Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN LACTOBACILLUS sp L5 VÀO BẢO QUẢN VÀ XỬ LÍ HẠT BẮP Ngành: Cơng nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1311100880 : NGUYỄN XUÂN VIỆT Lớp: 13DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Sinh viên thực luận văn Nguyễn Xuân Việt i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trên thực tế khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập giảng đường đại học đến nay, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý Thầy Cô, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công Nghê Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp trường Em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hương cô Nguyễn Thị Hai tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em có hội thực hành, vận dụng kiến thức học vào công việc thực tế hoàn thành luận văn với kết tốt Cuối xin cảm ơn bạn làm luận văn phòng thí nghiệm chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ em q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Bài báo cáo thực khoảng thời gian tháng Bước đầu vào thực tế, tìm hiểu lĩnh vực bảo quản hạt nơng sản chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, nhiên kiến thức em hạn chế Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu q Thầy Cơ để em có kiến thức kỹ tốt cho cơng việc tương lai Tp Hồ Chí Minh, 6/2017 Nguyễn Xuân Việt ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài: Tình hình nghiên cứu nước 2.1 Ngoài nước 2.2 Trong nước 3 Mục đích nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 6.1 Phương pháp luận 6.2 Phương pháp xử lí số liệu Kết đạt CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Phân loại nấm 1.1.3 Một số độc tố tác hại độc tố nấm mốc 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 20 1.2.1 Đặc điểm chung 20 1.2.1.1 Hình thái dinh dưỡng vi khuẩn lactic 20 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic 20 1.2.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic 22 iii Đồ án tốt nghiệp 1.2.2 Khả sinh sinh hợp chất kháng khuẩn chủng LAB 24 1.2.2.1 Bacteriocin 24 1.2.1.2 Phân loại bacteriocin 25 1.2.3 Khả kháng nấm LAB ứng dụng 27 1.2.3.1 Khả kháng nấm LAB 27 1.2.3.2 Ứng dụng vi khuẩn LAB 29 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 30 2.2 Thời gian thực hiện: 30 2.3 Vật liệu nghiên cứu 30 2.3.1 Vật liệu: 30 2.3.2 Hố chất mơi trường sử dụng: 30 2.3.2.1 Hoá chất: 30 2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 31 2.4 Thiết bị dụng cụ: 31 2.4.1 Thiết bị: 31 2.4.2 Dụng cụ: 31 2.5 Phương pháp luận: 32 2.5.1 Mục tiêu đồ án: 32 2.5.2 Nội dung: 32 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 33 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 33 2.6.2 Khảo sát hình thái vi khuẩn 34 2.6.2.1 Nhuộm Gram 35 2.6.2.2 Nhuộm bào tử 36 2.6.2.3 Thử nghiệm di động 37 2.6.2.4 Thử nghiệm Catalase 38 iv Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.5 Hàm lượng acid tổng 38 2.6.2.6 Thử nghiệm khả lên men đường 39 2.6.2.7 Thử nghiệm Protease 39 2.6.2.8 Thử nghiệm Chitinase: 40 2.6.3 Khảo sát khả sinh IAA chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 40 2.6.3.1 Định tính khả sinh IAA 40 2.6.3.2 Định lượng IAA có dịch ni cấy 40 2.6.4 Khả sát khả phát triển chủng nấm Fusarium sp.: 41 2.6.5 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm Fusarium sp.: 43 2.6.6 Ảnh hưởng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 đến độ khoẻ mầm bắp45 2.6.7 Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy sau gia nhiệt chủng Lactobacillus sp L5 với Fusarium sp.: 46 2.6.8 Khảo sát khả ảnh hưởng dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 nảy mầm hạt 49 2.6.9 Khảo sát khả ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp L5 có cảm nhiễm nấm mốc nảy mầm hạt 52 2.3.9 Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp 55 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57 3.1 Khảo sát sinh lý, sinh hóa tính chủng Lactobacillus sp L5 57 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc đĩa MRS Agar 57 3.1.2 Hình thái tế bào 58 3.1.3 Thử nghiệm Catalase 59 3.1.4 Khả di động 59 3.1.5 Hàm lượng acid tổng 61 3.1.6 Khả lên men đường 61 3.1.7 Thử nghiệm Chitinase 62 3.1.8 Thử nghiệm Protease 63 v Đồ án tốt nghiệp 3.2 Định tính định lượng IAA có dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 64 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp chủng Lactobacillus sp L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp.: 67 3.4 Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau gia nhiệt 69 3.5 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 phát triển hạt bắp 72 3.5.