BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHOTORHABDUS SPP VÀ XENORHABDUS SPP TỪ HETERORHABDITIS INDICA VÀ STEINERNEMA GUANGDONGENSE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: MSSV: 0851110063 PHẠM THỊ HƯƠNG Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU……………………………………………………………… 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nhiệm vụ nghiên cứu 1.4 Các kết đạt đề tài CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 11 2.1 Giới thiệu tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 11 2.1.1 Khái niệm EPN 11 2.1.2 Vai trò ưu EPN 11 2.2 Khái quát tuyến trùng ký sinh côn trùng 12 2.2.1 Phân loại 12 2.3 Khái quát vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus Xenorhabdus 14 2.3.1 Một số đặc điểm họ Enterobacteriaceae: 14 2.3.2 Phân loại Photorhabdus Xenorhabdus 15 2.3.3 Một số đặc điểm phân biệt 16 2.3.4 Một số yếu tố độc lực 25 2.4 Mối quan hệ cộng sinh 34 2.4.1 Vai trò tuyến trùng 34 2.4.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh 35 2.4.3 Tổng quát mối quan hệ tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 35 2.5 Khái quát loài côn trùng bị EPN vi khuẩn tiêu diệt 38 2.5.1 Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt 39 2.5.2 Các lồi trùng bị EPN tiêu diệt 39 2.5.3 Các lồi trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt 40 2.6 Tình hình nghiên cứu Photorhabdus Xenorhabdus giới Việt Nam 41 2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 42 2.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 45 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 3.1 Thời gian địa điểm Error! Bookmark not defined ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.1.1 Thời gian Error! Bookmark not defined 3.1.2 Địa điểm Error! Bookmark not defined 3.2 Vật liệu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Nguồn tuyến trùng EPN Error! Bookmark not defined 3.2.2 Nguồn vi sinh vật Error! Bookmark not defined 3.2.3 Môi trường nuôi cấy hóa chất sử dụng Error! Bookmark not defined 3.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phương pháp phân lập Error! Bookmark not defined 3.3.2 Hình thái Error! Bookmark not defined 3.3.3 Sinh lý Error! Bookmark not defined 3.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Error! Bookmark not defined 3.3.5 Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined 3.3.6 Hoạt tính sinh học Error! Bookmark not defined CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Kết phân lập hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined 4.2 Hình thái khuẩn lạc Error! Bookmark not defined 4.2.1 Quan sát khuẩn lạc Error! Bookmark not defined 4.2.1 Nhuộm Gram (quan sát vi thể) Error! Bookmark not defined 4.2.3 Nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined 4.3 Thử nghiệm sinh lý Error! Bookmark not defined 4.3.1 Di động Error! Bookmark not defined 4.4 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Error! Bookmark not defined 4.5 Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined 4.5.1 Kết thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined 4.5.2 Lên men lactose Error! Bookmark not defined 4.5.3 Indole Error! Bookmark not defined 4.5.4 Khử nitrate Error! Bookmark not defined 4.5.5 Phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined 4.5.6 Sinh H2S Error! Bookmark not defined 4.5.7 Thử nghiệm phân giải lipase Error! Bookmark not defined 4.5.8 Thử nghiệm phân giải protease Error! Bookmark not defined 4.6 Khả đối kháng với vi sinh vật gây hại hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4.6.1 Kết đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined 4.6.2 Kết đối kháng với nấm gây bệnh Error! Bookmark not defined CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị… 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT  BSL: Bướm sáp lớn  LB: Luria-Bertani  LPS: Lipopolysaccharide  EPN: Entomopathogenic Nematodes  HBHL: Hydroxybutanoyl homoserine