BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT ANTHOCYANIN TỪ QUẢ MỒNG TƠI CHÍN (BASELLA ALBA L.) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực MSSV: 1211100261 : Nguyễn Thanh Loan Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 7/2017 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố nghiên cứu, đồ án Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc hoàn thành đồ án đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đồ án đƣợc ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu đồ án TP HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Loan i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận đƣợc động viên giúp đỡ lớn từ cá nhân tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Hƣơng, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, ngƣời tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi thực hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phòng thí nghiệm Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP HCM tạo điều kiện sở vật chất tốt cho tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ bạn nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài hoàn thành luận văn TP HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thanh Loan ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC SƠ ĐỒ .vii DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan mồng tơi 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 1.1.3 Tình hình trồng trọt, tiêu thụ, kỹ thuật canh tác mồng tơi Việt Nam ………………………………………………………………………………7 1.1.3.1 Tình hình trồng trọt tiêu thụ 1.1.3.2 Kỹ thuật canh tác 1.1.4 Thành phần hóa học 10 1.1.5 Tính vị cơng dụng 11 1.2 Hợp chất Phenol, Flavonoid, Anthocyanin 12 1.2.1 Phenol 12 1.2.1.1 Đại cƣơng hợp chất phenol 12 1.2.1.2 Phân loại 13 1.2.1.3 Tính chất chức 14 1.2.2 Flavonoid 15 1.2.2.1 Đại cƣơng flavonoid 15 1.2.2.2 Phân loại 15 1.2.2.3 Lý tính 16 1.2.2.4 Hóa tính 17 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2.5 Hoạt tính sinh học 18 1.2.3 Anthocyanin 21 1.2.3.1 Đại cương anthocyanin 21 1.2.3.2 Phân loại 23 1.2.3.3 Lý tính 24 1.2.3.4 Hóa tính 24 1.2.3.5 Hoạt tính sinh học 25 1.3 Các phƣơng pháp tách chiết hợp chất thứ cấp thực vật 26 1.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 26 1.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng – rắn 28 1.3.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 28 1.3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm 28 1.3.2.3 Kỹ thuật chiết máy chiết Soxhlet 29 1.3.2.4 Kỹ thuật chiết máy Kumagawa 30 1.3.2.5 Phƣơng pháp chƣng cất 31 1.3.2.6 Chiết chất lỏng siêu tới hạn 32 1.3.2.7 Kỹ thuật chiết pha rắn 33 1.4 Tổng quan khả kháng oxy hóa 34 1.4.1 Quá trình nguyên nhân gây oxy hóa 34 1.4.2 Khả kháng oxy hóa hợp chất thực vật 35 1.5 Cơ sở khoa học khả kháng khuẩn hợp chất thực vật ………………………………………………………………………………….35 1.5.1 Định nghĩa 35 1.5.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất thực vật 36 1.6 Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 38 1.6.1 Salmonella 38 1.6.2 Staphylococcus aureus 39 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.3 Escherichia Coli 40 1.6.4 Bacillus cereus 42 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 44 2.2 Vật liệu nghiên cứu 44 2.2.1 Nguồn mẫu 44 2.2.2 Vi sinh vật thị 44 2.3 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 44 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm mẫu 45 2.4.2 Phương pháp xác định tỉ lệ trọng lượng mẫu 46 2.4.3 Phương pháp tách chiết thu nhận cao chiết 46 2.4.4 Phương pháp định lượng polyphenol tổng số 46 2.4.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa mơ hình DPPH 47 2.4.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn kỹ thuật đục lỗ thạch …………………………………………………………………………… 48 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 50 2.4.8 Phương pháp so sánh, đối chiếu 50 2.5 Bố trí thí nghiệm 50 2.5.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm mẫu mồng tơi 50 2.5.2 Thí nghiệm 2: Xác định tỉ lệ trọng lượng mẫu 51 2.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi trích ly đến hàm lượng anthocyanin 51 2.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng số 54 2.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi trích ly đến khả kháng oxy hóa 55 iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng dung mơi trích ly đến khả kháng khuẩn 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Kết xác định độ ẩm tỉ lệ trọng lƣợng mồng tơi chín 58 3.2 Kết đánh giá ảnh hƣởng dung môi đến hàm lƣợng anthocyanin 58 3.3 Kết đánh giá ảnh hƣởng dung môi đến hàm lƣợng polyphenol tổng số ………………………………………………………………………………….60 3.4 Kết đánh giá ảnh hƣởng dung mơi đến khả kháng oxy hóa ………………………………………………………………………………….63 3.5 Kết ảnh hƣởng dung mơi trích ly đến khả kháng khuẩn 67 3.5.1 Hoạt tính kháng Bacillus cereus loại cao chiết 67 3.5.2 Hoạt tính kháng Salmonella loại cao chiết 67 3.5.3 Hoạt tính kháng E.coli loại cao chiết 68 3.5.4 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus loại cao chiết 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG : acid gallic BVTV : bảo vệ thực vật db nguyên liệu : DMSO : Dimethyl Sulfoxide DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 : The half maximal inhibitory concentration NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth OD : Optical Density TN : thí nghiệm v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học