BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỂ PHÂN GIẢI PROTEIN GÂY DỊ ỨNG TRONG KHÔ DẦU ĐẬU NÀNH VỚI PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Huỳnh Ninh Sinh viên thực MSSV: 1311100732 : Lê Huỳnh Hoài Thương Lớp: 13DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Phạm Huỳnh Ninh Bộ môn Dinh dưỡng Thức ăn chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ (IASVN) Những kết có đồ án hồn tồn không chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP.HCM, ngày 16 tháng năm 2017 Sinh viên thực Lê Huỳnh Hoài Thương Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gởi lời tri ân chân thành đến TS Phạm Huỳnh Ninh tận tình hướng dẫn, bảo em suốt thời gian xây dựng đề cương hoàn thành đồ án Em xin cám ơn anh Lê Quang Trí Vũ Minh động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực Đồng thời, em gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian dài học tập Với kiến thức mà em tiếp thu không giúp cho em thực đồ án tốt nghiệp mà tảng kiến thức cho công việc sau Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình ln chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ chỗ dựa vững không tinh thần mà vật chất cho em suốt năm qua Em xin gởi lời cám ơn chân thành đễn bạn thực đề tài phòng thí nghiệm CNSH – Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - người ln động viên, sát cánh giúp đỡ để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cám ơn Thầy Cô hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quí Thầy Cô lời chúc sức khỏe TP.HCM, ngày 16 tháng năm 2017 Sinh viên thực Lê Huỳnh Hoài Thương Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC ĐỒ THỊ .iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan nghiên cứu sản xuất khô dầu đậu nành 1.1.1 Lên men khô dầu đậu nành để giảm thiểu chất gây dị ứng 1.1.2 Vấn đề sử dụng khô dầu nành lên men 1.2 Tổng quan Bacillus 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus 1.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.3 Tổng quan protease 11 1.3.1 Khái niệm 11 1.3.2 Phân loại 11 1.3.3 Hoạt tính protease đậu nành 12 1.4 Giới thiệu lên men bán rắn 13 1.4.1 Những vấn đề lên men bán rắn 13 1.4.2 Những ưu điểm lên men bán rắn 13 1.4.3 Sự tạp nhiễm lên men bán rắn 14 1.4.4 Các giai đoạn lên men bán rắn 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu 17 2.1.1 Nguyên vật liệu 17 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 17 i Đồ án tốt nghiệp 2.2 Môi trường nghiên cứu 17 2.2.1 Môi trường phân lập giữ giống Bacillus 17 2.2.2 Mơi trường khảo sát hoạt tính protease chủng vi khuẩn 18 2.2.3 Hóa chất SDS-PAGE 19 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp phân lập, giữ giống vi khuẩn Bacillus 19 2.3.2 Phương pháp định danh 22 2.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính protease 27 2.3.4 Khảo sát điều kiện thích hợp cho lên men khơ dầu đậu nành 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Phân lập định danh chủng Bacillus 40 3.2 Khảo sát hoạt tính protease vi khuẩn 42 3.2.1 Xác định dựa vòng phân giải 42 3.2.2 Xác định dựa chất khô dầu đậu nành 44 3.3 Khảo sát điều kiện lên men 46 3.3.1 Khảo sát độ ẩm thích hợp cho lên men 46 3.3.2 Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho lên men 48 3.3.3 Khảo sát độ dày thích hợp cho lên men chất 50 3.3.4 Khảo sát thời gian lên men thích hợp 51 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học axít amin khơ dầu đậu nành tách vỏ Mỹ Bảng 1.2 Đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus subtilis Bảng 2.1 Trình tự bổ sung hóa chất để xây dựng đường chuẩn Tyrosine 29 Bảng 2.2 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 30 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm sinh hóa 41 Bảng 3.2 Kết vòng phân