lactone  IJs: Infective Juveniles  NBTA: Nutrient bromothymol blue agar  PDA: Potato glucose agar  QS: Quorum Sensing  TSA: Tryptone Soya Agar  VKCS: Vi khuẩn cộng sinh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng 13 Bảng 2.2 Phân loại chi Photorhabdus Xenorhabdus 15 Bảng 2.3 Đặc điểm phân biệt hai chi Photorhabdus Xenorhabdus 16 Bảng 2.4 Một số đặc điểm phân biệt hai pha sơ cấp thứ cấp Xenorhabdus / Photorhabdus 18 Bảng 2.6 Các đặc điểm sinh hóa Xenorhabdus Error! Bookmark not defined Bảng 2.7 Đặc điểm số loài Photorhabdus 23 Bảng 2.8 Đặc điểm số loài Xenorhabdus 24 Bảng 2.9 Các chất kháng sinh Photorhabdus 30 Bảng 2.10 Các chất kháng sinh Xenorhabdus 32 Bảng 2.11 Vòng đời tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh 38 Bảng 2.12 Các chế phẩm EPN Việt Nam 45 Bảng 3.1 Thành phần thuốc nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Thành phần thuốc thử thí nghiệm khả phân giải nitrate .Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Thành phần thuốc thử protease Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Quy ước đường kính vòng phân giải Error! Bookmark not defined Bảng 4.2 Khả phân giải protein P1 X1trên môi trường agar gelatin chicken offal Error! Bookmark not defined Bảng 4.3 Khả đối kháng chủng vi khuẩn khảo sát với Salmonella,E Coli, B subtilis Error! Bookmark not defined Bảng 4.4 Khả đối kháng chủng P1 X1 với Salmonella, E Coli, B subtilis, sau lần cấy chuyền thứ Error! Bookmark not defined Bảng 4.5 Kết đối kháng nấm Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ Error! Bookmark not defined Bảng 4.6 Kết đối kháng Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ bảy .Error! Bookmark not defined ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Vòng đời tuyến trùng thể trùng 14 Hình 2.2 Phân loại chủng Photorhabdus Xenorhabdus 16 Hình 2.3 Vai trò pha I 19 Hình 2.4 Vai trò pha II 19 Hình 2.5 Giả định khả gây độc X.nematophila 25 Hình 2.6 Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) 28 Hình 2.7 Các hướng ứng dụng vi khuẩn cộng sinh 42 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Error! Bookmark not defined Hình 3.2 Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Phân lập Xenorhabdus từ Steinernema guangdongense Error! Bookmark not defined Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc quan sát qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc quan sát kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined Hình 4.7 Hình thái tiên mao Error! Bookmark not defined Hình 4.8 Hình thái vi khuẩn nhuộm gram Error! Bookmark not defined Hình 4.9 Hiện tượng thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined Hình 4.10 Hiện tượng thử nghiệm di động đĩa thạch Error! Bookmark not defined Hình 4.11 Hiện tượng thử nghiệm di động ống nghiệm Error! Bookmark not defined Hình 4.12 Hiện tượng thử nghiệm lên men lactose Error! Bookmark not defined Hình 4.13 Hiện tượng thử nghiệm indole Error! Bookmark not defined Hình 4.14 Hiện tượng thử nghiệm khử nitrate Error! Bookmark not defined Hình 4.15 Hiện tượng thử nghiệm phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined Hình 4.16 Hiện tượng thử nghiệm sinh H2S Error! Bookmark not defined Hình 4.17 Hiện tượng phân giải lipase tween 20 Error! Bookmark not defined Hình 4.18 Hiện tượng phân giải lipase chicken offal Error! Bookmark not defined Hình 4.19 Hiện tượng phân giải gelatin P1 Error! Bookmark not defined ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 4.20 Hiện tượng phân giải gelatin X1 Error! Bookmark not defined Hình 4.21 Hiện tượng phân giải gelatin P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.22 Hiện tượng phân giải gelatin X1 Error! Bookmark not defined Hình 4.23 Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.24.Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với X1 Error! Bookmark not defined Hình 4.25.Thử nghiệm hoạt tính kháng E coli với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.26 Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.27 Thử nghiệm hoạt tính kháng B subtilis với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.29.Thử nghiệm hoạt tính kháng E coli với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.30 Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined Hình 4.31 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.32 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.33 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.34 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.35 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.36 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.37 Mẫu đối chứng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.38 Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined Hình 4.39 Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp Error! Bookmark not defined ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU oOo -1.1 Tính cấp thiết đề tài Ngày ngành nông nghiệp Việt Nam đà phát triển mạnh mẽ số lượng chất lượng, số mặt hàng nơng sản cà phê, lúa gạo có kim nghạch xuất cao có vị thị trường quốc tế Nhu cầu tăng sản lượng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đặt ra, đơi với ln đòi hỏi kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn Tuy nhiên riêng Việt Nam mà tất nước nơng nghiệp người nơng dân trang bị đầy đủ kiến thức sản xuất để đảm bảo tính bền vững Vì khơng nơi người nông dân sử dụng ạt loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học khơng hiểu biết hay biết tác hại cố ý sử dụng để tăng sản lượng, thu lợi nhuận Chính việc sử dụng mà không tuân thủ quy định liều lượng cách thức làm dịch bệnh trở nên nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp Không vậy, giới phải đối mặt với vấn đề nhức nhối tồn dư mức chất hóa học gây hại cho sức khỏe người sản phẩm nơng nghiệp Vì xu hướng sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học trở nên hữu ích tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho người, đồng thời tính an tồn môi trường cao Trong biện pháp sinh học sử dụng dùng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema Heterorhabditis nước giới Việt Nam đặc biệt ý Tuy nhiên, loài tuyến trùng EPN không thực phát huy hiệu khơng có mặt vi khuẩn cộng sinh ruột chúng, nguyên nhân gây chết côn trùng, gồm Photorhabdus Heterorhabditis Xenorhabdus Steinernema Với vai trò đặc biệt, hai lồi vi khuẩn trở thành mấu chốt mối quan hệ sâu hại – tuyến trùng – vi khuẩn Đây coi lồi vi khuẩn có đời sống đặc biệt cộng sinh vật chủ gây hại cho vật chủ khác thông qua vật chủ mà cộng sinh Mặt khác thấy khả kháng mạnh với loài vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc lồi nấm gây hại cho nơng nghiệp, điều mở ứng dụng lớn Tuy nhiên Việt Nam có số nghiên cứu Hà Nội có liên quan đến hai chi Photorhabdus Xenorhabdus, tỉnh thành miền Nam chưa có nghiên cứu vấn đề phân lập ứng dụng vi khuẩn cộng sinh Trong nghiên cứu sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm Heterorhabditis indica Steinernem guangdongense, giới Heterorhabditis indica ứng dụng rộng rãi tác dụng mang lại lĩnh vực bảo vệ thực vật Steinernema guangdongense loài tuyến trùng chưa có nghiên cứu lồi vi khuẩn cộng sinh với Vì lợi ích quan trọng loài vi khuẩn yêu cầu mở rộng kiến thức khoa học mà người tiến hành đề tài chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp : “Phân lập khảo sát hoạt tính sinh học Photorhabdus spp Xenorhabdus spp từ Heterorhabditis indica Steinernema guangdongense ” 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập chủng vi khuẩn thuộc hai chi Photorhabdus Xenorhabdus có khả đối kháng với vi sinh vật gây hại cho gia súc nông nghiệp Khi thành công đề tài đánh dấu cho triển vọng việc sử dụng vi khuẩn Xenorhabdus Photohabdus hoạt động sản xuất nông nghiệp đáp ứng u cầu sản xuất quy mơ lớn, nhanh chóng, hiệu cao 1.3 Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập chủng thuộc hai chi vi khuẩn Photorhabdus Xenorhabdus - Khảo sát khả đối kháng chủng phân lập với ba loài vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella loài nấm Phytophthora hai thời điểm cấy chuyền sau lần lần thứ cấy chuyền 1.4 Các kết đạt đề tài - Phân lập hai chủng vi khuẩn P1 X1 thuộc hai chi Photorhabdus Xenorhabdus ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vi khuẩn sử dụng Clarke Dowds (1995) cho thấy lip - sở hữu nội độc tố ảnh hưởng lên G mellonella Dunphy (1997) cho thấy chủng đột biến không độc (AV1) X nematophila sản xuất mức thấp lipase tiết phân tử tín hiệu hydroxybutanoyl homoserine lactone (HBHL), bổ sung HBHL từ Vibrio harveyi kích thích sản xuất lipase phục hồi tính độc AV1 Như lipase có khả liên quan đến việc gây độc tế bào vi khuẩn Protease đóng vai trò phá hủy protein sâu để cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn tuyến trùng tiết mức cao tế bào sơ cấp Photorhabdus Xenorhabdus tế bào thứ cấp hoạt tính protease thấp Wee (2000) tế bào thứ cấp P luminescens sản xuất protease khơng có tế bào thứ cấp Số lượng khác loại protease mức hoạt tính protease biến đổi cá nhân chủng 2.4 Mối quan hệ cộng sinh 2.4.1 Vai trò tuyến trùng Tuyến trùng đóng vai trò quan trọng tổ hợp cộng sinh Bao gồm: - Vector vận chuyển VKCS: Các IJs xâm nhập vào trùng chúng coi vector vận chuyển vi khuẩn vào Khi vào vật chủ côn trùng, tuyến tùy thẳng đến xoang máu trùng, giải phóng vi khuẩn qua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang máu côn trùng Tại vi khuẩn sinh sôi, tạo độc tố giết chết vật chủ - Bảo vệ VKCS: Vì vi khuẩn cộng sinh khơng thể tồn độc lập môi trường đất nên việc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh bọc ruột giúp bảo vệ tự nhiên Khi vào trùng vật chủ, theo phản xạ tự nhiên trùng tiết chất kháng thể để chống lại vi khuẩn cộng sinh, tuyến trùng tiết chất làm trung hòa làm tác dụng kháng thể (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 34 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.2 Vai trò vi khuẩn cộng sinh - Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Vi khuẩn cộng sinh tiết loại độc tố giết chết trùng cách nhanh chóng vòng 24 - 48 giờ, thời gian phụ thuộc vào tổ hợp tuyến trùng, vi khuẩn lồi trùng cụ thể - Cung cấp thức ăn cho tuyến trùng: Vi khuẩn cộng sinh sử dụng vi khuẩn cộng sinh chúng vừa giải phóng sau vào thể côn trùng Bằng cách IJs (tuổi 3) phát triển sang tuổi đạt trưởng thành Từ hệ thứ hai, tuyến trùng chuyển sang sử dụng dinh dưỡng mô côn trùng vi khuẩn cộng sinh hoạt hóa - Hoạt hóa xác chết trùng: Vi khuẩn cộng sinh tiết enzyme để hoạt hóa xác trùng thành dạng dinh dưỡng thích hợp cho tuyến trùng Đây nguồn thức ăn quan trọng để tuyến trùng sinh sản phát triển - Ngăn cản vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: Vi khuẩn cộng sinh sản sinh hoạt chất kháng sinh để ngăn loài nấm, vi khuẩn xâm nhập phát triển bên xác côn trùng 2.4.3 Tổng quát mối quan hệ tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn Mối liên hệ tuyến trùng vi khuẩn khái quát hóa qua ba giai đoạn sau: a) Giai đoạn I Tuyến trùng tồn dạng ấu trùng xâm nhiễm tuổi (IJs) bao bọc lớp vỏ cutin ấu trùng tuổi Đây hình thức tồn mà không cần đến dinh dưỡng, chúng tồn bền bỉ đất tìm vật chủ IJs Steinernema mang vi khuẩn bọng trước ống ruột, Ciche Ensign (2000) cho thấy Heterorhabditis mang vi khuẩn nằm rải rác ruột chủ yếu nửa trước ống ruột IJs tìm vật chủ theo hai hình thức: * Hình thức thứ nhất: Với hầu hết Heterorhabditis số lồi Steinernema có tập tính săn lùng vật chủ Nhờ khả nhận biết khí CO2 mà vật chủ thải giúp chúng định hướng mục tiêu di chuyển nhanh đến vật chủ * Hình thức thứ hai: Với hầu hết Steinernema chúng chỗ 35 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đất chờ vật chủ qua chúng công Sau tìm thấy vật chủ chúng vào thể vật chủ theo hai hình thức: * Hình thức thứ nhất: Heterorhabditis dùng mấu kitin dạng sừng gần miệng để đâm thủng biểu bì nơi xung yếu ranh giới đốt thể,sau trực tiếp vào xoang máu vật chủ * Hình thức thứ hai: Steinernema vào xoang máu vật chủ gián tiếp qua miệng, lỗ thở, hậu môn sau di trú vào xoang máu b) Giai đoạn II (sớm) Đây giai đoạn kết hợp việc phục hồi IJs, phóng thích vi khuẩn vào huyết tương giết chết vật chủ côn trùng Tuy nhiên đồng thời với việc xâm nhập IJs loạt phản ứng thể vật chủ côn trùng để chống lại tuyến trùng vi khuẩn Phản ứng tế bào để đáp lại thông qua tế bào máu để tiêu diệt vi sinh vật chế thực bào Khi mà sinh vật xâm nhập diện rộng (ở tuyến trùng) tế bào máu phối hợp với tạo thành lớp bao vây quanh sinh vật gọi nốt sần Cách khác tế bào máu hoạt hóa enzyme phenoloxidase tạo thành lớp melanin quanh vi sinh vật gây hại Và phản ứng miễn dịch dịch thể gồm sản xuất lyzozyme sản xuất pepetide kháng sinh cecropin * Phục hồi IJs: Trong huyết tương, tuyến trùng tồn dạng IJs tiếp tục phát triển Bước phát triển tuyến trùng gọi phục hồi IJs Heterorhabditis phục hồi phát triển thành dạng lưỡng tính, IJs Steinernema phát triển thành hai dạng giới tính rõ ràng * Gây bệnh: Đây yếu tố mấu chốt mối quan hệ cộng sinh tuyến trùngvà vi khuẩn, vi khuẩn sản xuất yếu tố độc tố gây chết côn trùng chuẩn bị cho bước 36 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Giai đoạn II (muộn) c) Trong giai đoạn phát triển mạnh vi khẩn đạt mật độ tế bào cao trình biến đổi sinh học xác trùng thành nguồn dinh dưỡng thích hợp cho tuyến trùng sinh sôi phát triển * Biến đổi sinh học xác côn trùng: Huyết tương nguồn dinh dưỡng phong phú cho phát triển vi khuẩn Gian đoạn bắt đầu sau khoảng 24 – 48 sau nhiễm, côn trùng bị khống chế hoàn toàn chất gây độc vi khuẩn sau bị phân hủy dần enzyme ngoại bào mà vi khuẩn tiết Ví dụ môi trường nhân tạo Photorhabdus Xenorhabdus sản xuất phức hợp protease, lipase, lecithinase, chitinase suốt giai đoạn tăng trưởng Ngoài P luminescens tiết metalloprotease điều kiện invitro invivo * Nâng đỡ phát triển tuyến trùng: Sản xuất enzyme phân giải thể côn trùng để lấy dinh dưỡng cho tuyến trùng nó: Khả sinh sôi tuyến trùng phụ thuộc vào diện vi khuẩn thể côn trùng Trong trường hợp Photorhabdus – Heterorhabditis cho thấy Heterorhabditis phát triển có Photorhabdus, điều cho thấy vai trò quan trọng việc chuyển hóa sinh học xác trùng Ở nghiên cứu khác, Steinernema sinh sơi dù khơng có diện Xenorhabdus, sinh sơi có hạn chế số lượng * Bảo vệ xác chết để tuyến trùng có nơi cư trú trì nguồn dinh dưỡng Phụ thuộc điều kiện nuôi cấy, thời gian hệ ấu trùng xâm nhiễm ngồi khoảng – 21 ngày sau chúng vào côn trùng Trong suốt thời gian điều quan trọng xác chết côn trùng phải bảo vệ khỏi sinh vật lạ Cả Photorhabdus Xenorhabdus sản xuất kháng sinh để chống lại loài sinh vật khác d) Giai đoạn III Giai đoạn trưởng thành IJs hình thành tập đồn IJs cộng sinh với vi khuẩn 37 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sự trưởng thành IJs: IJs sử dụng dinh dưỡng cung cấp để phát triển thành dạng thành trùng trưởng thành Hình thành tập đồn IJs: Khi phát triển đến trưởng thành thể vật chủ, tuyến trùng tiếp tục phát triển qua một, hai hay nhiều hệ tạo nhiều IJs sau kết thúc trình sinh sản vật chủ Sau IJs đồng loạt chui ngồi xác trùng phát tán vào môi trường đất xung quanh xác chết trở thành ấu trùng xâm nhiễm Bảng 2.11 Vòng đời tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh Giai đoạn Vòng đời tuyến trùng Vòng đời vi khuẩn Tuyến trùng nhiễm vi khuẩn nằm đất I Tìm vật chủ (cơn trùng) Xâm nhập vào xoang máu vật chủ Vi khuẩn giữ ruột tuyến trùng trùng Vi khuẩn phóng thích II (sớm) Phục hồi xoang máu vào huyết tương côn trùng Sản xuất yếu tố gây độc Làm chết côn trùng Vi khuẩn vào pha cân II (muộn) Sản xuất kháng sinh, enzyme Tuyến trùng sinh sôi ngoại bào, tinh thể protein Biến đổi sinh học xác sâu III Tuyến trùng phát triển Hình thành tổ hợp vi khuẩn ruột tuyến trùng 2.5 Khái quát