BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TẦN SỐ GENE PIT-1 (PITUITARY SPECIFIC TRANSCRIPTION FACTOR 1) TRÊN ĐÀN GÀ TÀU VÀNG NUÔI TẠI MỘT TRUNG TÂM GIỐNG VẬT NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ THU HÀ Sinh viên thực MSSV: 0851110247 : NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN Lớp: 08DSH2 TP Hồ Chí Minh, 8/2012 Khoa: Mơi trường & CNSH PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Phiếu dán trang báo cáo ĐATN) Họ tên sinh viên/ nhóm sinh viên giao đề tài (sĩ số nhóm: 01): Họ tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2 Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tên đề tài: Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) đàn gà Tàu vàng nuôi Trung Tâm Giống Vật Nuôi Các liệu ban đầu:  Tài liệu tổng quan  Các báo khoa học nước Các yêu cầu chủ yếu:  Lấy mẫu máu gà Tàu vàng Trung Tâm Giống Vật Nuôi  Tách chiết DNA mẫu máu  Xác định tần số gene PIT-1 kỹ thuật PCR – RFLP Kết tối thiểu phải có:  Tách chiết DNA mẫu máu  Sản phẩm PCR có kết tốt  Enzyme cắt giới hạn cho kết đặc hiệu xác định tần số gene PIT-1 đàn gà Tàu vàng Ngày giao đề tài: 02/04/2012 Ngày nộp báo cáo: 01/08/2012 TP HCM, ngày … tháng … năm …… Giảng viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Chủ nhiệm ngành (Ký ghi rõ họ tên) Giảng viên hướng dẫn phụ (Ký ghi rõ họ tên) i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Thị Thùy Tiên, sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh, Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, lớp 08DSH2 Tôi xin cam đoan tất số liệu trích dẫn đồ án trung thực lấy từ q trình nghiên cứu thực tế Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Tự thực tất nội dung đồ án mà khơng có chép đồ án khác hình thức Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước hội đồng Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, trước ban giám hiệu trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ Tp.Hồ Chí Minh lời cam đoan Tp.Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012 Người viết Nguyễn Thị Thùy Tiên ii LỜI CÁM ƠN Để hồn thành q trình học đại học làm đồ án tốt nghiệp này, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy cô Khoa Môi trường Cơng nghệ Sinh học nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu chuyên ngành sống suốt thời gian em học tập trường Em gửi lời biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hà Thạc sĩ Phạm Minh Nhựt tạo điều kiện thuận lợi cho em làm đồ án Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giúp đỡ, động viên em suốt thời gian làm đồ án Ngoài ra, em gửi lời cám ơn đến trại gà giống nơi em xuống lấy mẫu, cô Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam anh chị Phịng thí nghiệm (anh Nam, chị Hiền…) hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt cho em hồn thành tốt đồ án Khơng phần quan trọng, em xin gửi lời biết ơn đến gia đình người ln chăm sóc động viên chỗ dựa vững tinh thần giúp em vượt qua khó khăn Và lời cám ơn đến tất người bạn – tập thể lớp 08DSH2 giúp đỡ suốt năm học tập trường Cuối cùng, em xin cám ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp dành thời gian đọc phản biện đề tài Xin chân thành cám ơn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012 iii MỤC LỤC PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP i LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CÁM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tìm hiểu chung gà 1.1.1 Sơ lược nguồn gốc gà 1.1.2 Tình hình chăn ni gà Việt Nam 1.1.3 Một số giống gà địa phương .7 1.1.3.1 Gà Ri 1.1.3.2 Gà Đông Tảo 1.1.3.3 Gà Hồ 1.1.3.4 Gà Mía 1.1.3.5 Gà Ác 1.1.3.6 Gà Tre 1.1.3.7 Gà Nòi 1.1.3.8 Gà Tàu vàng 1.2 Gà Tàu vàng nghiên cứu gà Tàu vàng Việt Nam 11 1.2.1 Tìm hiểu chung gà Tàu vàng 11 1.2.2 Các nghiên cứu gà Tàu vàng Việt Nam 12 1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 gà .13 1.4 Giới thiệu DNA 15 1.4.1 Cấu trúc DNA .15 1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA .16 iv 1.4.3 Định tính DNA phương pháp điện di .17 1.5 Phương pháp PCR .17 1.5.1 Nguyên tắc 17 1.5.2 Phản ứng PCR 18 1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR 20 1.5.3.1 Taq polymerase 20 1.5.3.2 Mồi .20 1.5.3.3 Các nucleotide 21 1.5.3.4 Dung dịch đệm 21 1.5.3.5 DNA mẫu 22 1.5.3.6 Số lượng chu kỳ phản ứng PCR 22 1.5.3.7 Nhiệt độ pH 23 1.5.3.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR 23 1.6 Giới thiệu kỹ thuật RFLP kỹ thuật PCR-RFLP 24 1.6.1 Kỹ thuật RFLP 24 1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP 26 1.7 Enzyme cắt giới hạn 26 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm 30 2.2 Nội dung nghiên cứu 30 2.3 Vật liệu, hóa chất dụng cụ 30 2.3.1 Vật liệu 30 2.3.2 Hóa chất .30 2.3.2.1 Hóa chất dùng ly trích DNA .30 2.3.2.2 Hóa chất dùng phản ứng khuếch đại DNA 31 2.3.2.3 Hóa chất dùng phương pháp điện di 31 2.3.3 Dụng cụ .31 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Thu thập mẫu 32 v 2.4.2 Tách chiết DNA 33 2.4.3 Định tính DNA phương pháp điện di .35 2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1 37 2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR 37 2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR 39 2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập bảo quản mẫu 42 3.2 Hiệu tách chiết DNA 42 3.3 Kết kiểm tra sản phẩm PCR 43 3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 43 3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45 3.4 Cắt sản phẩm PCR RE .46 3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 cắt enzyme TaqI 46 3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 cắt enzyme EcoRI 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận .53 4.2 Kiến nghị .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .54 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ­ bp: base pair ­ cDNA: complementary Desoxyribose Nucleic Acid ­ ctv: cộng tác viên ­ DNA: Desoxyribose Nucleic Acid ­ dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate ­ EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid ­ GH: Growth Hormone ­ GHF-1: Growth Hormone Facetor -1 ­ MAS: Marker Assisted Selection ­ MR: Maker ­ mRNA: messenger Riconucleic Acid ­ PCR: Polymerase Chain Reaction ­ PIT-1: Pituitary specific transcription factor ­ PTN: Phịng Thí Nghiệm ­ PRL: Prolactin ­ QTL: Quantative Trait Locus ­ RAPD: Random Amplified Polymorphic Desoxyribose Nucleic Acid ­ RE: restriction enzyme ­ RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism ­ SDS: Sodium Sodecyl Sulphate ­ SNP: Single nucleotide polymorphism ­ SSR: Single Sequence Repeat ­ TBE: Tris-Boric acid-EDTA ­ Tm: melting temperature ­ TSH- β: Thyroid Stimulating Hormone - β ­ UV: Ultraviolet vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 30 Bảng 2.2: Trình tự đoạn mồi PIT-1.2 PIT-1.4 37 Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR 38 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 38 Bảng 2.5: Thành phần hóa chất phản ứng cắt RE 40 Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số 43 Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene tần số gene PIT-1.2 47 Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene tần số gene PIT-1.4 50 Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene tần số gene PIT-1 51 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số giống gà địa phương nuôi Việt Nam 10 Hình 1.2: Gà Tàu vàng 11 Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA 19 Hình 1.4: Nguyên tắc kỹ thuật RFLP 25 Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau lấy PTN 33 Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps 34 Hình 2.3: Bộ điện di 36 Hình 2.4: Máy chạy PCR 39 Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số 42 Hình 3.2: Kết kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 44 Hình 3.3: Kết kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 45 Hình 3.4: Kết kiểm tra sản phẩm cắt enzyme TaqI 46 Hình 3.5: Biểu đồ thể tỷ lệ kiểu gene gene PIT-1.2 47 Hình 3.6: Kết kiểm tra sản phẩm cắt enzyme EcoRI 49 Hình 3.7: Biểu đồ thể tỷ lệ kiểu gene gene PIT-1.4 50 ix Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết Hình 3.1 chúng tơi nhận thấy chất lượng DNA thu tốt, không bị đứt gãy Việc sử dụng Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps cho DNA tổng số từ mẫu ổn định Trong đó, giếng số 33 khơng thấy có diện DNA Điều q trình lấy mẫu máu bị đơng phần nên khơng ly trích DNA, thao tác kỹ thuật ly trích DNA Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số: nêu Bảng 3.1 Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số Số mẫu Tỷ lệ (%) Sự diện DNA tổng số 39 95,12 Khơng có diện DNA tổng số 4,88 Dựa vào kết Bảng 3.1 chúng nhận thấy có 39 tổng số 41 mẫu có diện DNA tổng số chiếm tỉ lệ 95,12 %, có mẫu khơng có DNA tổng số nằm giếng số 33 Qua chúng tơi nhận thấy chất lượng DNA ly trích cao, dùng nghiên cứu sinh học phân tử, khuếch đại DNA 3.3 Kết kiểm tra sản phẩm PCR 3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2, thực 16 mẫu có kết tách chiết DNA thành cơng (trừ mẫu số 5) sử dụng thể tích Bảng 2.3 Các mẫu chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ tinh tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu phản ứng PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thực gel agarose 1,5 % với thang chuẩn nồng độ để xác định kích thước sản phẩm PCR Tiến hành đọc gel máy UVP  43  Đồ án tốt nghiệp LD 100 ĐC (-) 599 bp 500 bp 10 11 12 13 14 15 16 LD 100 Hình 3.2: Kết kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 Giếng – 16: sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 kích thước 599 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm Với kết điện di Hình 3.2 chúng tơi nhận thấy băng sáng rõ thể quy trình PCR tốt, phát 100 % diện gene PIT-1.2 với kích thước sản phẩm PCR 599 bp Kết luận thành phần phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.2 thích hợp Như 16 sản phẩm PCR gene PIT-1 với mồi PIT-1.2 dùng để tiến