BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MƠI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GÓP PHẦN XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP LACTASE Ngành : Công nghệ Sinh học Mã ngành : 111 GVHD : PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : PHẠM NGUYÊN HIẾU MSSV : 0851110082 Lớp : 08DSH2 -Tp.HCM, tháng năm 2012- Chương MỞ ĐẦU Xu hướng người ngày quay sử dụng sản phẩm mang tính thiên nhiên, khai thác kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật đại hạn chế tối đa việc đưa hoá chất vào thể Đặc biệt sản phẩm thực phẩm có bổ sung chủng vi sinh vật giúp người tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá giúp chống lại nhiều bệnh tật phát sinh từ bên thể Tuy nhiên sản phẩm thực phẩm thuốc, mà xếp vào nhóm thực phẩm chức Chính lợi ích theo quan điểm phòng bệnh chữa bệnh, nước phát triển có xu hướng sử dụng loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiều sử dụng thuốc điều trị Sữa thực phẩm trẻ em người già, thói quen khơng sử dụng sữa nên enzyme lactase bị dần, dẫn đến bệnh không dung nạp lactose Sự thiếu hụt lactase phổ biến rộng rãi toàn giới Trong thể người, lactase hoạt động khoảng năm năm Ở Bắc Châu Âu người sống phía Tây Bắc tiểu lục địa Ấn Độ, lactase có xu hướng bảo tồn người lớn, việc sử dụng sản phẩm từ sữa mát suốt mùa đông nguồn cung cấp lương thực bị hạn chế Chúng ta kết luận việc thiếu hụt lactase (được gọi không dung nạp lactose alactasia) bệnh, tồn lưu lactase vào tuổi trưởng thành thích ứng sinh học với việc sử dụng sản phẩm từ sữa Lactase enzyme tìm thấy mép ruột non Nó phân hủy lactose thành đường glucose galactose Tần số thiếu hụt lactase toàn giới khác Mức độ lactase ruột triệu chứng khơng có hòa hợp Hình ảnh điển hình khó chịu sau dùng sữa sản phẩm từ sữa Điều thấy từ việc bị đau bụng, buồn nôn, cảm giác đầy ngắn, nhanh, chảy nước mắt tiêu chảy [57] Khi bị tiêu chảy, tác nhân gây bệnh độc tố chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị đi, hậu đường lactose khơng tiêu hố tích luỹ lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy [57] Ngồi ra, trình trạng hấp thu lactose bệnh đường tiêu hóa số quốc gia xác, gây hấp thu lactose - hội chứng ruột ngắn, hấp thu đường galactose bẩm sinh Trong thực tế, trạng thái bất thường sai lệch việc trì hoạt động lactase suốt giai đoạn trưởng thành Có nguyên nhân dẫn đến bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứ phát, (C) bẩm sinh [58] (A) Nguyên phát: Đây nguyên nhân thường gặp bất dung nạp lactose thiếu lactase tương đối, xuất trẻ em vào độ tuổi khác nhóm chủng tộc khác (B) Thứ phát: Do tổn thương ruột non sau viêm dày ruột siêu vi (Rotavirus), trẻ bị bất dung nạp lactose thống qua, hồi phục sau vấn đề bệnh viêm dày ruột giải trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tổn thương, men lactase không sản sinh đủ nên thể trẻ hấp thu lactose dẫn đến triệu chứng bất dung nạp Khi khiến cho tình trạng tiêu chảy kéo dài trầm trọng trẻ bị suy dinh dưỡng Khi trẻ bị suy dinh dưỡng lượng men lactase giảm, suy dinh dưỡng tiêu chảy vòng luẩn quẩn khó giải (C) Bẩm sinh: Nguyên nhân gặp, biểu sau sinh rối loạn nhiễm sắc thể, gây ngăn cản sản xuất men lactase Trong hệ tiêu hóa có hệ vi sinh vật với số lượng lớn, có 400 lồi vi sinh vật khác (Melissa peterson et al., 2002), chúng xếp vào loại: vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có ích Các lồi vi sinh vật sống chung với tạo thành hệ sinh thái ổn định, cân hàng rào bảo vệ, giúp thể chống lại tác nhân gây bệnh đường ruột trì số hoạt động chuyển hóa thể Vi sinh vật có ích nhiều thể khỏe mạnh Để tăng dung nạp lactose sữa, lý tưởng tăng sinh tổng hợp enzyme thể người Tuy nhiên đường khó khăn Enzyme từ nguồn vi sinh vật nhu cầu trước mắt Do lựa chọn nguồn enzyme vi sinh hiệu nhiên phải chọn loại enzyme có hoạt động pH tối ưu tương tự sữa để tránh tượng đông tụ sữa Trên giới, lactase nghiên cứu đầy đủ sản phẩm lactase thương mại chủ yếu sản xuất từ nấm men Các loài nấm men Kluyverromyces lactics, Kluyverromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candida pseudotropicalis Ngồi lactase sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus vi khuẩn Gram âm E.coli ), nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp)… Trong Việt Nam, việc nghiên cứu enzyme lactase chưa thật quan tâm nhiều hạn chế Đề tài: “Góp phần xây dựng sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase” - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn - Định danh chủng vi khuẩn - Kiểm tra hoạt tính enzyme lactase chủng vi sinh vật phân lập - Bước đầu bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase Chương TỔNG QUAN 2.1 Enzyme lactase 2.1.1 Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl –(1Ỉ 4)-α-D-glucopyranose) đường đơi có động vật có vú, ngoại trừ vài lồi, nồng độ khoảng – 10% Hàm lượng lactose trung bình sữa bò khoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008) Trong trình sản xuất phomai, phần lớn lactose sữa có dịch whey Khác với trước đây, whey không xem phụ phẩm Ngày nay, whey sử dụng hiệu Whey sấy khơ để sản xuất loại bột whey khác phân đoạn kỹ thuật lọc màng để sản xuất sản phẩm whey protein phần qua màng giàu lactose (theo Fox 2009; Lifran, 2009) Lactose loại đường có nhiều sữa Để thể hấp thu đường lactose phải phân tách thành đường glucose galactose trước Quá trình xảy phần ruột non men lactase Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật thể thiếu men lactase để chuyển lactose thành hai loại đường trình bày Nếu thiếu men lactase ruột non đường lactose khơng phân tách khơng hấp thu vào máu mà bị tồn đọng ruột, dẫn đến rối loạn tiêu hóa, gọi bất dung nạp đường lactose Đây nguyên nhân làm cho ta không uống sữa Nhiều người nhầm lẫn bất dung nạp đường lactose dị ứng sữa Bản chất dị ứng sữa hệ miễn dịch thể phản ứng với protein có sữa dẫn đến rối loạn Lactase mã hóa locus gen nhiễm sắc thể số 2, thể độc quyền ruột động vật có vú nhỏ, mức độ thấp ruột kết trình phát triển thai nhi Con người sinh với mức lactase cao Sau cai sữa gen sinh tổng hợp lactase trạng thái bất hoạt lactase ruột non giảm Việc giảm lactase đồng nghĩa với việc gây triệu chứng phổ biến không dung nạp hypolactasia không dung nạp lactose Bất dung nạp đường lactose không liên quan đến hệ miễn dịch, thể thiếu lactase để tiêu hóa lactose lactose bị tống dạng tiêu chảy Ở người, vấn đề khó khăn tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, độ tuổi thiếu niên chiếm khoảng 70% số thiếu niên giới (Paige 2005) Enzym thương mại có xu hướng phát triển mạnh, β-galactosidase cho phép sản xuất sản phẩm chứa hàm lượng lactose thấp (Gekas Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama Amach 1999; Rehman 2009) Khi đó, lactose hòa tan ngọt, thủy phân lactose làm giảm tinh thể lactose sản phẩm giàu lactose trình bảo quản làm tăng độ (Gekas Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama Amachi 1999; Rehman 2009) 2.1.2 Lactase chức Enzyme thủy phân lactose có tên lactase thuộc nhóm β-galactosidase (E.C.3.2.1.23) Enzyme có hoạt tính chủ yếu thủy phân liên kết β 1-4 glucosidic phân tử đường đôi lactose để tạo thành phân tử đường đơn có độ cao đường lactose Do vậy, enzyme lactase chủ yếu sử dụng công nghiệp sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, thành phần cacbonhydrat sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả dung nạp đặc biệt số người lớn kể trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose Hơn nữa, phân tử lactose dễ dàng bị kết tinh dạng hạt cát nhiệt độ lạnh nên gây khó khăn cho sản xuất số sản phẩm sữa lạnh kem, người ta sử dụng enzyme để giảm hàm lượng lactose đồng thời tăng độ sản phẩm nhờ đường đơn tạo thành [49] Enzyme lactase số trường hợp có hoạt tính transgalactosyl hóa, trước tiên enzyme phá vỡ liên kết β 1-4 glucosidic tạo thành galactosyl sau chuyển cho phân tử hợp chất chứa nhóm hydroxyl Do người ta sử dụng hoạt tính để tổng hợp galactooligosaccharide, có hoạt tính dược học [49] Lactase tìm thấy nhu động ruột non người động vật, số thực vật (dưa hấu, trái mơ…) vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm sợi) Tùy theo nguồn gốc lactase có kích thước phân tử khác nhau, chuỗi peptide (tiểu phần theo cấu trúc bậc 4) dài ngắn số lượng khác Mặc dù chuỗi peptide mang hoạt tính lactase thơng thường có trọng lượng phân tử khoảng 120kDa chứa tâm xúc tác tâm có cấu trúc tương tự lồi (được bảo tồn qua tiến hóa) vai trò khơng thể thay “tay” Glu phản ứng xúc tác axit – base cơng vào nhân [49] Hình 2.1 Enzyme lactase ruột non người [53] Hoạt tính phân hủy lactose xác định cách, thông qua chất lactose, thông qua tạo thành sản phẩm đặc trưng phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng chất đặc hiệu ONPG (onitrophenyl-β-D-glucoside) xác định lượng ONP (o-nitrophenyl) tạo thành [49] Các lactase khác có dải hoạt động pH từ axit yếu đến trung tính từ khoảng 4.0 – 6.5 tùy thuộc vào nguồn gốc Lactase nấm sợi có pH hoạt động gần axit hơn, lactase vi khuẩn nấm men ưa pH gần trung tính [49] Bảng 2.1 Một số đặc trưng chuỗi peptide đóng vai trò xúc tác enzyme lactase số loài vi sinh điển hình Nguồn gốc enzyme K.lactic E.coli E.coli A.niger Trọng lượng phân tử 117618 116351 118016 119160 Chiều dài 1025 1023 1031 1006 Nguyên tử proton Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/bazơ Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 [49] Phần lớn lactase hoạt động khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình), số khác từ 45-650 C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác nhiệt độ lạnh 40C Dưới tổng hợp số đặc tính lactase từ nguồn vi sinh vật khác (Bảng 2.2) Đặc biệt số enzyme đòi hỏi ion kim loại để hoạt hóa [49] Người động vật có khả dung nạp lactose thời kỳ trẻ sinh, ruột non có khả tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose sữa mẹ, thành phần cho trẻ sinh trưởng Đến tuổi trưởng thành gen ngưng hoạt động thể tiêu hóa lactose Điều cho động vật Nghiên cứu dung nạp latose hỗ trợ hệ vi sinh niêm mạc ruột non, có vai trò vi sinh vật lên men lactose Lactococcus Bifidobacterium Đây sở việc đưa vi sinh vật vào số dòng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa [49] Bảng 2.2 Một số đặc trưng enzyme lactase số lồi vi sinh điển hình Nguồn Giá trị pH Giá trị nhiệt Tối ưu độ tối ưu Trọng lượng phân tử Hoạt hóa ion