BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA ONCIDIUM KOZUMIT DELIGHT IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: MÔI TRƯỜNG Giảng viên hướng dẫn : ThS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực MSSV: 1191111017 : CAO THẾ HIỂN Lớp: 11HSH2 TP Hồ Chí Minh, năm 2013 Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ xưa đến nói tới hoa lan người ta liên tưởng đến tao, tinh khiết, quý trọng, đam mê tình yêu vĩnh cửu bất diệt Trong tất loài hoa biết đến hoa lan mệnh danh “Nử hoàng sắc đẹp” với vẽ đẹp quyến rũ, hương thơm dịu dàng từ lòai hoa lan với đủ màu sắc khác với tên gọi khác Hoa lan loài hoa biểu tượng cho vẻ đẹp quý phái, có nhiều chủng loại, loại mang vẻ đẹp riêng Có nhiều loại lan khác Dendrobium, Phalaenopsis, Oncidium Kozumit Delight, Oncidium, Vanda, Cattleya chúng có mùi hương quyến rũ vẻ đẹp kiêu sa Hoa lan thường dùng để trang trí, trưng bày bữa tiệc hay hội thảo Trong số đó, có lẽ Oncidium giống bật từ màu sắc dạng hoa giống loài, Hiện nay, nhu cầu hoa lan ngày nhiều góp phần thúc đẩy nghề trồng lan phát triển mạnh mẽ thu lợi nhuận cao cho nhiều nước, phải kể đến Đài Loan, nước có kỹ thuật trồng lan hàng đầu giới với khả điều khiển hoa lan Hồ Điệp sưu tập giống đồ sộ Nước ta có nhiều sở kinh doanh hoa lan mọc lên, nhiên nhiều hạn chế quy mô, đội ngũ kỹ thuật nên giống có chất lượng thấp, khơng đồng chưa đáp ứng nhu cầu thị trường, kết hàng năm nước ta phải nhập giống từ nước Chính vậy, việc tăng suất, chất lượng cho giống vấn đề cấp bách Theo nghiên cứu hay hai yếu tố khơng giúp phát triển cách tồn diện Để phát triển cách tối ưu ta cần phải bổ sung đầy đủ yếu tố như: dinh dưởng, ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện nuôi cấy,… có hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phát triển dinh dưỡng ánh sáng Page Đồ án tốt nghiệp Môi trường thường sử dụng nuôi cấy lan in vitro môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), môi trường dinh dưỡng đầy đủ cho Sự kết hợp môi trường MS lỏng Rắn để tạo mơi trường MS lớp để góp phần thúc đẩy phát triển cách tốt Bên cạnh đó, ánh sáng yếu tố quan trọng trình quang hợp phát sinh hình thái Do đó, việc ứng dụng loại ánh sáng nuôi cấy mô hướng nghiên cứu khả ứng dụng cao Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Ảnh hưởng ánh sáng lên sinh trưởng phát triển Oncidium Kozumit Delight in vitro“ nhằm xác định môi trường nuôi cấy loại ánh sáng thích hợp cho nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight điều kiện in vitro, từ cải tiến phương pháp nhân giống giúp giảm giá thành sản phẩm Mục đích nghiên cứu Xác định mơi trường nuôi cấy, loại ánh sáng điều kiện chiếu sáng thích hợp cho nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight điều kiện in vitro, nhằm gia tăng hệ số nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight tăng chất lượng môi trường nuôi cấy in vitro Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) hai lớp (lỏng rắn) lên giai đoạn tạo chồi lan Oncidium Kozumit Delight điều kiện in vitro Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Từ trước đến nay, việc nhân giống lan in vitro sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog 1962), nên việc kết hợp môi trường MS lỏng Rắn để tạo môi trường MS lớp với khảo sát ánh