New Text Document.txt Khảo sát ảnh hưởng số chất bổ sung vào mơi trường lên hình thành củ Lily (Lilium Sorbonne) từ vảy củ in Vitro Nguyễn Thị Hảo Trịnh Thị Lan Anh (Giảng viên hướng dẫn) Tp.HCM, năm 2013 Page ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thiên nhiên nơi mang đến cho người nhiều quà tặng vô giá, q vơ giá hoa Hoa làm cho sống người thêm phần thi vị ý nghĩa Khi đời sống ngày nâng cao, người ngày hướng tới hưởng thụ, thưởng thức đẹp nhu cầu hoa lại khơng thể thiếu Từ mà nghề đời đem lại lợi nhuận lớn nghề trồng kinh doanh hoa Hoa Lily mang vẻ đẹp sang trọng, tao nhã, đa dạng màu sắc, hình dạng, nhiều loại hoa có hương thơm nồng, hoa lớn, bền thích hợp dùng làm hoa cắt cành Do đặc điểm nêu trên, Lily ngày ưa chuộng có giá trị thương mại cao Ở Việt Nam hoa Lily trồng thành công nhiều tỉnh Lâm Đồng, Lào Cai, Hà Nội Tuy nhiên, phải thường xun nhập giống từ nước ngồi với chí phí cao (10.000 – 15.000đồng/củ giống) không chủ động nguồn giống Việc nhân giống phương pháp tạo củ in vitro thực hoa Loa Kèn (Nguyễn Thị Nhẫn cộng sự, 1999 ) số giống hoa Lily nhập nội (Nguyễn Thái Hà cộng sự, 2003) Nhưng sinh trưởng, phát triển Lily trồng từ củ in vitro khả tạo củ giống thương phẩm chúng chưa đề cập tới Kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro với ưu điểm nhân nhanh cá thể đồng mặt di truyền, sinh trưởng phát triển cách đồng cho hệ số nhân giống cao Chỉ cần lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu, nuôi cấy môi trường dinh dưỡng điều kiện thích hợp thu lượng lớn (hoặc củ) giống thời gian ngắn nhiều so với phương pháp truyền thống khác Để giống Lily có suất, chất lượng cao ngồi biện pháp kỹ thuật điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển cần chọn giống hoa phù hợp với điều kiện tự nhiên nơi sản xuất Các tiêu suất, chất lượng hoa phụ thuộc phần nhiều vào chất lượng củ giống đem trồng Số nụ/cây số hoa/cây hai tiêu quan trọng đánh giá suất, chất lượng hoa Đối với sản xuất hoa Lily hai tiêu phụ thuộc nhiều vào cỡ củ Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP trồng Với điều kiện thời tiết khí hậu Đồn Đèn Ba Bể Bắc Kạn nước ta, trồng hoa Lilium Sorbonne trồng cỡ củ có chu vi từ 18 – 20 cho suất hoa cao, chất lượng hoa tốt (chiều cao 112,2 cm; 54,6 lá/cây; 6,4 hoa/cây; thời gian sinh trưởng 115 ngày; đường kính hoa 19,6 cm, ) phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng (Phan Thị Dung, 2009) Từ vấn đề nêu trên, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng số chất bổ sung vào môi trường lên hình thành củ Lily (Lilium Sorbonne) từ vảy củ in vitro” Mục đích nghiên cứu Xác định mơi trường tối ưu cho hình thành củ nâng cao chất lượng củ Lilium Sorbonne phương pháp nuôi cấy mô tế bào Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đề tài xác định ảnh hưởng nồng độ đường, dịch chiết khoai tây, dịch chiết cá nục lên tạo củ làm tăng chất lượng củ Lilium Sorbonne điều kiện in vitro Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đề tài chứng minh điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả tạo củ Lily, tìm mơi trường tốt để tăng chất lượng củ Lily Kết nghiên cứu đề tài sử dụng để thử nghiệm cơng tác trì nguồn giống lồi Lily khác, góp phần nâng cao hiệu nhân giống đem lại giá trị kinh tế cao Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm bố trí theo phương thức