hành phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn TaqI Tuy nhiên, ladder 100 bp cịn chưa phân tách rõ, thao tác load mẫu điện di Đối chứng âm sử dụng để so sánh mẫu không cho sản phẩm PCR  44  Đồ án tốt nghiệp 3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4, thực 39 mẫu có kết tách chiết DNA thành cơng (trừ mẫu số số 33) sử dụng thể tích Bảng 2.3 Các mẫu chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ tinh tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu phản ứng PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thực gel agarose 1,5 % đọc máy UVP LD 100 bp 10 11 12 13 14 15 16 500 bp 442 bp 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 LD ĐC 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 100 (-) Hình 3.3: Kết kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 Giếng – 39: sản phẩm PCR gene PIT-1.4 kích thước 442 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm Dựa vào kết Hình 3.3 chúng tơi nhận thấy băng giếng sáng rõ, đẹp thể quy trình PCR tốt, phát 100 % diện gene PIT-1.4 với kích thước sản phẩm PCR 442 bp Kết luận thành phần phản ứng chu trình nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.4 thích hợp Như 39 sản phẩm PCR gene PIT-1 với mồi PIT-1.4 dùng để tiến hành phản  45  Đồ án tốt nghiệp ứng cắt với enzyme cắt giới hạn EcoRI Đối chứng âm sử dụng để so sánh mẫu không cho sản phẩm PCR 3.4 Cắt sản phẩm PCR RE 3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 cắt enzyme TaqI Việc xử lý enzyme công đoạn quan trọng việc xác định đa hình kiểu gene tần số xuất gene PIT-1 Đây cơng đoạn tốn kém, địi hỏi chi phí cao kỹ thuật tốt thao tác số lượng mẫu lớn Do đó, việc xác định nồng độ thể tích enzyme tham gia vào trình phân cắt cho hiệu kinh tế cần thiết Tiến hành xử lý enzyme cho 16 mẫu (trừ mẫu số 5) kiểm tra sản phẩm PCR cho kết tốt Sử dụng thể tích Bảng 2.5 để tiến hành cắt sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn TaqI sau ủ 65 0C qua đêm Tiến hành kiểm tra phân cắt enzyme gel agarose 1,5 % đọc máy UVP LD 100 599 bp 500 bp 467 bp 132 bp AA BB AB BB AA AB AB AB LD 100 10 11 12 13 14 15 16 AB AB AB AB AB AB AB AB  46  Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Kết kiểm tra sản phẩm cắt enzyme TaqI LD 100: Ladder 100 bp; AA : Tương ứng với vạch băng có kích thước 599 bp; BB : Tương ứng với vạch băng có kích thước 467/132 bp; AB : Tương ứng với vạch băng có kích thước 599/467/132bp Dựa vào kết Hình 3.4 chúng tơi nhận thấy băng sáng đều, rõ, có số băng phụ xuất mờ không ảnh hưởng đến kết Kết thể khả cắt đặc hiệu enzyme TaqI sử dụng hóa chất Bảng 2.5 nhiệt độ ủ 65 0C thích hợp Sản phẩm PCR sau cắt enzyme TaqI thu kiểu gene BB, AB, AA Trên gel điện di Hình 3.4, chúng tơi nhận thấy kiểu gene BB thể băng có kích thước 467 bp 132 bp; kiểu gene AB thể băng có kích thước 599 bp, 467 bp 132 bp; cuối kiểu gene AA không bị cắt nên thể băng kích thước 599 bp Trong 16 sản phẩm PCR cắt enzyme TaqI kiểu gene AA xuất lần, kiểu gene BB xuất lần kiểu gene AB xuất 12 lần Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene tần số gene PIT-1.2 Tỷ lệ kiểu gen (%) n (cá thể) = 16 Tần số gene AA BB AB A B 12,5 12,5 75 0,5 0,5  47  Đồ án tốt nghiệp 75 80 70 Tỷ lệ (%) 60 50 40 30 20 12.5 12.5 BB AA Kiểu gene 10 AB Hình 3.5: Biểu đồ thể tỷ lệ kiểu gene gene