sáng hướng hiệu nhân giống lan điều kiện in vitro Tuy nhiên, khác có mơi trường dinh dưởng bước sóng ánh sáng khác Vì vậy, việc xác dịnh môi trường dinh dưởng loại ánh sáng điều kiện chiếu sáng thích Page Đồ án tốt nghiệp hợp sở khoa học cho việc tạo cụm chồi khỏe có sức sống tốt, tăng sinh mạnh, đạt hiệu chất lượng cao, gia tăng khả sống sót chuyển vườn ươm vấn đề quan trọng nhân giống in vitro Từ giảm giá thành sản phẩm, nâng cao hiệu kinh tế 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Hệ thống đèn thiết kế đơn giản khơng tốn chi phí cao, dễ áp dụng cho sản xuất giống đạt hiệu cao Trong môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) hai lớp ( lỏng rắn ), giá thành thấp, đơi giản áp dụng sản xuất lớn, tạo điều kiện để so sánh với mơi trường dinh dưởng khác để tìm môi trường tối ưu cho nhân giống in vitro, từ áp dụng vào sản xuất Phương pháp nghiên cứu Đề tài thực nhân chồi môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) Môi trường nuôi cấy: lớp:  Lớp trên: MS lỏng + g/l than hoạt tính + g/l NAA + g/l BA + 30 g/l đường + 50 ml/l nước dừa  Lớp dưới: MS đặc (10g/l agar) + g/l NAA + g/l BA + 30 g/l đường + 50 ml/l nước dừa  Quan sát lấy kết tuần chiếu sáng với loại ánh sáng có bước sóng khác nhau: ánh sáng trắng (ánh sáng đa sắc – nghiệm thức đối chứng); ánh sáng xanh dương, ánh sáng vàng; ánh sáng đỏ tối hoàn toàn tuần  Quan sát lấy kết tuần Các kết đạt đề tài Xác định môi trường dinh dưởng thích hợp cho nhân chồi lan Oncidium Xác định loại ánh sáng thích hợp cho nhân chồi lan Oncidium Xác định điều kiện chiếu sáng thích hợp cho nhân chồi lan Oncidium Các số liệu, hình ảnh biểu đồ mô tả Page Đồ án tốt nghiệp Kết cấu đồ án tốt nghiệp  Đồ án tốt nghiệp bao gồm chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu phương pháp Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận đề nghị Page Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Page Đồ án tốt nghiệp 1.1 Quang hợp thực vật Quang hợp trình tổng hợp chất hữu từ chất vô đơn giản CO2 H2O tác dụng lượng ánh sáng mặt trời tham gia sắc tố diệp lục Quang hợp biến đổi quang thành hóa thực vật, thơng qua quang hợp tạo lượng lớn sinh khối, có ý nghĩa định sống sinh vật người trái đất Ánh sáng cần cho trình quang hợp tiếp nhận hai nhóm sắc tố: chlorophyll carotenoid, số thực vật bậc thấp có phycobillin Trong đó, diệp lục (chlorophyll) sắc tố có vai trò quan trọng quang hợp  Diệp lục: Có loại diệp lục: a, b, c, d, e Nhưng thực vật bậc cao có loại diệp lục a b Nhờ cấu trúc đặc trưng phân tử diệp lục mà hấp thu lượng ánh sáng chuyển thành dạng kích thích phân tử diệp lục Trong quang phổ hấp thu diệp lục, hai vùng ánh sáng diệp lục hấp thu mạnh vùng ánh sáng đỏ (662 nm) vùng ánh sáng xanh tím (430 nm), ánh sáng xanh lục khơng hấp thu mà phản xạ lại nên ta thấy có màu xanh Trong cây, phân tử diệp lục liên kết với phân tử protein khác nên phân tử diệp lục có cực đại hấp thu khác kí hiệu P700, P680… Cấu trúc diệp lục vòng porphyrin, tạo nên từ vòng pyrrol riêng lẻ, trung tâm vòng có ngun tử Mg liên kết với nguyên tử N liên kết đồng hóa trị hai liên kết phối trí Nguyên tử Mg tách có tác động acid lỗng Phân tử diệp lục khơng chứa Mg gọi pheophytin có vai trò quan trọng phản ứng sáng quang hợp Chuỗi bên phân tử diệp lục có tính kỵ nước nhờ phân tử có đặc tính kỵ nước  Carotenoid: Page Đồ án tốt nghiệp Quang phổ hấp thu nhóm carotenoid vùng ánh sáng xanh có bước sóng 451 – 481 nm Carotenoid có vai trò lọc ánh sáng bảo vệ cho diệp lục không bị oxi hóa cường độ ánh sáng cao Carotenoit có khả hấp thu lượng ánh sáng mặt trời vùng mà diệp lục không hấp thu chuyển lượng cho diệp lục để biến đổi thành lượng hóa học o Carotenoid nhóm sắc tố vàng, da cam, tỷ lệ diệp lục: carotenoid thường 3:1, carotenoid thường chia thành nhóm: carotene xanthophyll Carotene (C40H56) tiền vitamin A, tan dung mơi hữu Xanthophyll sắc tố có màu vàng sẫm, có cơng thức hóa học C40H56On (n từ – 6)  Sắc tố dịch bào: Hấp thu lượng ánh sáng chuyển thành dạng nhiệt làm ấm (nhóm anthocyanin) Nơi xảy q trình quang hợp lục lạp, lục lạp có hình tròn đến bầu dục, bao quanh màng màng Màng lục lạp c ̣n gọi thylakoid, tạo vách ngăn bên thylakoid với mơi trường ngồi Các thylakoid có dạng hình đĩa xếp chồng lên tạo cấu trúc dạng hạt (grana) Màng thylakoid nơi mà ánh sáng tiếp nhận sắc tố quang hợp nhờ hệ thống oxy hóa khử khác mà lượng ánh sáng mặt trời biến đổi thành lượng hóa học thẩm thấu, q trình phức tạp chưa giải thích chi tiết Màng thylakoid chứa cấu trúc siêu phân tử, hệ thống quang hóa I, hệ thống quang hóa II vá phức hệ cytochrome b/f, chúng chiếm toàn bề rộng màng thành phần quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử quang hợp Hệ thống quang hóa I chứa 13 loại protein khác nhau, khoảng 200 phân tử diệp lục, số lượng carotenoid phức hệ Fe – S Hệ thống quang hóa II chứa 11 phân tử polypeptide khác nhau, khoảng 200 phân tử diệp lục a, 100 phân tử diệp lục b, hai phân tử pheophytin, quinone Page Đồ án tốt nghiệp Hệ thống quang hóa I II khơng chứa sắc tố tiếp nhận ánh sáng mà hệ thống chứa phân tử diệp lục hoàn toàn đặc biệt vị trí nó, phân tử diệp lục tiếp nhận ánh sáng có khả bắn điện tử Phân tử diệp lục đặc biệt hệ thống I hấp thu cực đại ánh sáng có bước sóng 700 nm (còn gọi P700) phân tử diệp lục đặc biệt hệ thống quang hóa II hấp thu cực đại 680 nm ( gọi P680) Năng lượng hấp thu từ lượng ánh sáng nhờ sắc tố quang hợp hệ thống quang hóa chuyển đến P680 P700 qua cộng hưởng điện từ Bằng cách hai hệ thống quang hợp tạo vận chuyển điện tử có ánh sáng Ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp giai đoạn đầu trình quang hợp, giai đoạn sau không ảnh hưởng trực tiếp Những cơng trình Blackman cho thấy cường độ ánh sáng nồng độ CO2 đạt tối ưu cho quang hợp, tăng cường độ ánh sáng nồng độ CO2 cường độ quang hợp khơng tăng  Quá trình quang hợp chia làm hai giai đoạn sau: 1.1.1 Phản ứng sáng (pha sáng) Là trình hấp thu lượng ánh sáng diệp lục, vận chuyển lượng vào trung tâm phản ứng lượng ánh sáng biến đổi thành lượng hóa học phân tử ATP (Adenosine Triphosphate) tạo nên hợp chất khử mạnh NADPH2 (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) Pha sáng gồm hai giai đoạn nhau: giai đoạn quang vật lý giai đoạn hóa học  Giai đoạn quang vật lý: giai đoạn pha sáng quang hợp, giai đoạn có hai hoạt động xảy hấp thu lượng sắc tố truyền lượng sắc tố hấp thu đến hai tâm quang hợp P700 P680 Kết giai đoạn hai tâm quang hợp tiếp nhận lượng ánh sáng hệ sắc tố chuyển đến trở thành trạng thái hoạt động Điện tử hai tâm quang hợp giàu lượng tham gia vào phản ứng