hồn tồn ngẫu nhiên độc lập Kết thu sau – tuần ni cấy tùy thí nghiệm Kết xử lý thống kê phần mềm Statgraphic mức độ ý nghĩa 0.005 Các kết đạt đồ án - Xác định nồng độ đường Saccharose thích hợp lên khả hình thành củ mẫu cấy Lilium Sorbonne - Xác định nồng độ dịch chiết khoai tây thích hợp lên khả hình thành củ mẫu cấy Lilium Sorbonne - Xác định nồng độ dịch chiết cá nục (nguồn nitrogen hữu cơ) thích hợp lên khả hình thành củ mẫu cấy Lilium Sorbonne Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp bao gồm chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận đề nghị Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nuôi cấy mô – tế bào thực vật kỹ thuật nuôi cấy cho phép dễ dàng tế bào thực vật hay mô phân sinh bệnh môi trường nhân tạo thích hợp để tạo khối tế bào hay hoàn chỉnh ống nghiệm 1.1.2 Lịch sử phát triển Năm 1902, Haberlandt lần thí nghiệm ni cấy mơ mầm không thành công Năm 1934, Kogl lần xác định vai trò IAA - hormone thực vật thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trưởng phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecout White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) cà rốt thuốc lá, mơ sẹo có khả sinh trưởng liên tục Năm 1941, Overbeek cộng sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Daruta Năm 1955, Miller phát minh cấu trúc sinh tổng hợp kinetin – cytokinin đóng vai trò quan trọng phân bào phân hóa chồi mơ ni cấy Đến năm 1957, Skoog Miller khám phá vai trò nồng độ tỷ lệ auxin: cytokinin môi trường phát sinh quan (rễ chồi) Khi tỷ lệ auxin/cytokinin nhỏ nhỏ, mơ có xu hướng tạo chồi Ngược lại lớn có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hóa chồi rễ, tạo hoàn chỉnh Năm 1949, Limmasets Cornuet phát virus phân bố không đồng thường thấy có virus đỉnh sinh trưởng Năm 1952, Morel Martin tạo bệnh virus giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật với số cải tiến trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus dùng rộng rãi nhiều loại trồng khác Năm 1952, Morel Martin lần thực vi ghép in vitro thành cơng Kỹ thuật vi ghép sau ứng dụng rộng rãi tạo nguồn giống bệnh virus tương tự virus nhiều trồng nhân giống phương pháp vơ tính khác, đặc biệt tạo giống ăn bệnh Năm 1960, Morel thực Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bước ngoặt cách mạng sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh truưởng nhân nhanh loài địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật Năm 1960, Cooking lần sử dụng emzyme phân giả thành tế bào tạo số lượng lớn tế bào trần nhiều trồng khác Năm 1971, Takebe cộng tái sinh từ tế bào trần mô thịt (mesophill cell) thuốc Năm 1972, Carlson cộng lần thực lai tế bào soma loài, tạo từ dung hợp tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfii Năm 1978, Melchers cộng tạo lai soma “ Cà chua – Thuốc lá” lai xa tế bào trần Đến việc tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào trần từ lai tế bào trần thành cơng nhiều lồi thực vật Năm 1959, Tulecke Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối mơ thực vật quy mơ lớn (134 lít) ni cấy chìm Năm 1977, Noguchi cộng nuôi cấy tế bào thuốc bioreacter dung tích lớn 20,000 lít Năm 1978, Tabata cộng nuôi cấy tế bào thuốc quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao 1.1.3 Cơ sở lý luận nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1990, Haberlandt (Đức) người đề xướng học thuyết tính tồn tế bào “Thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào tách rời Theo ông: “Mỗi tế bào thể đa bào mang đầy đủ thơng tin di truyền để kiến tạo nên thể hoàn chỉnh Vì đặt tế bào vào điều kiện thuận lợi, phát triển thành thể” Dựa sở hàng trăm lồi nhân giống nhằm mục đích bảo quản, lưu trữ thương mại giống cách nuôi cấy điều kiện vô trùng tái sinh thành Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.4 Một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Để nhân giống hoa Lily thực theo đường hữu tính vơ tính 1.1.4.1 Phương pháp nhân giống hoa Lily đường nhân giống hữu tính Nhân giống phương pháp hữu tính có ưu điểm thu nhiều hạt thời gian ngắn từ vài mẹ có chất lượng cao, đặc biệt chi Lilium virus khơng thể lây lan từ mẹ sang hạt Do vậy, mức độ nhiễm virus nhân giống hạt thấp Tuy nhiên, nảy mầm từ hạt thường không đồng hay xuất biến dị di truyền nhiều thời gian, từ gieo hạt đến hoa có chất lượng tốt phải – năm, phương pháp nhân giống ứng dụng 1.1.4.2 Phương pháp nhân giống hoa Lily đường nhân giống vơ tính a Giâm vảy (cắm vảy) Đây phương pháp nhân giống cổ truyền Trên thân vảy (củ) Lily có nhiều vảy, vảy sinh vài vảy nhỏ gốc, thân vảy nhỏ hình thành thể b Nhân giống cách tách củ Tách củ phương pháp nhân giống cách tách củ sinh từ củ mẹ Có thể trồng chuyên để nhân giống Cũng kết hợp với sản xuất hoa vụ hè để nhân giống, thời điểm này, khí hậu nóng nên chất lượng củ loại Mỗi củ mẹ có – củ tương đối lớn (chu vi 5cm trở lên) – củ nhỏ (chu vi – 3cm) Những củ có chu vi 5cm trở lên đem trồng sau vụ thành củ nhỡ để sản xuất hoa (10 cm trở lên), củ có chu vi – 3cm phải trồng hai vụ thành củ sản xuất hoa c Nhân giống mầm hạt Có số Lily nách sinh nhiều mầm hạt màu đen tím Mầm hạt số vảy hợp lại, rễ, lá; hái xuống trồng thành con, cách trồng tương tự trồng hạt Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tóm lại, phương pháp nhân giống có nhiều ưu điểm nhân giống liên tục nhiều năm virus tích luỹ lại truyền từ hệ sang hệ khác, làm hoa sinh trưởng, phát triển yếu, hoa nhỏ hệ số nhân giống chưa đáp ứng nhu cầu trồng sản xuất hoa Lily nước ta Đặc biệt quy mô sản xuất công nghiệp phát triển mạnh Hiện nay, phải nhập nội củ giống từ Hà Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc, với giá thành 10.000 – 15.000 đồng/củ chi phí bỏ cho sản xuất cao Phương pháp nuôi cấy mô tế bào phương pháp nhân giống giới Việt Nam, phương pháp khắc phục nhược điểm đáp ứng nhu cầu sản xuất 1.1.5 Quy trình nhân giống in vitro Bước 1: Lấy mẫu xử lý mẫu - Chọn mẹ để lấy, mẫu thường ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao - Chọn quan để lấy mẫu thường chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, non,… - Mô chọn để nuôi cấy thường mơ có khả tái sinh cao, bệnh, giữ đặc tính sinh học qúy mẹ ổn định Tùy điều kiện, giai đoạn kéo dài – tháng Bước 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy - Khử trùng bề mặt mẫu vật chuẩn bị môi trường nuôi cấy - Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo ống nghiệm bình ni - Các mẫu ni cấy không bị nhiễm khuẩn, nấm virus lưu giữ phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau thời gian định, từ mẫu nuôi cấy băt đầu xuất cụm tế bào quan (chồi, cụm chồi, rễ) phơi vơ tính có đặc tính gần phơi hữu tính Giai đoạn thường yêu cầu – 12 tháng Bước 3: Nhân chồi Môi trường giai đoạn bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên 16h/ngày, cường độ ánh sáng Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tối thiểu 1000 lux Ánh sáng tím thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20 – 30oC Mục tiêu quan trọng giai đoạn xác định phương thức nhân nhanh mơi trường dinh dưỡng điều kiện khí hậu tối thích Bước 4: Tạo rễ Khi chồi đạt đến kích thước định, mẫu chuyển sang môi trường tạo rễ Môi trường thường bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D) liều lượng thích hợp nhằm kích thích tạo rễ, bước khoảng 2- tuần Bước 5: Đưa in vitro vườn ươm Giai đoạn chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Vì cần đủ rễ, đủ phải huấn luyện cho thích nghi với biến đổi môi trường, đồng thời thay đổi đặc điểm sinh lý giải phẫu giúp thích nghi dần với điều kiện ex vitro, hạn chế tối đa bị chết 1.1.6 Ưu nhược điểm nuôi cấy in vitro 1.1.6.1 Ưu điểm - Cây trẻ hóa bệnh, có tiềm sinh trưởng, phát triển suất cao - Tạo đồng mặt di truyền, bảo tồn tính trạng chọn lọc - Tạo dòng tạp giao - Tạo có genotype (đa bội, đơn bội) - Bảo quản lưu giữ tập đồn gen - Có khả sản xuất quanh năm - Hệ số nhân giống cao - Tạo virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 1.1.6.2 Nhược điểm Theo Nickell (1973) nhược điểm phương pháp ni cấy in vitro đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền kỹ thuật cao nên có hiệu có giá trị cao khó nhân gống phương pháp khác Mặc dù số lượng giống thu cao có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt giai đoạn sau ống nghiệm Trang ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết khoai tây lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy NT Số lượng Trọng lượng củ tươi củ (củ/mẫu) (g/mẫu) Số rễ Chiều dài Số chồi (rễ/mẫu) rễ (cm) (chồi/mẫu) Chiều dài chồi(chồi Đặc điểm sinh trưởng /mẫu) Củ mọc nhiều, nhỏ, rễ nhiều, có lơng hút, B0 4.77778b 0.242178bc 5.33333d 1.566670b - - B1 10.4444c 0.465789d 7.22222e 0.866667a - - B2 3.77778ab 0.138300a 3.33333bc 0.700000a - - B3 4.55556ab 0.278978c 4.11111c 1.51111b 0.333333b 1.67778 Củ ít, màu xanh, xuất chồi B4 4.00000ab 0.203700b 2.55556b 1.61111b 0.888889c 4.66667 Củ ít, màu trắng, xuất chồi B5 3.33333a 0.231344b 1.44444a 0.700000a - - có màu trắng Củ mọc nhiều, to, đồng đều, rễ nhiều, có màu trắng Củ mọc ít, rễ, có màu trắng, nhỏ Ghi : Những chữ khác (a,b,c,…) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo phương pháp Ducan – : mẫu bị chết hay khơng có Trang 51 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét thảo luận: Từ bảng 3.2 ; đồ thị 3.2 hình 3.5 3.6 cho thấy: Trên môi trường không bổ sung dịch chiết khoai tây (B0) có phát sinh củ hình thái khác củ, nhiên củ tạo thành nhỏ khơng khỏe Ở nghiêm thức B1 quan sát sau tuần ni cấy có cảm ứng rõ rệt, xuất tái sinh củ Sau tuần quan sát thấy củ mọc nhiều đồng khỏe Trọng lượng tươi củ từ 0.242178 (g/mẫu) nghiệm thức B0 tăng lên gấp đôi (0.465789 g/mẫu) nghiệm thức (B1) Biểu rõ rệt quan sát ghi nhận kết qua bảng 3.2 số lượng củ, số lượng củ nghiệm thức tăng gấp (B1) so với nghiệm thức B0 Tiếp tục quan sát ghi nhận thấy rằng, nghiệm thức B2 số lượng củ có xu hướng giảm, dư lượng tinh bột bổ sung vào môi trường nuôi cấy, bên cạnh lúc phải hấp thụ nhiều nguồn dinh dưỡng dẫn đến tượng bị stress Ở nghiệm thức