PIT-1.2 Dựa vào Bảng 3.2 Hình 3.5 chúng tơi nhận thấy tỷ lệ xuất kiểu gene AA kiểu gene BB quần thể gà (16 cá thể) tương đương chiếm 12,5 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao 75 % Tần số gene A tần số gene B có giá trị tương đồng Kết khác với kết Zahra Rodbari ctv (2011), theo báo cáo Zahra Rodbari ctv khảo sát 120 gà thương mại Iran tỷ lệ kiểu gene AA chiếm cao với 61 %, tiếp đến kiểu gene AB 32 %, thấp kiểu gene BB %; alen A cao alen B (A: 0,77; B: 0,23) Sở dĩ, kết khác với kết Zahra Rodbari ctv, 2011 số cá thể gà khảo sát cịn ít, chưa có ý nghĩa; gà chúng tơi khảo sát gà Tàu vàng gà thương mại tác giả 3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 cắt enzyme EcoRI Tiến hành xử lý enzyme cắt EcoRI cho 39 mẫu (trừ mẫu số 33) kiểm tra sản phẩm PCR cho kết tốt Sử dụng thể tích Bảng 2.5 để tiến hành cắt sản phẩm PCR enzyme cắt EcoRI sau ủ 37 0C qua đêm Tiến hành kiểm tra phân cắt enzyme gel agarose 1,5 % đọc máy UVP  48  Đồ án tốt nghiệp LD 100 10 11 12 13 14 15 16 500 bp 442 bp 246 bp 196 bp AB AB AA AA AB AA AB AB BB AB AB AA AA AB AB BB 17 18 AB AB LD 100 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 LD ĐC 100 (-) AB AB AB AB AB AB AA AA AA AA 29 30 31 32 33 34 BB AA AB BB BB AA 39 35 36 37 38 AA AB AB AB AB Hình 3.6: Kết kiểm tra sản phẩm cắt enzyme EcoRI LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối chứng âm; AA: Tương ứng với vạch băng có kích thước 442 bp; BB:AB Tương ứng với vạch băng có kích thước 246/196 bp; AB: Tương ứng với vạch băng có kích thước 442/246/196 bp Dựa vào Hình 3.6, chúng tơi nhận thấy băng sáng đều, rõ Kết thể khả cắt đặc hiệu enzyme EcoRI sử dụng hóa chất Bảng  49  Đồ án tốt nghiệp 2.5 nhiệt độ ủ 37 0C thích hợp Sản phẩm PCR cắt enzyme EcoRI thu kiểu gene tương ứng BB, AB, AA Trên gel điện di Hình 3.6, chúng tơi nhận thấy kiểu gene BB thể băng có kích thước 246 bp 196 bp; kiểu gene AB thể băng 442 bp, 246 bp 196 bp; cuối kiểu gene AA không bị cắt nên thể băng 442 bp Trong 39 sản phẩm PCR cắt enzyme EcoRI kiểu gene AA xuất 12 lần, kiểu gene BB xuất lần kiểu gene AB xuất 22 lần Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene tần số gene PIT-1.4 Tỷ lệ kiểu gene (%) n (cá thể) = 39 Tần số gene AA BB AB A B 30,77 12,82 56,41 0,6 0,4 56.41 60 Tỷ lệ (%) 50 40 30.77 30 20 12.82 10 BB AA Kiểu gene AB Hình 3.7: Biểu đồ thể tỷ lệ kiểu gene gene PIT-1.4 Dựa vào Bảng 3.3 Hình 3.7 chúng tơi nhận thấy tỷ lệ xuất kiểu gene AA chiếm 30,77 %, kiểu gene BB chiếm thấp 12,82 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao 56,41 % Tần số gene A xuất nhiều tần số gene B (A:  50  Đồ án tốt nghiệp 0,6; B: 0,4) Kết khác với kết Zahra Rodbari ctv (2011), theo báo cáo Zahra Rodbari ctv khảo sát 120 gà thương mại Iran tỷ lệ kiểu gene AA chiếm cao với 61%, tiếp đến kiểu gene AB 32%, thấp kiểu gene BB 7%; alen A cao alen B (A: 0,77; B: 0,23) Sở dĩ, kết khác với kết Zahra Rodbari ctv, 2011 số cá thể gà khảo sát cịn tương đối ít, chưa có ý nghĩa; gà khảo sát gà Tàu vàng gà thương mại tác giả Tổng kết: Tỷ lệ kiểu gene tần số gene PIT-1 đề tài nghiên cứu Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene tần số gene PIT-1 Gene Số mẫu TN Kiểu gene (%) Tần số gene BB AA AB A B PIT-1.2 (TaqI) 16 12,5 12,5 75 0,5 0,5 PIT-1.4 (EcoRI) 39 12,82 30,77 56,41 0,6 0,4 Nhiều nghiên