BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: ĐỒNG THỊ MINH THANH Lớp: 11HSH02 MSSV: 1191111040 TP Hồ Chí Minh, 2013 Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu tìm hiểu enzym amylase, amylase nấm mốc vi khuẩn” cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực sở nghiên cứu lý thuyết thực nghiệm, hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Thị Hoài Hương Người thực đề tài xin chịu trách nhiệm lời cam đoan TP.HCM, ngày tháng năm 2013 Người thực đề tài Đồng Thị Minh Thanh LỜI CẢM ƠN Để thực đề tài này, người thực đề tài xin dành lời cảm ơn chân thành gởi đến TS Nguyễn Thị Hồi Hương, tận tình hướng dẫn suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Người thực đề tài xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa KhoaCông Nghệ Sinh Học – Môi Trường Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh q Thầy Cơ tận tình giảng dạy người thực đề tài suốt khóa học - Lãnh đạo Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư tạo điều kiện giúp đỡ người thực đề tài hoàn thành tốt suốt chương trình học trình thực đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, người thực đề tài xin cảm ơn đến gia đình, anh chị em phận xét nghiệm Trung tâm Khuyến Nông Khuyến Ngư động viên giúp đỡ người thực đề tài suốt trình học tập làm đề tài tốt nghiệp Người thực đề tài xin chân thành cảm ơn Hội đồng chấm luận án phản biện, đánh giá, góp ý, giúp đỡ người thực đề tài hoàn thiện luận văn tốt nghiệp Chân thành cảm ơn! ii Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC .i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu enzym amylase nấm mốc 1.1.1 Khái niệm enzyme amylase .4 1.1.2 Phân loại 1.2 enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn .5 1.3 Điều kiện sinh trưởng nấm mốc: 1.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng .9 1.3.2 Độ ẩm 12 1.3.3 Nhiệt độ 12 1.3.4 pH 13 1.4 Các phương pháp thu nhận enzyme amylase 13 1.4.1 Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase phương pháp bề mặt 13 1.4.2 Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase phương pháp nuôi cấy chìm .15 1.5 Ứng dụng enzyme amylase 16 1.5.1 Amylase công nghiệp rượu – bia 16 1.5.2 Trong sản xuất bánh mì .17 1.5.3 Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco 17 1.5.4 Trong số ngành công nghiệp thực phẩm khác 18 1.5.5 Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy .18 1.5.6 Trong chăn nuôi 19 1.5.7 Trong y học 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .20 i 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Vật liệu và hóa chất 20 2.2 Phương pháp .22 2.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu .22 2.3 Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase 28 2.3.1 Qui trình cơng nghệ lên men bề mặt 28 2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth .29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .31 3.1 Kết phân lập chủng nấm mốc có bánh men cơm rượu .31 3.2 Kết quan sát hình thái nấm mốc 32 3.3 Kết xác định khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase 34 3.4 Kết thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc phương pháp ni cấy chìm 36 3.4.1 Điều kiện nuôi cấy 36 3.4.2 Xác định hoạt tính enzyme Amylase 37 3.4.3 Kết xác định hoạt tính enzyme Amylase 37 3.5 Kết lên men bề mặt thu enzyme amylase 38 3.6 Kết xác định hoạt tính enzyme amylase sau kết tủa 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận .47 4.2 Kiến nghị 47 ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên MT Mơi trường PGA Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) Ghi CĐ Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu CL Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP Phan Rang Nơi lấy mẫu NS Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu KB Chợ Kim Biên – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu LB Chợ Long Bình – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NH Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu TN Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NP Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu M1 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Động M2 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Động