lồi trùng bị EPN vi khuẩn tiêu diệt Côn trùng nguồn cung cấp dinh dưỡng phong phú gồm protein, lipid số thành phần khác, ngồi cung cấp chỗ trú ngụ tạm thời cho vài hệ tuyến trùng 38 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1 Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt Nếu nhiễm Steinernema xác chết có màu nâu nâu đen Nếu nhiễm Heterorhabditis da có màu đỏ đỏ gạch Da xác chết khơ dai, khơng có mùi thối 2.5.2 Các lồi côn trùng bị EPN tiêu diệt a) Sâu hại EPN có hiệu diệt trừ nhiều lồi sâu hại như: sâu khoang (Spodopetera litura); sâu keo da láng (S exigua); sâu keo (S mauritia); sâu xám (Agrotis ypsilon); sâu đo xanh (Plusia sp.); sâu đậu tương (Lamprosema indicata); sâu xanh (Helicoverpa armigera); sâu (Sylepta flava); sâu xanh bướm trắng ( Pieris rapae); sâu đơn (Parnara guttata); sâu tơ (Plutella xylostella) b) Bọ rầy Sùng bọ rầy lồi trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ sân golf nước Mỹ Hai loại tuyến trùng Steinernema Heterorhabditis thí nghiệm cách xịt lên sân cỏ cho thấy diệt 100% trùng diện sân cỏ Các loài S carpocapsae, S glaseri, S arenarium, H bacteriophora, H megidis c) Côn trùng họ Curculionidae cam qt Nghiên cứu phòng thí nghiệm, nhà kính, ngồi đồng với loại tuyến trùng S carpocapsae, S glaseri, S riobrave H bacteriophora cho thấy loại tuyến trùng diệt trừ phần tồn trùng gây hại cam quýt tiểu bang Florida d) Dế nhũi Dế nhũi côn trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ, sân đánh golf Nguyễn Smart, 1990 tìm loài tuyến trùng từ Brazil Uruguay đặt tên S scapterisci Loài tuyến trùng có khả ký sinh hầu hết lồi dế nhũi tiểu bang Florida tiểu bang Florida tiểu bang có khí hậu ấm miền nam nước Mỹ 39 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.3 Các lồi trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt Theo biểu mẫu patent số 6,048,838 ngày 11 tháng năm 2000, khái qt hóa lồi trùng mà Xenorhabdus tiêu diệt hặc gây ức chế phát triển Độc tố sử dụng tinh thể protein nặng 100 kDa gây độc đường miệng, lọc từ dịch nuôi cấy chủng thuộc X nematophila, X poinarii, X bovienii, X beddingii lồi Xenorhabdus khác Chúng dùng để chống lại trùng thuộc cánh cứng,bộ cánh vảy, hai cánh, ve bét a) Bộ cánh cứng Southern corn rootworm (sâu đục rễ ngô): Đây loại sâu đục thân hại rễ bắp, chúng tạo thành màu nâu rễ sau tượng thối rễ, dẫn đến giảm sản lượng Boll Weevil: Đây dạng mọt, chúng ăn nụ hoa Chúng coi nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề cho người nông dân miền Nam nước Mỹ vào năm 1920 – 1930 Wireworms: Loài chủ yếu công hạt ngô, họ bầu bí, rau,trước sau nảy mầm, chúng cư trú gốc làm giảm sản lượng chết Ngoài có số lồi:Pollen, Flea beetles, Seed beetles, Colorado potato beetle b) Bộ cánh vảy Beet armyworm: Chúng công làm giảm phát triển đậu, củ cải đường, khoai tây, cà chua, bơng, ngũ cốc, hạt có dầu, thuốc European corn borer: Chúng công thân ngô, cản trở vận chuyển nước dinh dưỡng làm trở nên yếu chết Và ngồi có:Tobaco hornworm, Tobaco budworm, cabbage looper, black cutworm, corn earworm, codling month, clothes moth, indian mealmoth, leaf rollers, cabbage worm, cotton bollworm, bagworm, eastern tent caterpillar, sod webworm, fall armyworm 40 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c) Bộ hai cánh Pea midge: Đây loại muỗi gây hại với hoa họ đâu, làm cho hoa bị hư thối Chúng phá hoại vỏ hạt, làm vỏ nhăn nheo, hạt bị teo lại Carrot fly: Là loại gây hại cho cà rốt, rau mùi, cần tây, chúng công tán làm héo đổi màu Ngồi có số loài khác:Cabbage root fly, turnip root fly, onion fly, crane fly, house fly nhiều loài mosquito khác d) Bộ ve bét Twoo-spotted spider mites: Đây loại nhện, chúng ăn non rau hay cảnh Strawbery spider mites: Chúng phá hoại dâu tây Ngồi có số lồi khác:Broad mites, citrus red mite, European red mite, pear rust mite tomato russet mite 2.6 Tình hình nghiên cứu Photorhabdus Xenorhabdus giới Việt Nam Hiện giới Photorhabdus Xenorhabdus hai chi vi khuẩn quan tâm tác dụng to lớn mà chúng mang lại Trong có hai hướng ứng dụng đặc biệt quan tâm bao gồm lên men Photorhabdus Xenorhabdus để sản xuất chế phẩm tuyến trùng EPN, hướng thứ hai quan trọng sản xuất chế phẩm để diệt nấm hại trồng, hướng thứ ba sử dụng lĩnh vực thú y Có thể thấy số nghiên cứu theo hai hướng nước 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vi khuẩn cộng sinh Tế bào Sản phẩm trao đổi chất Bảo vệ thực vật Sản xuất chế phẩm EPN Bảo vệ thực vật Thú y Đối kháng nấm hại Đối kháng vi khuẩn gây bệnh viêm vú bò sữa Hình 2.7 Các hướng ứng dụng vi khuẩn cộng sinh 2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới a) Phân lập vi khuẩn Có hai phương pháp phân lập ứng dụng rộng rãi gồm: * Phương pháp Poinar (1966) sử dụng trực tiếp ruột tuyến trùng để cấy lên môi trường phân lập * Cách thứ hai Akhurst (1980) ly tâm tuyến trùng gây nhiễm, thu dịch ly tâm cấy lên môi trường phân lập b) Phương pháp định danh * Phương pháp nuôi cấy: Điểm hình thái:  Nhuộm gram  Nhuộm tiên mao  Nhuộm tinh thể protein 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Quan sát môi trường nuôi cấy hình thái khuẩn lạc, khả tạo màng biofilm, độ đục, màu mơi trường Đặc điểm sinh hóa:  Khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ  Khả biến đổi chất khác nhờ hệ thống enzym  Nhu cầu oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu  Tính chất đối kháng nhạy cảm với chất kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất Đặc điểm sinh lý:  Khả di động, môi trường ni cấy, điều kiện sống hiếu khí, kỵ khí hay kị khí tùy nghi Kỹ thuật phân tử:  So sánh cấu trúc 16S rRNA vi khuẩn phân lập với trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA tương ứng ngân hàng gen quốc tế EMBL * Kết phân lập: Ở hầu hết nghiên cứu hình thái khuẩn lạc pha sơ cấp ghi nhận sau:  Khuẩn lạc bắt hấp thu màu đỏ nâu neutral red môi trường MacConkey agar hấp thụ màu xanh lục bromothymol blue môi trường NBTA  Tạo khuẩn lạc màu vàng sẫm, nâu sáng màu sữa môi trường NA Khuẩn lạc tròn, lồi, mép khơng * Kết định danh sơ bộ: Tính chất hình thái, sinh lý, sinh hóa, chủng lồi lồi có khác Các kết định danh sơ nhắc đến bảng 2.8 bảng 2.9 c) Bảo quản vi khuẩn 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có hai cách để bảo quản vi khuẩn Photorhabdus Xenorhabdus: * Cách thứ nhất: bảo quản ống thạch nghiêng chứa mơi trường NBTA MacConkey agar để nhanh chóng phát pha II để loại bỏ Các ống nghiệm cấy chuyền thường xuyên, lưu trữ 120C cấy chuyền hàng tháng 250C cấy chuyền hàng tuần * Cách thứ hai theo Akhusrt (1980), cách giữ vi khuẩn 17% môi trường dinh dưỡng Glycerol chai Martney giữ - 180C để sử dụng làm tan nhanh nước nóng 600C (Bedding, 1984) d) Nhân nuôi sinh khối với lượng lớn kết hợp với tuyến trùng để tạo chế phấm EPN Việc nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn quan tâm vai trò cơng tác bảo vệ thực vật Trong nhân ni tuyến trùng EPN mơi trường chicken offal Bedding tìm (1984) mơi trường đem lại hiệu cao nhất, môi trường sử dụng nhiều nghiên cứu thực tiễn Thành phần mơi trường lòng gà xay nhỏ hấp khử trùng, có bổ sung thêm bơng xốp Vi khuẩn nuôi môi trường YS để tăng sinh, Sau thời gian tăng sinh, vi khuẩn thêm vào mơi trường chicken offal để giúp thích nghi môi trường gia tăng mật độ tế bào Sau tuyến trùng bổ sung vào mơi trường chicken off có vi khuẩn để phát triển sinh sản e) Tiêu diệt nấm hại Có nhiều nghiên cứu vấn đề đối kháng nấm hại, nói đến nghiên cứu nhà khoa học M Inam – Ul – Haq cộng nghiên cứu khả diệt F oxysporum f.sp., lycopersici X.nematophila Xenorhabdus spp Có ức chế mạnh vi khuẩn với F oxysporum f.sp., lycopersici nồng độ tế bào vi khuẩn ức chế tốt × 107 tế bào/ml 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu khác X.L Fang cộng sử dụng X bovienii YL002 ức chế nấm Phytophthora capsici Botrytis cinerea Kết cho thấy X bovienii YL002 ức chế 98% phát triển Phytophthora capsici Botrytis cinerea f) Ứng dụng công tác thú y Theo nghiên cứu tác giả Furgani G cộng sử dụng 13 chủng từ loài X nematophila, X budapestensis X szentirmaii đối kháng với vi khuẩn gây bệnh viêm vú bò sữa gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Kết cho thấy KL Pneumoniae bị chủng Xenorhabdus kháng nhất, S aureus lại có độ nhạy cao với kháng sinh chủng Và lồi X szentirmaii X budapestensis sản xuất kháng sinh mạnh X nematophila Kết cho thấy triển vọng sử dụng kháng sinh từ Xenorhabdus để phòng trừ bệnh viêm vú bò sữa 2.6.