cứu ứng dụng đa hình gene PIT-1 để kiểm tra mối liên hệ với đặc tính tăng trưởng, thành phần thân thịt tính trạng béo gà Gene PIT-1 chọn để nghiên cứu đa hình kiểu gene xác định tần số gene gà Tàu vàng Nghiên cứu đề tài dừng lại việc xác định đa hình gene tần số gene PIT-1 Trong đề tài nghiên cứu này, kết đa hình gene tần số gene PIT-1 đàn gà Tàu vàng nuôi Trung Tâm Giống Vật Nuôi thể Bảng Bảng 3.4, nhận thấy kết gene PIT-1.2 cắt enzyme TaqI gene PIT-1.4 cắt enzyme EcoRI xuất kiểu gene BB, AA AB kiểu gene AB chiếm tỷ lệ (%) cao kiểu gene AA BB quần thể 41 cá thể gà; điều khác so với kết nghiên cứu Zahra Rodbari ctv (2011) đàn gà chúng tơi sử dụng gà Tàu vàng cịn đàn gà tác giả gà thương mại, vị trí địa lí kỹ thuật chăm sóc khác Còn tần số gene A  51  Đồ án tốt nghiệp xuất tương đối cao tần số gene B; điều tương đối giống với kết nghiên cứu Zahra Rodbari ctv (2011) gà thương mại Iran Kết báo cáo Zahra Rodbari ctv (2011) đa hình đơn nucleic gene PIT-1 có liên quan đáng kể với thành phần thân thịt gà thương phẩm Iran báo cáo Nie ctv (2008) đa hình gene PIT-1 có liên quan đáng kể đến đặc điểm tăng trưởng gà Kết báo cáo cho đa hình kiểu gene PIT-1 có ảnh hưởng đáng kể đến đặc điểm tăng trưởng gà như: trọng lượng thể, trọng lượng ức, trọng lượng cánh, trọng lượng thịt, chiều dài thể, khả tăng khối lượng trung bình hàng ngày…ở giai đoạn phát triển khác gà thương phẩm Ngoài ra, báo cáo khẳng định đa hình kiểu gene khơng có liên quan đến đặc tính béo, độ dày mỡ bụng, độ dày mỡ da…của gà thương phẩm Từ kết trên, nhận thấy kết đề tài nghiên cứu sử dụng để tiếp tục nghiên cứu sâu mối liên hệ đa hình kiểu gene, tần số gene tính trạng tăng suất gà Tàu vàng Việt Nam quy mô số lượng mẫu nhiều  52  Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận  Tách chiết DNA Quy trình ly trích DNA sử dụng Bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps, Blood với 41 mẫu máu gà Tàu vàng kết cho thấy 39 mẫu có diện DNA chiếm tỉ lệ 95,12 % so với tổng số mẫu đem ly trích  Phản ứng PCR Thành phần hóa chất theo protocol nhà sản xuất có điều chỉnh PTN chu trình nhiệt thích hợp cho kết khuếch đại DNA với mồi PIT-1.2 (599 bp) mồi PIT-1.4 (442 bp) đạt tỉ lệ 100% thành công Sản phẩm PCR đạt kết tốt  Phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn Kết sản phẩm cắt gene PIT-1.2 với enzyme TaqI là: kiểu gene AA với kích thước 599 bp chiếm 12,5 %, kiểu gene BB với kích thước 467 bp, 132 bp chiếm 12,5 %, kiểu gene AB với kích thước 599 bp, 467 bp, 132bp chiếm tỷ lệ cao 75 % Tần số gene A (0,5), tần số gene B (0,5) Kết sản phẩm cắt gene PIT-1.4 với enzyme EcoRI là: kiểu gene AA với kích thước 442 bp chiếm 30,77 %, kiểu gene BB với kích thước 246 bp, 196 bp chiếm 12,82 %, kiểu gene AB với kích thước 442 bp, 246 bp, 196 bp chiếm tỷ lệ cao 56,41 % Tần số gene A (0,6), tần số gene B (0,4) 4.2 Kiến nghị  Tiếp tục khảo sát với số lượng mẫu lớn  Thu thập đầy đủ số liệu suất sinh trưởng giống gà Tàu vàng để đánh giá ảnh hưởng kiểu gene PIT-1 đến suất sinh sản, sinh trưởng phẩm chất thịt gà Tàu vàng  53  Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Văn Bắc, Lê Viết Ly, Đinh Công Tiến Nguyễn Ngọc Dương, 2005 Khả sinh trưởng sinh sản gà Tàu vàng Việt Nam Nguyễn Văn Bắc, Võ Văn Sự, Hồng Văn Tiệu, Phạm Văn Thìn Hoàng Văn Hải, 2005 Kết bước đầu bảo tồn