M3 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Lớn M4 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Lớn M5 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M6 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M7 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Kim Biên M8 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Long Bình M9 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Ninh Hải M10 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Thuận Nam M11 Chủng nấm mốc mẫu bánh men chợ Ninh Phước Dd Dung dịch iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu…………………………………………… 20 Bảng 2.2: Thuốc thử Lugolc…………………………………………………………21 Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7…………………………………………… 21 Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% ……………………………………………………21 Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) …………………………………21 Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột……………………………………….………22 Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu……………………31 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu…………………………………………………………………………… …….32 Bảng 3.3: Khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu………………………………………………………………… …………34 Bảng 3.4: Bảng kết thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme…………… ………38 Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu thời gian 2, 3, ngày lên men thể rắn………………………………………………………………… ……43 Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột…………………………………….…… 44 iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Mơi trường PGA sau hấp…………………………………………… 23 Hình 2.2: Đổ đĩa peptri……………………………………………………………….24 Hình 2.3: Mơi trường ni cấy sau 48h………………………………………………24 Hình 2.4:Mơi trường sau làm thuần………………………………………………… 24 Hinh 2.5 Cấy giữ giống………………………………………………………………25 Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc…………………………27 Hình 2.7 : Quy trình cơng nghệ lên men bề mặt…………………………………… 28 Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10………………… 32 Hình 3.2: Khả phân giải tinh bột chủng M3, M4, M9, M11………… 35 Hình 3.3: Khả phân giải tinh bột chủng M6, M7…………………… 36 Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme…………………………………….38 Hình 3.5: Mơi trường ni cấy sau hấp………………………………… ………39 Hình 3.6: Cấy giống vào mơi trường ni cấy………………………………………39 Hình 3.8: Thu dịch ni cấy………………………………………………………….40 Hình 3.9: Lọc dịch chiết…………………………………………………………… 41 Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase tủa cồn 960 lạnh……………… 41 Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau ngày ni cấy…………… 42 Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau ngày ni cấy…………… 42 Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau ngày ni cấy…………… 43 Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa………………………………….45 v PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết lý hình thành đề tài Ngày nay, Amylase enzyme ứng dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp, đem lại lợi ích kinh tế, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo, bánh mì Sản xuất enzyme Amylase từ bánh mem (cơm rượu) đề tài mang tính cấp thiết, bánh men có chứa nhiều chủng có khả tạo enzyme amylase nấm men, nấm mốc nguồn nguyên liệu dễ tìm rẻ tiền, nguyên liệu truyền thống sản xuất rượu trắng đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng enzyme amylase thu từ nấm mốc có bánh men có ưu điểm ưu việt, nội dung đồ án tốt nghiệp người thực đề tài chọn đề “Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase” Ý nghĩa khoa học thực tiễn Vi sinh vật tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác Đặc điểm có liên quan đến thể đơn bào Cơ thể đơn bào phải thực tất chức sống, chúng phải tạo nhiều loại enzyme khác để đảm bảo sống phát triển tốt Nhiều vi sinh vật có khả tạo enzyme amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn…Trong nấm mốc có khả tạo enzym amylase nhiều Nấm mốc gọi nấm sợi, tức tất mốc mọc thực phẩm, chiếu, quần áo, sách … Chúng phát triển nhanh nhiều nguồn chất hữu gặp khí hậu nóng ẩm Nấm mốc vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu bên ngồi, nguồn ngun liệu làm mơi trường nuôi cấy nấm mốc rẻ tiền dễ kiếm, tốc