Chú Chú thích khác A.niger 3,0-4,0 55-60 124 A.oryzae 5,0 50-55 90 Mn+2 , K+ K.fragilus 6,9-7,3 37 201 Mn+2 , Na+ K.lactic 7,2 35 135 K+ , Na+ E.coli 6,2-7,1 40 540 L.thermophilus 3,4-4,3 55-57 530 C.inaegualis 6,0 30-55 Hoạt động cao B.circulans 6,8 60-65 sữa không béo Bacillus sp 6,5-7,5 65 L.bulgaricus 42-45 S.thermophilus 55 500-600 [49] 2.1.3 Cơ chế, cấu trúc q trình sinh tổng hợp Lactase thủy phân loạt chất Trong đáng ý lớp enzyme β –galactosidase, lactase có glucosidase glycosylceramidase hoat động Trong trình trao đổi chất, β-glycosidic D-lactose thủy phân để tạo thành D-galactose, D-glucose, hấp thu qua thành ruột vào máu Phản ứng xúc tác lactase tổng thể : C 12 H 22 O 11 + H O → C H 12 O + C 6H 12 O + Q Lactase xúc tác chuyển đổi phlorizin phloretin glucose Cơ chế xúc tác thuỷ phân lactose D – giữ lại cấu hình chất anomeric sản phẩm Trong chi tiết chế không chắn, để đạt phải thông qua phản ứng chuyển đổi Các nghiên cứu lactase vi khuẩn E.coli đề xuất rằng: trình thủy phân bắt đầu tác nhân nucleophin glutamate cơng enzyme từ phía bên trục carbon galactosyl β-glycosidic Vì Mg phụ thuộc vào axit xúc tác nên việc loại bỏ nhóm rời D-glucose thuận lợi, enzyme giải phóng từ phân nửa α-galactosyl công nucleophin sản xuất Dgalactose Hình 2.2 Cơ chế thủy phân lactose [54] Các nghiên cứu chất chứng minh 3’-OH 2’-OH vòng galactopyranose cần thiết để thủy phân enzyme Nhóm 3'- hydroxy tham gia từ ban đầu nhóm 2’ khơng cần thiết, cần thiết bước Điều chứng minh thực tế 2-deoxy chất ức chế cạnh tranh hiệu (K i= 10mM), loại bỏ nhóm hydroxyl phân nửa glucopyranose, khơng hồn tồn loại bỏ chất xúc tác Pre-pro-lactase có cấu trúc polypeptide bao gồm 1927 axit amin chia thành nhánh: (1) 19 amino axit chia tín hiệu theo thứ tự, (2) chuỗi miền lớn không diện lactase giai đoạn trưởng thành, (3) phân khúc lactase giai đoạn trưởng thành, (4) mảng trải dài kị nước, (5) đoạn ngắn ưa nước cacboxyl cuối Chuỗi tín hiệu phân tách lưới nội chất, pro-LHP đạt chiều dài 215kDa chuyển sang máy Golgi, nơi có nhiều glycoxyl hóa protein thủy phân Các prodomain hiển thị để hoạt động chaperone intramolecular ER, ngăn ngừa phân tách trypsin cho phép LPH áp dụng cấu trúc 3-D cần thiết để vận chuyển đến máy Golgi Hình 2.3 Quá trình sản sinh lactase người [54] 2.1.4 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase sinh tổng hợp số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulautilis sp, Torulopsis spherica, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis) Ngồi ra, có vi khuẩn Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, nhóm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917 Bên cạnh nấm sợi quan tâm nhiều (Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp) loài Aspergillus sp nghiên cứu nhiều Tuy nhiên q trình tổng hợp lactase quy mơ nghiên cứu quy mô sản xuất chủ yếu từ nấm men Kluyveromyces vi khuẩn lactic Các enzyme lactase sinh tổng hợp bao gồm ngoại bào nội rác bào tử bắt màu xanh thuốc nhuộm malachite (hình 4.4), đồng thời sử dụng vi khuẩn E.coli không sinh bào tử để làm đối chứng âm (hình 4.5) Nhuộm bào tử, ngồi việc xác định chủng có khả vi khuẩn lactic, ta loại bỏ mầm bệnh có khả sinh bào tử ví dụ Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, vi khuẩn hình que, Gram dương có khả sinh bào tử Từ chủng Gram dương, tiến hành nhuộm bào tử mẫu vi khuẩn (hình 4.6) sau so sánh với đối chứng thu kết thể bảng 4.4 Kết quả: Các tế bào chủng