mồng tơi Bảng 1.2 Thành phần hóa học mồng tơi 10 Bảng 1.3 Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (Cowan, 1990) 37 Bảng 1.4 Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Salmonella 38 Bảng 1.5 Phân loại khoc học chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 39 Bảng 1.6 Phân loại khoa học chủng vi khuẩn E.Coli 40 Bảng 1.7 Phân loại khoa học chủng vi khuẩn Bacillus cereus 42 Bảng 3.1 Tỉ lệ trọng lƣợng phần sử dụng độ ẩm mồng tơi chín 58 Bảng 3.2 Kết đƣờng chuẩn acid gallic 60 Bảng 3.3 Kết hàm lƣợng polyphenol tổng loại dung mơi trích ly mồng tơi chín 61 Bảng 3.4 Phần trăm ức chế cao mồng tơi chín dung mơi trích ly khác ( mẫu tự theo sau giá trị cột khác khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức 1%) 65 Bảng 3.5 Phƣơng trình đƣờng chuẩn giá trị IC50 nghiệm thức 65 Bảng 3.6 Kết kháng Bacillus cereus loại cao chiết 67 Bảng 3.7 Kết kháng Salmonella loại cao chiết 67 Bảng 3.8 Kết kháng E.coli loại cao chiết 68 Bảng 3.9 Kết kháng Staphylococcus aureus loại cao chiết 69 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 50 Sơ đồ 2.2 Quy trình trích ly thu hồi cao mồng tơi 53 Sơ đồ 2.3 Quy trình đánh giá khả kháng khuẩn cao chiết mồng tơi chín 56 Sơ đồ 3.1 Hiệu suất thu hồi cao chiết từ mồng tơi chín vối dung mơi khác 59 Sơ đồ 3.2 So sánh hàm lƣợng polyphenol tổng cao chiết mồng tơi chín dung mơi trích ly khác 62 Sơ đồ 3.3 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 vitamin C cao chiết dung mơi trích ly khác 66 Sơ đồ 3.4 Tổng quát hoạt tính kháng khuẩn cao mồng tơi chín từ loại dung môi khác chủng vi khuẩn 70 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP C 58.685 50 D 45.860 25 E Friday, July 9, 2017 36.350 12.5 DUNG MOI ETHANOL 70 01:37 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for II NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10.65061 Critical Value of t 4.03214 Least Significant Difference 13.159 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N nongdo A 87.780 125 B B B 70.910 75 58.685 50 45.860 25 C C C Friday, July 9, 2017 D D D 36.350 DUNG MOI NUOC CAT 12.5 02:07 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels nongdo 16 Values 12.5 125 25 50 75 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Number of Observations Read Number of Observations Used DUNG MOI NUOC CAT Friday, July 9, 2017 10 10 02:07 The ANOVA Procedure Dependent Variable: II DF Sum of Squares Mean Square Model F 81.67 R-Square Coeff Var Root MSE II Mean 0.984925 4.976503 2.740759 55.07400 Source F Value Pr > F 81.67 nongdo F 26.27 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.867857 12.28904 2.150581 17.50000 Source F Value Pr > F 26.27 BACILLUS 0.0069 DF Anova SS Mean Square 121.5000000 121.5000000 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 11:31 Thursday, July 9, 2017 20 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 4.625 2.77645 4.8753 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 khangsin B 13.000 70 HOAT TINH KHANG BACILLUS CEREUS 11:31 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.01 4.625 4.60409 8.0845 Means with the same letter are not significantly different 21 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP t Grouping Mean N BACILLUS A 22.000 khangsin B 13.000 70 E.3 Salmonella Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 11,5 15 10 11 17 10 14 18 Độ lệch chuẩn 0,333 1,072 0,882 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information 22 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Class Levels SAL Values 50 70 khangsin Number of Observations Read Number of Observations Used HOAT TINH KHANG SALMONELLA 9 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK DF Sum of Squares Mean Square Model 0.0018 75.50000000 37.75000000 Error 10.50000000 1.75000000 Corrected Total 86.00000000 Source F Value Pr > F 21.57 R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.877907 10.30812 1.322876 12.83333 Source F Value Pr > F 21.57 SAL 0.0018 DF Anova SS Mean Square 75.50000000 37.75000000 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 23 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.05 1.75 2.44691 2.643 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N SAL A 16.667 khangsin B B B 12.167 70 9.667 50 HOAT TINH KHANG SALMONELLA 11:46 Thursday, July 9, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 0.01 1.75 3.70743 4.0045 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N SAL A 16.667 khangsin B B B 12.167 70 9.667 50 24 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP E.4 E.coli Đƣờng kính vòng kháng Ethanol Ethanol Ethanol Nƣớc Kháng khuẩn (mm) 30% 50% 70% cất sinh 11 10 13 21 11 10 12 20 11 10 12 25 Độ lệch chuẩn 0 0,333 1,528 HOAT TINH KHANG ECOLI Thursday, July 9, 2017 11:53 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels E Values 30 50 70 khangsin Number of Observations Read Number of Observations Used 25 12 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOAT TINH KHANG ECOLI Thursday, July 9, 2017 11:53 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DK DF Sum of Squares Mean Square Model F 50.00 Corrected Total R-Square Coeff Var Root MSE DK Mean 0.949367 9.787998 1.354006 13.83333 Source F Value Pr > F E 50.00 DF Anova SS Mean Square 275.0000000 91.6666667 F 38.55 Model F SA 38.55 DF Anova SS Mean Square 264.7333333 66.1833333