giải gelatin 42 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme protease (U/g) 44 Bảng 3.4 Kết tăng trưởng vi sinh vật qua khung mức độ ẩm khác 46 Bảng 3.5 Kết tăng trưởng vi sinh vật qua khung mức nhiệt độ khác 48 Bảng 3.6 Kết tăng trưởng vi sinh vật qua khung mức độ dày khác 50 Bảng 3.7 Kết tăng trưởng vi sinh vật qua khung khác 52 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Biểu thị đường kính vòng phân giải gelatin 43 Đồ thị 3.2 Biểu thị hoạt tính enzyme sau mốc thời gian 44 Đồ thị 3.3 Biểu thị tăng trưởng vi sinh vật qua mốc thời gian mức độ ẩm khác 47 Đồ thị 3.4 Biểu thị tăng trưởng vi sinh vật qua mốc thời gian nhiệt độ khác 49 Đồ thị 3.5 Biểu thị tăng trưởng vi sinh vật qua mốc thời gian độ dày khác 51 Đồ thị 3.6 Biểu thị tăng trưởng vi sinh vật qua mốc thời gian khác 53 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chế phẩm Natto 40 Hình 3.2 Hình dạng vi khuẩn kính hiển vi 40 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải gelatin 42 Hình 3.4 Kết điện di SDS-PAGE mẫu khô dầu nành lên men mức độ ẩm khác 47 Hình 3.5 Kết điện di SDS-PAGE mẫu khô dầu nành lên men mức nhiệt độ khác 49 Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE mẫu khơ dầu nành lên men mức độ dày khác 51 Hình 3.7 Kết điện di SDS-PAGE mẫu khô dầu nành lên men mức thời gian khác 53 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ctv cộng tác viên IU đơn vị quốc tế rpm vòng/phút SCA Simmon Citrate Agar SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Std Thang chuẩn Đc Đối chứng vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU ❖ Đặt vấn đề Khơ dầu đậu nành, sản phẩm q trình tách chiết dầu từ hạt đậu nành, chủ yếu sử dụng để chế biến thức ăn chăn nuôi gà heo, chiếm khoảng 74% tổng sản lượng (Chen ctv, 2010) Khô dầu đậu nành thường sử dụng với tỷ lệ khoảng 1020% cho heo gà Đây nguồn cung cấp protein tốt cho vật ni có hàm lượng axít amin khơng thay cao Tuy nhiên, việc sử dụng khô dầu đậu nành phần thức ăn cho gia súc, gia cầm non (hệ tiêu hóa chưa hồn thiện) bị hạn chế, hiệu không cao khô dầu đậu nành chứa số protein gây dị ứng Hai protein gây dị ứng chủ yếu đậu nành glycinin (globulin 11S) βconglycinin (globulin 7S) Chúng chiếm 50% tổng lượng protein hạt đậu nành (Samoto ctv, 2007) Glycinin protein với cấu trúc gồm tiểu đơn vị mà tiểu đơn vị gồm chuỗi polypeptide mang tính axít (khối lượng phân tử 35-40 kDa) chuỗi polypeptide mang tính bazơ (22 kDa) liên kết với liên kết disulfua (Helm ctv, 2000; Beardslee ctv, 2000; Hou ctv, 2004; Golubovic ctv, 2005) Tổng lượng glycinin khoảng 20-70mg/g khô dầu đậu nành chiếm đến 40% tổng khối lượng protein đậu nành (van Eys ctv, 2004; Sun ctv, 2008) Glycinin có khả bền nhiệt kháng hầu hết enzyme hệ tiêu hóa có liên kết disulfua bền (Kuipers ctv, 2007) Các nghiên cứu rằng, glycinin gây dị ứng cho người vật ni non có khả gắn globulin miễn dịch E (IgE) vào chuỗi axít polypeptide Nó làm tăng hàm lượng kháng thể glycinin-IgE huyết nguyên nhân gây dị ứng (Sun ctv, 2007) Mặt dù nhiều nghiên cứu cho thấy glycinin liên quan đến triệu chứng dị ứng biến đổi hình dáng nhung mao, đảo lộn chức miễn dịch, tăng trưởng chậm tiêu chảy Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường kính vòng phân giải Duong kinh vong phan giai gelatine The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values k 123456 t 11 BI1 BI2 BI3 BI4 Ba Li MN1 MN2 Na Su Yoi Number of Observations Read 66 Number of Observations Used 66 Duong kinh vong phan giai gelatine The ANOVA Procedure Dependent Variable: y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 15 139.7424242 9.3161616 Error 50 70.8787879 1.4175758 Corrected Total 65 210.6212121 6.57 F k 0.5242424 t 10 137.1212121 13.7121212 2.6212121 0.37 0.8669 9.67