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới thời gian nảy mầm 72 3.5.2 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới tỉ lệ nảy mầm 74 3.5.3 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới chiều cao 76 3.5.4 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới chiều dài rễ 80 3.5.5 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 tới sinh khối tươi 84 3.6 Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 bảo quản hạt 89 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 4.1 Kết luận 95 4.2 Kiến nghị 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật KĐKTH: Khơng đun, khơng trung hồ KĐTH: Khơng đun, trung hồ KTHCN: Khơng trung hồ, cảm nhiễm KTHKCN: Khơng trung hồ, không cảm nhiễm LAB: Lactic acid bacteria MRS: Man De Rogosa and Sharpe NT: Nghiệm thức PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth THCN: Trung hoà, cảm nhiễm THKCN: Trung hồ, khơng cảm nhiễm VSV: Vi sinh vật vii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loại nấm độc tố chúng 17 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa LAB phương thức hoạt động 23 Bảng 1.3: Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men 28 Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 61 Bảng 3.2: Khả lên men loại đường Lactobacillus sp L5 62 Bảng 3.3: Kết biểu diễn biến thiên mật độ quang theo nồng độ IAA 64 Bảng 3.4: Đường kính phát triển chủng nấm mốc Fusarium sp 66 Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp Lactobacillus sp L5 68 Bảng 3.6: Ảnh hưởng mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp 69 Bảng 3.7: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm 72 Bảng 3.8: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm 74 Bảng 3.9: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chiều cao bắp ngày 76 Bảng 3.10: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy tới rễ sau ngày 80 Bảng 3.11: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau ngày 84 Bảng 3.12: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau ngày 86 Bảng 13: Khả kháng nấm dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp 89 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc hố học Trichothecennes Detoxified 13 Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp L5 đĩa MRS Agar (Trái) khuẩn lạc quan sát kín hiển vi (phải) 57 Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm Gram 58 Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau nhuộm bào tử 58 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp L5 nước cất, Thử nghiệm dương tính Bacillus spp 59 Hình 3.5: Khả di động chủng Lactobacillus sp L5 60 Hình 3.6: Khả lên men loại đường Lactobacillus sp L5 62 Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase chủng Lactobacillus sp L5 62 Hình 3.8: Thử nghiệm protease chủng Lactobacillus sp L5 63 Hình 3.9: Dịch ni cấy sau ly tâm đổi màu cho thuốc thử so với ĐC 64 Hình 3.10: Đồ thị thể mối tương quan số OD530nm nồng độ IAA (μg/ml) 65 Hình 3.11: Khả phát triển chủng nấm mốc Fusarium sp môi trường MRS Agar cải tiến PDA sau ngày 66 Hình 3.12: Hình thái sợi nấm bảo tử nấm mốc Fusarium sp kính hiển vi 67 Hình 3.13: Khả ức chế nấm dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 nấm mốc Fusarium sp 68 Hình 3.14: Đồ thị thể ảnh hưởng chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5 lên khả kháng Fusarium sp 70 Hình 3.15: Khả ức chế nấm chủng Lacotbacillus sp L5 sau gia nhiệt 71 Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng dịch nuôi cấy trước sau gia nhiệt thời gian nảy mầm hạt bắp 73 ix Đồ án tốt nghiệp 18 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34 19 Roy, U., V K Batish, S Grover, and S Neelakantan 1996 Production of antifungal substance by Lactococcus lactis subsp lactis CHD-28.3 International Journal of Food Microbiology 32(1-2): 27-34 20 Scott, P.M 1984 Effects of food processing on mycotoxins J Food Prot., 47(6): 489 21 Seifert cs (1996) Fusarium interactive key Agriculture and Agri – Food Canada 22 United States Department of Agriculture (2009) Grain Fungal Diseases and Mycotoxin Reference 98 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM A1 Môi trường Potato Dextrose Agar Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml Agar 20 pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất 30 phút Thu dịch chiết định mức lên 1000ml A2 Môi trường Potato Dextrose Broth Thành phần Gam/L D-glucose 20 Dịch chiết khoai tây 1000ml 1000ml pH 5,6 ± 0,2 Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, đun với 1000ml nước cất 30 phút Thu dịch chiết định mức lên 1000ml Đồ án tốt nghiệp A3 Môi trường de Man, Rogosa Sharpe Agar (MRS agar): Thành phần lít: Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Agar 15 Nước cất 1000ml pH 25°C 6.5 ± 0.2 Đồ án tốt nghiệp A4 Môi trường de Man, Rogosa Sharpe Broth (MRS Broth): Thành phần Gam/L Beef extract 10.0 Yeast extract 10.0 Sodium acetate 5.0 Sodium acetate 5.0 Dextrose 20.0 Amonium citrate 2.0 Dipotassium phosphate 2.0 Tween 80 1.0 Magiesium sulfate 0.1 Manganese sulfate 0.05 Nước cất 1000ml pH 25°C 6.5 ± 0.2 Đồ án tốt nghiệp A5 Môi trường Chitin 1% Thành phần Gam/L Chitin 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 1000ml A6 Môi trường Casein 1% Thành phần Gam/L Casein 10 Agar 15 Đệm Phosphate pH= 1000ml Đồ án tốt nghiệp B PHỤ LỤC BẢNG LIỆU Chú thích: CBZ Carbenzim KTH Khơng trung hồ TH Trung hồ CN Cảm nhiễm KCN Khơng cảm nhiễm B.1 TỈ LỆ KHÁNG NẤM Ở CÁC MỨC NHIỆT ĐỘ: The SAS System 14:23 Thursday, July 12, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F 10 13216.02667 1321.60267 110.43 F 10 13216.02667 1321.60267 110.43 F 39163.93333 2061.25965 99.82 F 19 39163.93333 2061.25965 99.82 F 114986.1833 6051.9044 311.95 F 19 114986.1833 6051.9044 311.95 F 19 10530094.69 554215.51 170.43 F 19 10530094.69 554215.51 170.43