sau nhuộm bắt màu đỏ thuốc nhuộm bổ sung Như vậy, tất chủng vi khuẩn không sinh bào tử Hình 4.4 Vi khuẩn Hình 4.5 Vi khuẩn E.coli Bacillus subtilis sinh bào tử khơng sinh bào tử Hình 4.6 Mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 4.2.3 Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, lồi có enzyme catalase vi khuẩn có khả chuyển hóa H2O2 thành H2O O2 cho H2O2 lên sinh khối chúng có tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình 4.8) Theo khóa phân loại Bergey vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta loại số vi khuẩn gây bệnh có mặt sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính Staphylococcus vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus, Corynebacterium spp…là vi khuẩn gây nhiễm trùng E coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa 59 Kết : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối chủng vi khuẩn, tất chủng không tạo bọt (O2) chứng tỏ chúng hệ enzyme catalase (hình 4.7) Như vậy, chủng cho catalase âm tính Hình 4.7 Mẫu vi khuẩn phân lập Hình 4.8 Chủng Bacillus subtilis có catalase âm tính có catalase dương tính 4.2.4 Thử nghiệm tính sinh acid lactic thuốc thử Uffelmann Điều kiện tiên vi khuẩn lactic chúng phải có khả sinh axit lactic, để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm chủng vi khuẩn có sinh axit lactic hay không thuốc thử Uffelmann Sử dụng chủng Bacillus subtilis không axit không làm đổi màu tím thuốc thử, làm đối chứng âm (hình 4.9) Từ chủng qua chọn lọc thử nghiệm catalase, lấy khuẩn lạc cho lên miếng kính lame, sau cho trực tiếp thuốc thử lên khuẩn lạc cho vào dịch lên men môi trường MRS chủng vi khuẩn Quan sát thấy tất mẫu vi khuẩn phân lập làm đổi màu thuốc thử từ màu tím sang màu vàng (hình 4.10) Kết quả: tất chủng vi khuẩn có khả sinh axit lactic Điều thể qua mùi axit đặc trưng sinh tất môi trường sau cấy vi khuẩn 24 60 Hình 4.9 Vi khuẩn Bacillus Hình 4.10 Chủng vi khuẩn subtilis khơng sinh axit phân lập có sinh axit 4.2.5 Thử nghiệm khả di động phương pháp thạch mềm Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng có khả di động, mơi trường thạch mềm, chúng phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy không mọc theo vết cấy, tạo thành vệt mờ đục môi trường đem so sánh với mơi trường chưa cấy vi khuẩn (ống hình 4.11) Vi khuẩn lactic vi khuẩn kỵ khí chịu oxy nên chúng vừa phát triển phía vừa phát triển sâu mơi trường chủng khơng có tiêm mao, chúng tăng sinh khối theo vết cấy chúng khơng có khả di chuyển, ta thấy vệt thẳng theo vết cấy (ống hình 4.11) Khi ta ủ vi khuẩn qua ngày, ống nghiệm bịt kín nên khí sinh đẩy phần thạch trồi lên so với đáy ống Cho nên việc xác định vi khuẩn có khả di động hay khơng ta xác định số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh hay yếu Trong hình 4.11 vi khuẩn từ ống sinh khí mạnh ống Kết thử nghiệm tính di động chủng qua định tính acid lactic dương tính Quan sát vết cấy so sánh với môi trường đối chứng, tất chủng mọc theo vết cấy ko làm đục môi trường xung quanh Như chủng khơng có khả di động 61 Ống Ống Ống Ống Hình 4.11 Kiểm tra tính di động vi khuẩn phân lập (Ống 1: Ống môi trường không cấy vi khuẩn, Ống 2: Vi khuẩn khơng có khả di động, Ống 3;4: Vi khuẩn khơng di động có sinh khí) Thơng qua bước kiểm tra mục 4.2, tất chủng vi khuẩn Gram dương phân lập mang đặc điểm chung vi khuẩn lactic mô tả Bergey’s manual như: khơng sinh bào tử, catalase âm tính, sinh axit lactic