B3 B có xu hướng phát triển thành chồi, củ mọc Nguyên nhân lượng tinh bột đưa vào chuyển hóa nhiều dạng khác mẫu hấp thụ nhiều chất dinh dưỡng đồng thời vảy củ chịu sức ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA (được bổ sung vào mơi trường từ lúc đầu) lớn dẫn đến kích thích tạo chồi Và nghiệm thức B5, số lượng củ có xu hướng giảm, có tượng ngả màu vàng, sau tuần quan sát số lượng củ khơng tăng Qua ta thấy tinh bột bổ sung nhiều khả tạo củ chất lượng củ giảm Nhưng cần với lượng nhỏ tinh bột cảm ứng nhanh tạo số lượng củ nhiều chất lượng tốt Và thí nghiệm cho thấy hàm lượng dịch chiết khoai tây (tinh bột) bổ sung vào mơi trường thích hợp 10g/l Trang 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12 Số lượng củ (củ/mẫu) 10 Trọng lượng tươi củ (g/mẫu) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) Số chồi (chồi/mẫu) chiều dài chồi(cm) B0 B1 B2 B3 B4 B5 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết khoai tây lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ dịch chiết khoai tây là:0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết khoai tây lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ dịch chiết khoai tây 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 54 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết khoai tây lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ dịch chiết khoai tây là: 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 55 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng dịch chiết cá nục (nguồn nitrogen) lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy Nitơ hữu protein dạng xác bã động vật nguồn cung cấp nitrogen hữu tốt cho trình sinh trưởng phát triển thực vật Khi nuôi cấy điều kiện in vitro chủ yếu hấp thụ từ nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chúng tiến hành khảo sát nguồn nitơ có từ dịch chiết cá nục ảnh hưởng lên tạo củ Lily Tùy nghiệm thức thí nghiệm nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung là: 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Sau tuần nuôi cấy quan sát thấy mẫu cấy cảm ứng với môi trường nuôi cấy rõ rệt Chúng tiến hành thu nhận trình bày kết bảng 3.3; đồ thị 3.3; hình 3.7 3.8 Trang 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.3 Ảnh hưởng dịch chiết cá nục lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy NT C0 C1 C2 C3 Số lượng Trọng lượng củ tươi củ (củ/mẫu) (g/mẫu) 3.11111bc 0.24217cd Chiều Số rễ Chiều dài Số chồi (rễ/mẫu) rễ (cm) (chồi/mẫu) cao chồi(chồi Đặc điểm sinh trưởng /mẫu) 1.56667c 1.38148c - - Củ mọc nhiều nhỏ, có màu trắng, nhiều rễ , có lơng hút 3.55550c 0.20801bc 0.74444b 0.74444b - - Củ màu trắng nhỏ, rễ 2.66667b 0.26713d 0.14444a 0.14444a 0.777778b 4.57778b Củ màu trắng, nhỏ, xuất chồi có màu trắng 4.55556d 0.491511e 1.48889c 1.48889c - - Củ mọc nhiều, màu trắng to, có nhiều rễ, có lông hút C4 3.00000bc 0.17235b 1.19167bc 1.19167bc - - Củ mọc ít, nhỏ, ngả màu vàng, rễ C5 1.55556a 0.06233a 0.01111a 0.01111a - - Củ mọc ít, có củ chết, rễ Ghi : Những chữ khác (a,b,c,…) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo phương pháp Ducan – : mẫu bị chết hay khơng có Trang 57 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét thảo luận: Từ bảng 3.3 đồ thị 3.3 cho thấy: Trong nghiệm thức có bổ sung nồng độ dịch chiết cá nục nồng độ khác cho khả tạo củ chất