella xylostella 29 1.7.1 Đặc điểm hình thái, sinh học 29 1.7.2 Tập quán sinh sống cách gây hại 30 1.7.3 Biện pháp phòng trừ .30 CHƯƠNG : ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 32 2.1.1 Thời gian 32 2.1.2 Địa điểm 32 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị .32 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia mascescens .32 2.2.2 Nguồn nấm .32 2.2.3 Nguồn ấu trùng Artemia nauplii 32 2.2.4 Nguồn cải Brassica integrifolia 32 2.2.5 Nguồn cá bảy màu Poecilia reticulate .32 2.2.6 Môi trường ni cấy hóa chất .32 2.2.7 Dụng cụ, thiết bị .33 2.3 Mục tiêu nghiên cứu 34 2.4 Nội dung nghiên cứu .34 2.5 Phương pháp thí nghiệm 34 2.5.1 Phương pháp luận 34 2.5.2 Bố trí thí nghiệm .35 2.6 Phương pháp nghiên cứu – bố trí thí nghiệm 36 2.6.1 Phương pháp nuôi sâu phòng thí nghiệm 36 2.6.2 Phương pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens 37 2.6.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học 37 2.6.3.1 Phương pháp định tính enzyme .37 Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Phương pháp khảo sát khả kháng nấm 42 2.6.3.3 Khảo sát hiệu lực diệt sâu phương pháp quét 44 2.6.3.4 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 45 2.6.3.5 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên cải Brassica integrifolia 47 2.6.3.6 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên cá bảy màu 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 51 3.1 Khả tiết enzyme ngoại bào .51 3.2 Hoạt tính kháng nấm .52 3.3 Hiệu lực diệt sâu từ chế phẩm 55 3.4 Khảo sát độc tính chế phẩm tác động lên ấu trùng Artemia nauplii 57 3.5 Khảo sát tác động chế phẩm lên cải Brassica integrifolia .58 3.6 Khảo sát tác động chế phẩm lên cá bảy màu Poecilia reticulata .61 1.Kết luận 65 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG 71 PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH 74 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 86 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ .89 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Artemia nauplii : A.nauplii Brassica integrifolia : B integrifolia Serratia mascescens : S.mascescens Plutella xylostella : P.xylostella Pepton glycerol : PG QCVN : Quy chuẩn Việt Nam BNNVPTNT : Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Vi khuẩn Serratia marcescens quan sát kính hiển vi (Gillen Gibbs, 2011) 14 Hình 1.2 Hình dáng màu sắc khuẩn lạc vi khuẩn Serratia marcescens 14 Hình 1.3 Cấu trúc prodigiosin (Krishna, 2008) 18 Hình 1.4 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 18 Hình 1.5 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) từ Streptomyces coelicolor A3 (2) (Cerdenor cộng sự, 2001) 21 Hình 1.6 Con đường đề xuất cho trình sinh tổng hợp prodigiosin .24 Hình 1.7 Vòng đời sâu tơ Plutella xylostella .30 Hình 2.1 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học, khả diệt sâu độc tính chế phẩm .36 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch môi trường Casein 38 Hình 2.3 Cách bố trí nghiệm thức đĩa thạch mơi trường Lipit 40 Hình 2.2 Cách bố trí nghiệm nghiệm thức đĩa thạch mơi trường Chitin 41 Hình 2.3 Bố trí nghiệm thức kháng nấm đĩa thạch PDA 43 Hình 2.6 Bố trí thử nghiệm chế diệt sâu tơ P xylostella phẩm phương pháp quét (Maureen cộng sự, 2012) .45 Hình 3.1 Hiệu lực diệt sâu tơ P.xylostella chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S.mascescens SH4 theo thời gian (Abbott 1925) 56 Hình 3.2 Tỉ lệ chết ấu trùng Artemia nauplli theo Log nồng độ prodigiosin (mg/ml) 58 Hình 3.3 Tỉ lệ nảy mầm cải B integrifolia sau ngâm chế phẩm 59 Hình 3.4 Tỉ lệ nảy chết cải B integrifolia sau phun chế phẩm 60 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc trừ sâu từ dịch ni cấy vi khuẩn Serrastia marcescens SH4 63 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens 15 Bảng 1.2 Xác định cấu trúc số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) 19 Bảng 3.1 enzyme ngoại bào canh trường lên men sau xử lí acid 52 Bảng 3.2 Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus flavus CDP1 .52 Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế nấm Fusarium sp 53 Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm Trichoderma sp 54 Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm Paecilomyces sp .54 Bảng 3.5 Tỉ lệ chết sâu tơ tuổi 56 Bảng 3.6 Độc tính chế phẩm cải sau ngày thử nghiệm 61 Bảng 3.7 Tỉ lệ chết cá sau ngày thử nghiệm 62 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 16 482.37461 Corrected Total 23 23302.13072 Error 30.14841 R-Square Coeff Var Root MSE tilekhang Mean 0.979299 Source DF nongdo 28.03016 5.490757 19.58874 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 22819.75611 3259.96516 108.13 F Model 19865.65647 2837.95092 Error 16 1623.96269 101.49767 Corrected Total 23 21489.61916 27.96 F 19865.65647 2837.95092 27.96 F Model 6858.796296 979.828042 Error 16 1459.259259 91.203704 Corrected Total 23 8318.055556 10.74 F Model 13198.14815 1885.44974 Error 16 666.66667 41.66667 96 45.25 F Corrected Total 23 13864.81481 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.951917 Source DF nongdo 11.33556 6.454972 56.94444 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 13198.14815 1885.44974 45.25 F Model 16351.38889 2335.91270 Error 16 1081.48148 67.59259 Corrected Total 23 17432.87037 34.56 F 16351.38889 2335.91270 34.56 F Model 20981.01852 2997.28836 Error 16 385.18519 24.07407 Corrected Total 23 21366.20370 124.50 F 20981.01852 2997.28836 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Tilechet 99 124.50 F 21488.42593 100 3069.77513 245.58 F 16 200.00000 Corrected Total 23 21688.42593 Error 12.50000 R-Square Coeff Var Root MSE Tilechet Mean 0.990778 Source DF nongdo 4.278293 3.535534 82.63889 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 21488.42593 3069.77513 245.58 F Model 2361.238095 393.539683 Error 14 40.000000 2.857143 Corrected Total 20 2401.238095 137.74 F 2361.238095 393.539683 137.74 F Model 1212.239583 173.177083 Error 16 275.000000 17.187500 Corrected Total 23 1487.239583 10.08 F 1212.239583 173.177083 10.08 F Model 3308.072917 472.581845 Error 16 308.333333 19.270833 Corrected Total 23 3616.406250 104 24.52 F 3308.072917 472.581845 24.52 F Model 7241.406250 1034.486607 Error 16 287.500000 17.968750 Corrected Total 23 7528.906250 57.57 F 7241.406250 1034.486607 57.57