In-situ gà Tàu vàng Báo cáo Hội nghị phát triển Chăn Ni – Thú Y tồn quốc, 2011 Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang.1999 Di Truyền Phân Tử Nhà xuất Nơng nghiêp, Tp Hồ Chí Minh Trần Thị Dân, 2000 Tiến di truyền “số đẻ ra/lứa” trại chăn nuôi heo cơng nghiệp Tp.HCM Tạp chí chăn ni số Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuân, 2001 Ảnh hưởng gene gây stress (gene halothane) sức tăng trưởng, phẩm chất thân thịt suất sinh sản lợn Tạp Chí Chăn Ni, (41): 13 – 14 Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục, Tp Hồ Chí Minh Trần Xn Hồn, Phạm Dỗn Lân, 2000 Phân tích gene hormone sinh trưởng gà Ri kỹ thuật PCR – RFLP Tạp chí KHCN Chăn Ni Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002 Chăn nuôi gà thả vườn gà tây Nhà xuất Nông Nghiệp 10 Nguyễn Tuấn Kiệt, 2009 Luận văn: Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác dịnh kiểu gen thụ thể prolactin giống heo Yorkshire Đại Học Nông Lâm 11 Lê Hồng Mận, Nguyễn Thanh Sơn, 2001.Kỹ thuật nuôi gà Ri gà Ri pha Nhà xuất Nông nghiệp 12 Khuất Hữu Thanh, 2006 Kỹ thuật gene – Nguyên lý ứng dụng Nhà xuất Khoa học kỹ thuật 13 Lâm Minh Thuận ctv, 2003 Khảo sát khả sản xuất thịt gà Tàu vàng Bà Rịa Vũng Tàu Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp (4) 14 Đinh Công Tiến Nguyễn Quốc Đạt,2005 Bảo tồn quỹ gene gà Tàu vàng  54  Đồ án tốt nghiệp 15 Tình hình chăn ni gà giai đoạn 2001 – 2005 phương hướng phát triển giai đoạn 2006 – 2015 Cục chăn nuôi 16 Trần Văn Tịnh, 2011 Nghiên cứu chọn lọc nhân nâng cao suất gà Tàu Vàng Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài cấp Bộ 2008 – 2010 Tài liệu tiếng nước 17 Bodner M, Castrillo JL, Theill LE, Deerinck T, Ellisman M, Karin M (1988) The pituitary-specific transcription factor GHF-1 is a homeobox-containing protein Cell 55: 505-518 18 Cohen LE, Wondisford FE, Radovick S (1996) Role of Pit-1 in the gene expression of growth hormone, prolactin, and thyrotropin Endocrinol Metab Clin North Am 25: 523-540 19 E Bastos, S Ávila, A Cravador, R Renaville, H Guedes-Pinto, J.L Castrillo, Identification and characterization of four splicing variants of ovine POU1F1 gene, Gene 382 (2006) 12–19 20 FAO, 2004 Animal Production and Health Manual 21 Jiang RS, Li J, Qu L, Li H, Yang N (2004) A New single nucleotide polymorphism in the chicken pituitary-specific transcription factor (POU1F1)gene associated with growth rate Animal Genet 35(4): 344-346 22 Lamont, M M., J T Vida, J T Harvey, S Jeffries, R Brown, H H Huber, R DeLong, and W K Thomas 1996 Genetic substructure of the Pacific harbor seal (Phoca vitulina richardsi) off Washington, Oregon, and California Mar Mamm Sci 12(3):402-413 23 Lee EJ, Russell T, Hurley L, Jameson JL: Pituitary transcription fac- tor-1 induces transient differentiation of adult hepatic stem cells into prolactinproducing cells in vivo Mol Endocrinol 2005, 19:964-971 24 Li S, Crenshaw EB, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG (1990) Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene pit-1 Nature 347: 528533  55  Đồ án tốt nghiệp 25 Miyai S, Yoshimura S, Iwasaki Y, Takekoshi S, Lioyd RV, Osamura RY (2005) Introduction of GH, PRL, and TSH beta mRNA by transcription Pit1 in a human pituitary adenoma-derived cell line Cell TISSUE Res 322: 269-277 26 Nie Q, Fang