lượng củ khác Khi không bổ sung nồng độ dịch chiết cá nục (C0) củ tạo khơng đồng Ở nghiêm thức C1: sau tuần quan sát chúng tơi thấy chưa có tượng cảm ứng, sau tuần ni cấy củ có dấu hiệu sẫm màu cảm ứng chậm Nguyên nhân nồng độ dịch chiết cá nục (nguồn nitơ) bổ sung vào môi trường nuôi cấy chưa đủ để cung cấp cho tái sinh củ tạo củ Tiếp tục quan sát nghiệm thức C2 : sau tuần ni cấy cảm ứng chậm đến tuần thứ lại có phát sinh chồi Lúc nguồn nitơ bổ sung vào mơi trường giúp kích thích tạo chồi nhiều tạo củ Nhưng dịch chiết cá nục bổ sung vào với nồng độ 60g/l (C3) lại kích thích tạo củ tốt, củ mọc đều, to khỏe Chứng tỏ nồng nộ tốt cho trình tạo củ Hàm lượng nitơ hấp thụ đưa vào cách triệt để mạnh mẽ thể rõ rệt từ tăng số lượng củ trọng lương củ như: nồng độ 30g/l dịch chiết cá nục cho số lượng củ 2.66667 (củ/mẫu) trọng lượng tươi củ 0.26713 (g/mẫu) nghiệm thức C3 số lượng củ tăng lên gấp đôi 4.55556 (củ/mẫu) trọng lượng tươi đạt 0.491511 (g/ mẫu) Tuy nhiên nghiệm thức C4 lại có biểu giảm sút số lượng củ trọng lượng tươi củ Củ cảm ứng chậm sau tuần nuôi cấy quan sát, khơng có biểu tạo thêm củ Khi dịch chiết cá nục bổ sung vào cao khả tạo củ lại giảm biểu rõ rệt quan sát nghiệm thức C5 Sau tuần thấy có cảm ứng củ chậm tạo số lượng củ khơng đáng kể Tiếp tục quan sát sau tuần ni cấy củ lại có biểu sậm màu chí xuất củ chết Nguyên nhân lượng nitơ bổ sung vào nhiều củ hấp thụ không kịp, cộng thêm hàm lượng phenol từ mẫu cấy tiết gây độc cho củ Trang 58 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Qua thí nghiệm cho ta thấy, nồng độ dịch chiết cá nục bổ sung vào với hàm lượng q nhiều q khơng tốt cho q trình tạo củ Lilium Sorbonne nồng độ thích hợp cho trình tạo củ 60g/l (C3) Số lượng củ (củ/mẫu) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 Trọng lượng tươi củ (g/mẫu) Số lượng rễ (rễ/mẫu) Chiều dài rễ (cm) Số chồi (chồi/mẫu) chiều cao chồi(cm) C0 C1 C2 C3 C4 C5 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết cá nục lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ dịch chiết cá nục là: 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 59 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết cá nục lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; tương ứng với nồng độ dịch chiết cá nục là: 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 60 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết cá nục lên khả hình thành củ mẫu cấy vảy củ Lilium Sorbonne sau tuần nuôi cấy C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ dịch chiết cá nục là: 0; 10; 30; 60; 90; 130 g/l Trang 61 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trang 62 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4.1 Kết luận Từ kết thực nghiệm cho thấy: Trong nuôi cấy mô thực vật, đường saccharose sử dụng nguồn carbon cho sinh trưởng phát triển thực vật Đối với việc tạo củ nhân giống bảo quản giống in vitro đường saccharose cần thiết để bổ sung vào mơi trường ni cấy Trong thí nghiệm tạo củ từ vảy củ Lilium sorbonne đường saccharose với hàm lượng 90g/l bổ sung vào môi trường MS thích hợp (trong điều kiện hồn tồn tối) Một thử nghiệm khác, tiến hành nuôi cấy vảy củ tạo củ Lilium sorbonne mơi trường MS, có bổ sung 10g/l dịch chiết khoai tây (B1) để điều kiện không chiếu sáng cho tỷ lệ tạo củ tốt Bên cạnh nguồn carbon bổ sung vào mơi trường