quang hóa giai đoạn quang hóa tiếp sau  Giai đoạn quang hóa: giai đoạn chuyển hóa lượng điện tử hai tâm quang hợp thành lượng hợp chất giàu lượng ATP Page Đồ án tốt nghiệp NADPH2 Quang hóa thực hai tâm quang hợp với tham gia hai hệ thống quang hóa I II Hoạt động giai đoạn quang hóa trình quang phân ly nước trình phosphoryl hóa o Quang phân ly nước: q trình quan trọng quang hợp nghiên cứu Hill cộng năm 1937 Quá trình xảy qua giai đoạn ánh sáng, diệp lục 4H2O 4OH- 4e- + 4OH 4OH Kết 4H+ + 4OH- Mn, Cl chung là: 2H2O O2 + 2H2O 4H+ + O2 + 4e- Trong sản phẩm quang phân ly nước tạo ra, O2 thải môi trường, ethực chuỗi vận chuyển điện tử quang hợp để vận chuyển ATP – q trình phosphoryl hóa, H+ kết hợp với NADP- để tạo NADPH2 o Phosphoryl hóa quang hóa: pha sáng quang hợp, sau lượng ánh sáng chuyển thành lượng điện tử hai tâm quang hợp giai đoạn quang vật lý, lượng điện tử biến thành lượng ATP, trình thực qua phosphoryl hóa quang hóa Năm 1954, Arnon phát hai hình thức phosphoryl hóa vòng phosphoryl hóa khơng vòng Đến năm 1969, ơng lại phát hình thức phosphoryl hóa đặc biệt mọng nước phosphoryl hóa vòng giả Phosphoryl hóa vòng: xảy hệ quang hóa I, q trình xảy điều kiện kỵ khí với tham gia chất oxy hóa vitamin K, ferredoxin Ánh sáng hệ I tác động vào hệ sắc tố I, điện tử giàu lượng nhận thêm lượng ánh sáng chuyển đến tâm quang hợp I (P700) Qua hệ thống vận chuyển điện tử hệ quang hóa I, điện tử di chuyển theo đường vòng: xuất phát từ P700, e- P700 nhận thêm lượng ánh sáng trở nên giàu lượng Ở trạng thái giàu lượng (trạng thái kích động điện tử sắc tố) khơng bền nên điện tử dần lượng qua chuỗi phản ứng oxy hóa khử Page Đồ án tốt nghiệp 3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng ánh sáng đèn Huỳnh quang bọc giấy kính kết hơp hai loại màu lên khả nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight sau tuần ni cấy Trong thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy lan Oncidium Kozumit Delight mơi trường chiếu sáng bước sóng khác tương ứng với loại ánh sáng đơn sắc, là: ánh sáng trắng (ánh sáng đa sắc – nghiệm thức đối chứng); ánh sáng xanh dương, ánh sáng vàng; ánh sáng đỏ đèn Huỳnh quang, nhằm tìm loại ánh sáng tương ứng với bước sóng ánh sáng thích hợp cho phát triển chồi Các kết thí nghiệm thu trình bày bảng 3.7; bảng 3.8; biểu đồ 3.7; biểu đồ 3.8; hình 3.7; hình 3.8 Page 74 Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7 Ảnh hưởng đèn chiếu sáng phối hợp tia đơn sắc từ đèn huỳnh quang bọc giấy kính kết hợp hai màu lên khả nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight sau tuần nuôi cấy Đường Chiều NT Số chồi Số 0,89a 1,00a kính Số dài lá (cm) (lá/cây) (cm) 4,00c 8,00a 2,24a cao lượng (cây/mẫu) (cây/mẫu) tươi (g) D0 Chiều Trọng 0,3344a Chiều Đặc điểm sinh Số rễ dài rễ trưởng (cm) (rễ/cây) (cm) 0,38a 1,67a 1,00a Chồi ít.lá to,rễ dài, khỏe Chồi nhiều, to, D1 8,44b 0,67a 1,0414b 3,53b 8,67a 2,74c 0,44b 7,78c 1,53c bóng, xanh đậm.rễ dài Chồi nhiều Lá D2 1,33a 2,67b 0,4190a 3,52b 29,67b 2,26a 0,34a 1,78a 1,28b phát triển tốt,nhiều rễ Chồi nhiều, to, D3 3,11a 1,22a 0,3341a 2,71a 11,44a 1,97a 0,36a 4,56b 1,43bc xanh Rễ ít, bị chết *Ghi chú: cột, số liệu giá trị trung bình ký tự a, b khơng có khác biệt mặt thống kê Các mẫu tự khác (a, b,…) sai khác có ý nghĩa thống kê với p