không di động Như vậy, trường hợp từ việc chọn nguồn phân lập đảm bảo chắn có chứa vi khuẩn lactic mong muốn, việc chọn khuẩn lạc đặc trưng nhuộm Gram để loại bỏ vi khuẩn Gram âm bước làm tăng lên nhiều khả thu nhận nguồn vi khuẩn lactic Mặc dù trình tự bước kiểm tra có khác biệt so với trình tự kiểm tra đồ án phân lập khóa trước chung mục đích nhằm sàng lọc vi khuẩn lactic Đến ta xem hoàn tất việc phân lập chủng vi khuẩn lactic, ta tiến hành kiểm tra khả lên men đường khả sinh khí chủng so sánh với khóa phân loại Bergey để định danh chúng đến cấp giống 4.2.6 Thử nghiệm khả sinh H2O2 H2O2 chất sinh trình lên men góp phần vào khả kháng khuẩn LAB Khảo sát khả tạo H2O2 chủng vi khuẩn phân lập giúp ta hiểu rõ thêm chế kháng khuẩn chúng 62 Sử dụng mơi trường khơng cấy vi khuẩn có bố sung vài giọt H2O2 làm đối chứng dương (ống nghiệm hình 4.12) chủng vi khuẩn sau ni ủ 24 MRS broth tiến hành kiểm tra, quan sát đổi màu dung dịch ghi nhận kết Kết : dịch nuôi ủ chủng vi khuẩn không đổi màu, khơng có chủng có khả sinh H2O2 I II Hình 4.12 Kiểm tra khả sinh H2O2 (I: Mơi trường khơng cấy vi khuẩn có bổ sung H2O2, II: môi trường nuôi cấy vi khuẩn không sinh H2O2) Tuy chủng không sinh H2O2 chúng có khả kháng khuẩn ngồi H2O2 có hợp chất khác tham gia tạo nên hoạt tính kháng khuẩn như: acid hữu cơ, bacteriocin, CO2, diacetyl, Trong trường hợp khả kháng khuẩn nhờ vào H2O2 chủng vi khuẩn bị loại trừ 4.2.7 Thử nghiệm khả kháng vi sinh vật phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn * E.coli Bảng 4.3 Khả sinh kháng sinh kháng E.coli chủng vi khuẩn phân lập 63 Hoạt tính kháng khuẩn STT Chủng L1 2,5 L2 L3 4 L4 5 L5 4,67 L6 L7 (D-d, mm) Hình 4.13 Hoạt tính kháng E.coli chủng vi khuẩn phân lập Qua thử nghiệm này, xác định chủng có khả kháng E.coli Trong chủng phân lập, có chủng có khả kháng khuẩn cao L4; L6; L7, chủng có khả kháng khuẩn thấp L1 Tuy nhiên, nhìn chung khả sinh kháng sinh kháng E.coli chủng yếu (< 10mm) (Bảng 4.3) 4.2.8 Thử nghiệm khả lên men đường sinh khí Tất chủng phân lập tiến hành test thử nghiệm với 49 loại đường thông qua Kit API 50 CHL V5.1 Kết cho thấy chủng len men tốt loại đường phổ biến: ribose, galactose, glucose, fructose, mannose, manitol, sucrose, lactose sinh khí mạnh (2/3 ống Durham) nên chủng chủng lên men lactic dị hình Ngồi ra, chủng lên men tốt số loại đường khác ( Phụ lục 2) 64 4.2.9 Kết định danh Kit Tổng cộng có chủng phân lập từ sữa chua, nem chua, nước cải chua, chúng định danh Kit API 50 CHL V5.1 Trong có lồi Lactobacillus loài Lactococcus Chủng L1, L2, L3, L4 phân lập từ sữa chua, chủng L5 phân lập từ nem chua, chủng L6, L7 phân lập từ nước cải chua Chương trình nhận dạng APIwedTM cho thấy mức độ giống chủng L1 với chủng Lactobacillus brevis có độ tương đồng (99,9%), chủng L2 với chủng Lactobacillus plantarum có độ tương đồng (98,9%), chủng L3 với chủng Lactobacillus casei có độ tương đồng (99,1%), chủng L4 với chủng Lactococcus raffinolactis có độ tương đồng (99,9%), chủng L5 với chủng Lactococcus lactis spp lactis có độ tương đồng (99,4%), riêng chủng L6; L7 có mức độ tương đồng với chủng Lactobacillus acidophilus có độ tương đồng (99,5%) nên từ chủng phân lập ta rút xuống chủng, có chủng có khả sinh tổng hợp lactase (L2, L3, L4, L5, L6) Tất chủng chủng có lợi sử dụng nhiều thực phẩm lên men như: chủng Lactobacillus plantarum thường sử dụng sản xuất nem chua, chủng Lactobacillus casei sử dụng sữa lên men sống Kết thu