độ sinh sản nấm mốc phát triển vật nhanh, Enzyme thu nhận từ nấm mốc có hoạt tính cao, đồng thời khoảng thời gian ngắn, ta thu lượng sinh khối lớn enzyme nội bào mà thu lượng đáng kể enzyme ngoại bào nấm mốc tiết mơi trường Vì thế, giá thành sản phẩm giảm sản xuất nơi giới, mang lại hiệu suất kinh tế cao Mục tiêu nghiên cứu, đối tượng: Phân lập vi nấm enzyme amylase từ bánh men rượu thử nghiệm quy trình lên men thu enzyme amylase, cụ thể: + Thu thập nguồn bánh men từ vùng khác nhau, sau phân lập chủng nấm mốc từ mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả phân giải tinh bột, lấy chủng lên men thu enzym phương pháp lên men chìm, lên men bán rắn, lên men cơng nghiệp ứng dụng chúng để thu nhận enzyme amylase + Xác định hoạt tính enzyme amylase thu thử nghiệm khả phân giải tinh bột enzyme amylase nhằm góp phần tạo nguồn enzyme có giá trị từ vi sinh vật + Phạm vi giới hạn đề tài Trong giới hạn đề tài, người thực đề tài tập chung tìm hiểu nguồn nấm mốc có bánh men để thu nhận enzyme quy mơ phòng thí nghiệm Do trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm khơng đầy đủ, chưa đại nên đồ án nhiều hạn chế, dừng lại bước thu sản phẩm bán tinh khiết Kết đạt được: Đã Phân lập 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu địa điểm khác nhau, có chủng nấm mốc có khả phân giải tinh bột bao gồm chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 chủng khơng có khả phân giải tinh bột chủng M2, M6 Như vậy, chủng nấm mốc có khả tạo enzyme amylase, chủng nấm mốc khơng có khả tạo enzyme amylase - Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp ni cấy chìm 3.3 Kết xác định khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase Kết thí nghiệm xác định khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc cho thấy chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả tạo vòng phân giải tinh bột chủng: M2, M6 khơng có khả tạo vòng phân giải tinh bột Các chủng nấm mốc có khả phân giải tinh bột chúng có khả tạo enzyme amylase Nấm mốc tạo enzyme amylase phân giải liên kết 1,4 – glycoside chuỗi tạo thành dextrin phân tử thấp Dưới tác dụng enzyme amylase, tinh bột mơi trường nhanh chóng bị khả tạo màu với dung dịch iodine Như vậy, chủng nấm mốc: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 có khả tạo enzyme amylase chủng nấm mốc: M2, M6 khơng có khả tạo enzyme amylase Kết đo vòng phân giải tinh bột chủng nấm mốc theo Bảng 3.3: Bảng 3.3: Khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu STT Chủng Đường kính phân giải tinh bột (cm) M1 1,85 M2 - M3 2,25 M4 3,1 M5 1,55 M6 - M7 1,25 M8 2,6 M9 2,75 10 M10 2,1 11 M11 2,23 34 Qua kết thí nghiệm khả phân giải tinh bột chủng nấm mốc cho thấy chủng nấm mốc phân lập từ bánh men có đường kính phân giải từ 1,25 – 3,1 cm Trong có chủng nấm mốc khơng có khả phân giải tinh bột chủng M2 M6 Khả phân giải tinh bột chủng M4 lớn có vòng phân giải 3, cm, chủng M7 có khả phân giải tinh bột nhỏ nhất, vòng phân giải tinh bột 1,25 cm Chủng M4 chọn lọc để sản xuất enzyme amylase a Chủng M4 b Chủng M3 c Chủng M9 d Chủng M11 Hình 3.2: Khả phân giải tinh bột chủng M3, M4, M9, M11 35 e Chủng M6 f Chủng M7 Hình 3.3: Khả phân giải tinh bột chủng M6, M7 3.4 Kết thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc phương pháp ni cấy chìm 3.4.1 Điều kiện ni cấy Q trình ni cấy chìm phải đảm bảo nhiệt độ từ 23 đến 320 tốt 300 c nhiệt độ phòng, pH thích hợp mơi trường ni cấy pH=7 Trong q trình cấy giống cần lưu ý thao tác phải tiến hành tủ cấy cạnh đèn cồn Chuẩn bị 100ml môi trường erlen 250ml Đem tiệt trùng 121 0C 30 phút để nguội Cho 10ml nước cất vô trùng vào ống nghiệm giống nấm mốc, khuấy nhẹ để bào tử hòa nước Đổ toàn 10ml dịch ống nghiệm vào erlen 250ml có 100ml mơi trường Đặt erlen vào máy lắc có tốc độ 200 v/p ni 48 nhiệt độ phòng Sau đó, đem ly tâm, thu lấy dịch Dịch ni cấy có chứa enzyme hòa tan Bảo quản dịch ni cấy tủ lạnh 40C Dùng 200ml cồn 960 lạnh đổ từ từ vào 100ml dịch lọc enzyme làm lạnh, khuấy nhẹ để cồn hòa với dịch 36 enzyme Sau đó, để hỗn hợp vào tủ lạnh.Sau 24 giờ, hỗn hợp phân thành hai lớp Đem ly tâm để thu enzyme dạng tủa Enzyme dạng tủa chứa nhiều nước Nước tồn làm giảm hoạt tính enzyme Do đó, cần phải loại nước cách sấy nhiệt độ