M, Xie L, Zhau M, Liang Z, Luo Z, Wang G, Bi W, Liang C, Zhang W, Zhang X (2008) The PIT gene polymorphism were associated with chicken growth traits BMC Genet 9: 20-29 27 Nie Q, Lei M, Ouyang J, Zeng H, Yang G, Zhang X: Identification and characterization of single nucleotide polymorphisms in 12 chicken growth correlated genes by denaturing high performance liquid chromatography Genet Sel Evol 2005, 37:339-360 28 Promwatee N, and Duangjinda M, 2010 Association of Single Nucleotide Polymorphisms in GHSR, IGF-I, cGH and IGFBP2 Gen with Growth Traits in Thai Native Chickens The 14th AAAP: pp 44-47 29 Qiu FF, Nie QH, Jin WY, Ouyang JH, Lin SM, Sun H, Zhang XQ (2006) Association of a 57 bp insertion/deletion in chicken PIT-1 gene with growth and carcass traits Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis 28(2): 284288 30 Rodbari Z, Alipanah M, Seyedabadi HR, Amirinia C, 2011: Identification of a single nucleotide polymorphism of the pituitary-specific transcriptional factor (Pit 1) gene and its association with body composition trait in Iranian commercial broiler line ISSN 1684-5315 31 Simmons DM, Voss JW, Ingraham HA, Holloway JM, Broide RS, Rosenfeld MG, Swanson LW: Pituitary cell phenotypes involve cell-specific Pit-1 mRNA translation and synergistic interactions with other classes of transcription factors Genes Dev 1990, 4:695-711 32 Taha D, Mul l i s PE, I banez L, de Zegher F: Absent or delayed adrenarche in Pit-1/POU1F1 deficiency Horm Res 2005, 64:175-179  56  Đồ án tốt nghiệp 33 Tanaka M, Yamamoto I, Ohkubo T, Wakita M, Hoshino S, Nakashima K (1999) cDNA cloning and developmental alterations in gene expression of the two Pit-1/GHF-1 transcription factors in the chicken pituitary Gen Comp Endocrinol 114: 441-448 34 Van As P, Buys N, Onagbesan OM, Decuypere E: Complementary DNA cloning and ontogenic expression of pituitary-specific transcription factor of chickens (Gallus domesticus) from the pituitary gland Gen Comp Endocrinol 2000, 120:127-136 35 Wattanachant S, Benjakul S, Ledward DA., 2004 Composition, color and texture of Thai indigenous and broiler chicken muscles Poult Sci 83(1): 123-8 Các trang web từ internet: http://agriviet.com/home/threads/40829-cac-giong-ga-tren-the-gioi#axzz21t2NH4Lj http://hoinongdan.cantho.gov.vn/?tabid=110&ndid=211&key= http://iasvn.org/chuyen-muc-in-bai-viet/605.html http://en.wikipedia.org/wiki/Pituitary-specific_positive_transcription_factor_1 http://en.wikipedia.org/wiki/EcoRI http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html http://www.hua.edu.vn/khoa/cnts http://tapchithuy.com/Tin-tuc http://mgc.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/pcr.html  57  ... chân gà – tuần tuổi (Qiu ctv, 2006) Chưa có nghiên cứu thức ảnh hưởng gene PIT-1 gà Tàu vàng Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định tần số gene PIT-1 đàn gà Tàu vàng nuôi Trung Tâm Giống Vật Nuôi. .. factor 1) đàn gà Tàu vàng nuôi Trung Tâm Giống Vật Nuôi Các liệu ban đầu:  Tài liệu tổng quan  Các báo khoa học nước Các yêu cầu chủ yếu:  Lấy mẫu máu gà Tàu vàng Trung Tâm Giống Vật Nuôi  Tách... transcription factor 1) đàn gà Tàu vàng nuôi Trung Tâm Giống Vật Ni” Tình hình nghiên cứu  Các nghiên cứu gà Tàu vàng: Nguyễn Văn Bắc ctv (2005) nghiên cứu khả sinh trưởng sinh sản gà Tàu vàng Việt