nghiên cứu góp phần hỗ trợ phục hồi loài Lactobacillus Lactococcus báo cáo trước (Gronlund et al, 1999; Ahrne et al, 2005) 65 66 Bảng 4.4 Bảng tổng hợp kết định danh 67 4.2.10 Sàng lọc hoạt tính lactase Bảng 4.5 Hoạt tính enzyme lactase chủng vi khuẩn Kí Tên chủng hiệu Sinh khối Test khơ (g/l) ONPG Hoạt tính enzyme/g sinh khối khơ L1 Lactobacillus brevis 0,0804 - - L2 Lactobacillus plantarum 0,0766 + 560 U/g L3 Lactobacillus casei 0,0912 ++ 975 U/g L4 Lactococcus raffinolactis 0,0643 + 640 U/g 0,0648 + 560 U/g 0,0941 ++ 2615 U/g L5 L6 Lactococcus lactis spp Lactic Lactobacillus acidophilus Biểu đồ 4.1 Hoạt tính lactase chủng vi khuẩn phân lập Để đánh giá khả sinh lactase chủng vi khuẩn tuyển chọn, ta tiến hành xác định hoạt tính enzyme lactase Kết trình bày bảng 4.5 biểu đồ 4.1 Cụ thể là: chủng Lactobacillus brevis có lượng sinh khối khơ 0,0804 g/l khơng thể hoạt tính enzyme lactase với chất ONPG Chủng Lactobacillus plantarum có lượng sinh khối khơ 0,0766 g/l hoạt tính enzyme 560 U/g Chủng Lactobacillus casei có lượng sinh khối khơ 0,0912 g/l hoạt tính enzyme 975 U/g Chủng Lactococcus raffirolactis có lượng 68 sinh khối khơ 0,0643 g/l hoạt tính enzyme 640 U/g Chủng Lactococcus lactis spp lactis có lượng sinh khối khơ 0,0648 g/l có hoạt tính enzyme 560 U/g Chủng Lactobacillus acidophilus có lượng sinh khối khơ 0,0941 g/l có hoạt tính enzyme 2615 U/g Theo kết ta thu được, chủng Lactobacillus plantarum chủng Lactococcus lactis spp lactis có hoạt tính enzyme thấp tương đương nhau, hoạt tính enzyme 560 U/g chủng Lactobacillus casei chủng Lactobacillus acidophilus thể hoạt tính enzyme mạnh hơn, chủng Lactobacillus casei 975 U/g chủng Lactobacillus acidophilus 2615 U/g Riêng chủng Lactobacillus acidophilus mà chúng tơi phân lập có hoạt tính enzyme tương đối cao So với kết công bố như: Chang B.S cộng tác viên (1989) tinh lactase từ Streptococcus salivarius phân nhánh thermophilus đến với mức độ 109 lần so với ban đầu hiệu suất 41% thu hoạt tính 592000 U/g protein 370C; nghiên cứu khác Ấn Độ thực M.V Ramana Rao S.M Dutta (1977) (Sở Vi Sinh Vật học, Viện nghiên cứu sữa quốc gia Ấn Độ) sinh tổng hợp lactase từ chủng Streptococcus cremoris (H) có hoạt tính lactase 5905 U/g (300C-370C) 6190 U/g (450C), chủng Lactobacillus bulgaticus (RTS) có hoạt tính lactase 1340 U/g (300C-370C) 1430 U/g (450C), chủng Leuconostoc citrovorum (8081) có hoạt tính lactase 1702 U/g (300C-370C) 1764 U/g (450C) Các chủng vi sinh vật mà phân lập có hoạt tính enzyme chênh lệch nhau, tác động môi trường nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, di truyền chủng ảnh hưởng đến kết thí nghiệm (test ONPG) mà chúng tơi làm Dựa vào kết thí nghiệm, chúng tơi sàng lọc chủng cho hoạt tính enzyme lactase cao chủng Lactobacillus acidophilus 1, đạt 2615 U/g để ứng dụng thực tiễn 69 Bảo quản giống vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn phòng nghiên cứu cơng nghiệp vi sinh vật Nó khơng đơn giữ chủng giống vài môi trường dinh dưỡng thông thường định kỳ cấy chuyền, mà phải làm để giống sống sót giữ đặc tính ban đầu Vì cơng tác tương đối phức tạp khó khăn Nếu khơng giữ đặc tính ban đầu vi sinh vật thành thu coi vơ ích Việc hoạt hoá giống thường xuyên kiểm tra chất lượng giống cần thiết thiếu Muốn làm khâu tốt, cần phải làm phần việc sau: - Kiểm tra độ khiết giống - Kiểm tra khả hồi biến giống Hầu hết chủng vi sinh vật (VSV) dùng sản xuất đột biến, phải kiểm tra xem chúng có hồi