ni cấy để tạo củ, nguồn nitrogen hữu cỡ góp phần khơng nhỏ việc ni cấy tạo củ in vitro Trong thí nghiệm nuôi cấy tạo củ từ vảy củ Lilium sorbonne mơi trường MS có bổ sung dịch chiết cá nục để điều kiện không chiếu sáng Sau tuần nuôi cấy cho thấy kết dịch chiết cá nục nồng độ 60g/l (C3) bổ sung vào thích hợp 4.2 Kiến nghị Vì thời gian tiến hành đồ án có hạn nên chúng tơi chưa thực thêm số thí nghiệm mong muốn nên chúng tơi có số kiến nghị sau: - Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tinh bột gạo lên hình thành củ Lily điều kiện chiếu sáng không chiếu sáng - Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen hữu lên hình thành củ Lily từ vảy củ điều kiện chiếu sáng - Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến khả tạo củ từ vảy củ hoa Lily Trang 63 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Lý Anh, 2005 Sự tạo củ Lily in vitro sinh trưởng Lily trồng từ củ in vitro Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp Tập III số Trường đại học nông nghiệp I Hà Nội [2] Đỗ Tuấn Khiêm, 2007 Báo cáo tổng kết đề tài Nghiên cứu khả thích ứng xây dựng mơ hình sản xuất số lồi hoa có giá trị cao Bắc Kạn Sở Công nghiệp – Khoa học Công Nghệ Bắc Kạn [3] Dương Tấn Nhựt, 2005 Một số kết nghiên cứu hạt nhân tạo hoa Lily ( Lilium spp.) Tạp chí Cơng nghệ sinh học Trường đại học Khoa học tự nhiên [4] Dương Tấn Nhựt, 2005 Sự phát sinh phơi vơ tính qua ni cấy lớp mỏng tế bào cắt ngang vảy củ hoa Lily (Lilium spp) Tạp chí Cơng nghệ sinh học Viện sinh học Tây Nguyên Tài liệu Tiếng Anh [5] R Barba – Gonzalez, A C Lokker K –B Lim, M S Ramanna J M Van Tuyl Use of 2n gametes for the production of sexual polyploids from sterile Oriental and Aciatic hybrids of lilies (Lilium).Theor Appl Gennet (2004) 109: 1125 – 1132 [6] LIU Ya-li,ZHANG Jian-xia,PAN Xue-jun(College of Horticulture, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling,Shaanxi 712100, China) Floral organ culture and rapid propagation of Lilium orential “Sorbonne”.Theor Appl Gennet (2004) 109: 1125 – 1132 [7] Zhao Xiangyun, Cheng Lian, Xing Youmei, Xie Liping, and Jia Xuewen (Northwestern Agricultural University, Yangling, Shanxi 712100) Studies on Bulblet Culture and Devirus of Lilium sulphureum Baker Acta Horticulfurase, 1993 - 03 Trang 64 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tài liệu Internet [8].http://kienthucsinhhoc.com/tap-chi-sinh-hoc/Thuc-vat-hoc/Su-tao-cu-Lily-InVitro-va-su-sinh-truong-cua-cay-Lily-trong-tu-cu-In-Vitro-143 [9] http://timtailieu.vn/tai-lieu/bai-giang-dinh-duong-khoang-va-nito-nitrogen-othuc-vat-25391 [10].http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-mot-so-bien-phap-ky-thuat-nang-caonang-suat-chat-luong-hoa-lily-tai-ba-be-bac-kan-28461 Trang 65 ... chất bổ sung vào mơi trường lên hình thành củ Lily (Lilium Sorbonne) từ vảy củ in vitro Mục đích nghiên cứu Xác định môi trường tối ưu cho hình thành củ nâng cao chất lượng củ Lilium Sorbonne... truyền Trên thân vảy (củ) Lily có nhiều vảy, vảy sinh vài vảy nhỏ gốc, thân vảy nhỏ hình thành thể b Nhân giống cách tách củ Tách củ phương pháp nhân giống cách tách củ sinh từ củ mẹ Có thể trồng... Lin Line (1970) số lượng vảy tỷ lệ thuận với số số hoa, số vảy nhiều số số hoa nhiều Nếu bóc bỏ lớp vảy ngồi tốc độ nảy mầm củ nhanh hơn, tốc độ hình thành quan sinh sản giảm, hoa muộn Thân vảy