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Tuy EPN vấn đề thu hút nhiều quan tâm giới khoa học giới Việt Nam có số nghiên cứu Hà Nội thành phố Hồ Chí Minh tỉnh miền Nam chưa có nghiên cứu hai vi khuẩn Thành tựu đáng ý PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu, công tác Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, phân lập 26 loài tuyến trùng 23 tỉnh thành Việt Nam, có lồi Heterorhabditis 24 lồi Steinernema.Trong có lồi Steinernema cơng bố loài khoa học Sau tiến hành tuyển chọn tìm chủng tốt để ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học với phổ diệt sâu rộng, sinh sản tốt cho sinh khối cao, bảo quản lâu dài 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.12 Các chế phẩm EPN Việt Nam Tên chủng EPN Loài tuyến trùng S-TK10 S loci BIOSTAR-1 15×106 S-CTL S carpocapsae BIOSTAR-2 10×106 S-TX1 S sangi BIOSTAR-3 10×106 S-XS4 S sangi BIOSTAR-4 10×106 S-TN10 S robustispiculum BIOSTAR-5 10×106 H-MP11 H indica NEMASTAR-1 15×106 H-NT3 H indica NEMASTAR-2 15×106 46 Tên chế phẩm Nồng độ IJs ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ oOo -5.1 Kết luận Phân lập hai chủng P1 từ Heterorhabditis indica, X1 từ Steinernema guangdongense nghi ngờ Photorhabdus Xenorhabdus Các thử nghiệm hình thái tế bào cho thấy X1 P1 có hình thái mơ tả trước gồm đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, có mặt tiên mao Thử nghiệm sinh lý cho thấy di động bề mặt thạch ống nghiệm thí nghiệm trước Qua việc phân lập lại mơi trường MacConkey, soi khuẩn lạc nhuộm Gram cho thấy giống đảm bảo tinh khiết, không bị nhiễm tạp Thử nghiệm sinh hóa với chủng P1 hoàn toàn giống với kết luận trước, nhiên X1 có thử nghiệm catalase âm tính khơng giống với thử nghiệm trước Hoạt tính sinh học cho thấy P1 đối kháng tốt với loài vi khuẩn thử nghiệm nấm Phytophthora, nhiên khả kháng giảm lần cấy chuyền thứ Ở X1 khả kháng vi khuẩn thử nghiệm yếu, kháng mạnh với nấm Phytophthora, khả kháng giảm đáng kể lần cấy chuyền thứ Điều cho thấy việc ứng dụng hai chủng phân lập P1 X1 vào đối kháng với nấm Phytophthora gây hại trồng Như hai chủng vi khuẩn P1 X1 phân lập vi khuẩn cộng sinh thuộc hai chi Photorhabdus Xenorhabdus sử dụng cho nghiên cứu 5.2 Kiến nghị Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra khẳng định hai chủng P1 X1 phân lập Đồng thời khảo sát tìm phương pháp giữ giống tối ưu để lưu trữ hai chủng Khảo sát tăng trưởng hai chủng theo pH, nhiệt độ, thành phần mơi trường ni cấy để tìm điều kiện thích hợp cho phát triển hai chủng 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tìm mơi trường nhân tạo thích hợp để kết hợp tuyến trùng vi khuẩn nhằm tạo điều kiện cho việc tạo chế phẩm EPN Chọn môi trường tối ưu cho hai chủng phân lập sinh kháng sinh tốt nhằm ứng dụng lĩnh vực bảo vệ thực vật thú y 48 ... thức khoa học mà người tiến hành đề tài chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp : Phân lập khảo sát hoạt tính sinh học Photorhabdus spp Xenorhabdus spp từ Heterorhabditis indica Steinernema guangdongense. .. Dương tính Âm tính Hoạt tính kháng khuẩn Dương tính Âm tính Photorhabdus Sinh trưởng tuyến Tuyến trùng sinh trưởng Nhân giống tuyến trùng trùng nhân ni vi tốt, tăng nhanh kích thước, khó khăn, sinh. .. cộng sinh 42 Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Error! Bookmark not defined Hình 3.2 Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Phân lập Xenorhabdus