trở lại giống gốc chúng hay khơng, tượng hay xảy - Hoạt hóa giống sau thời gian sử dụng Để hoạt hóa giống thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu chất kích thích sinh trưởng như: cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, axit béo - Giữ giống phương pháp thích hợp trì hoạt tính ưu việt chúng, chống thối hố giống, hoạt tính Hiện tại, bảo quản giống phương pháp bảo quản môi trường thạch nghiêng kiểm tra định kỳ cấy truyền - Giống vi sinh vật giữ mơi trường thạch nghiêng (đối với VSV hiếu khí), chích sâu vào mội trường thạch (đối với VSV yếm khí) Các ống bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 3-50C Định kỳ cấy truyền giống, tuỳ nhóm VSV khác mà định kỳ cấy truyền khác nhau, nhiên giới hạn tối đa tháng - Để công tác giữ giống tốt, lâu đỡ bị tạp hơn, thường phủ lên môi trường cấy giống VSV lớp dầu khoáng parafin lỏng Lớp parafin hạn chế tiếp xúc VSV oxi khơng khí hạn chế nước mơi trường thạch, giống bảo quản lâu bị nhiễm tạp, thối hóa [60] 70 Hình 4.14 Bảo quản giống ống thạch nghiêng 71 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ 12 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng có khả vi khuẩn lactic phân lập từ nguồn nem chua, sữa chua, nước cải chua Đề tài góp phần bước đầu xây dựng sưu tập giống vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp lactase, chủng: - Lactobacillus brevis - Lactobacillus plantarum - Lactobacillus casei - Lactococcus raffinolactis - Lactococcus lactis spp lactis - Lactobacillus acidophilus Trong chủng qua sàng lọc hoạt tính lactase, chủng Lactobacillus acidophilus có ưu Hoạt tính lactase đạt 2615 U/g Cả chủng bảo quản giống phòng thí nghiệm khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Kĩ thuật Công Nghệ TPHCM  Từ kết thu nhận với hạn chế đề tài em có số kiến nghị sau: - Tiến hành kiểm tra thêm số dặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn để kết định danh cụ thể xác - Tiếp tục phân lập chủng vi khuẩn lactic từ nguồn khác, sử dụng phương pháp khoa học đại tốn thời gian Mục đích nhằm bổ sung thêm vào sưu tập giống hội tìm chủng có hoạt tính lactase mạnh, khả ứng dụng tính thực tế cao - Thực phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, khảo sát hình thức bảo quản chất cần bổ sung trình bảo quản việc kiểm tra lại khả sống sót hoạt tính chúng sau thời gian định nhằm đưa hình thức bảo quản phù hợp - Mở rộng vi sinh vật thị cho hoạt tính kháng khuẩn chủng LAB 72 - Sử dụng phương pháp định danh đại (PCR, điện di ) để khẳng định kết định danh - Phân tích thêm hợp chất kháng khuẩn, nghiên cứu tách chiết bacteriocin - Khảo sát thêm đặc tính lactase chủng vi khuẩn : khả chịu enzyme tiêu hóa, khả chịu đựng nhiều yếu tố cộng gộp, khả cạnh tranh bám dính để cố định chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lactase thể người việc khó 73 ... Nam, vi c nghiên cứu enzyme lactase chưa thật quan tâm nhiều hạn chế Đề tài: Góp phần xây dựng sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp lactase. .. hóa có hệ vi sinh vật với số lượng lớn, có 400 lồi vi sinh vật khác (Melissa peterson et al., 2002), chúng xếp vào loại: vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có ích Các lồi vi sinh vật sống chung... thiết để vận chuyển đến máy Golgi Hình 2.3 Quá trình sản sinh lactase người [54] 2.1.4 Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase sinh tổng hợp số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces