Phần MỞ ĐẦU Hợp chất thiên nhiên (hay hợp chất tự nhiên) chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên người tách từ loại động vật, thực vật tự nhiên có hoạt tính sinh học có tác dụng dược học dùng để làm thuốc Ngành hóa học chuyên nghiên cứu để chiết tách chuyển hóa hợp chất tự nhiên gọi ngành hóa học hợp chất thiên nhiên (hay hóa học hợp chất tự nhiên) Đây mơn khoa học có ý nghĩa quan trọng khơng ngành hóa học mà y học Một số hợp chất thiên nhiên biết đến rộng rãi y học nhóm Glycosid tim chất có tác dụng đặc hiệu bệnh tim Ngày với trình độ khoa học kỹ thuật tiên tiến ,việc xuất thành phần Glycosid tim số phận (ví dụ trúc đào, hành biển…) thực đại trà phòng thí nghiệm ,hay trung tâm nghiên cứu dược liệu nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất thuốc chữa bệnh tim cho người Cách thức tiến hành đề tài, phương pháp nghiên cứu Việc tiến hành đề tài tiến hành trình tìm hiểu kĩ tài liệu Hợp chất thiên nhiên ,cơ sở lý thuyết trình chiết tách ,dựa phương pháp luận sau : • Đầu tiên tìm hiểu vế Hợp chất thiên nhiên nói chung ,các Glycosid tim nói riêng • Một số tính chất Glycosid tim • Tìm hiểu số có chứa Glycosid tim hàm lượng Glycosid tim chứa • Tìm hiểu phương pháp chiết tách từ đưa phương pháp chiết tách glycoside tim cho phù hợp Tầm quan trọng việc tiến hành đề tài Đây đề tài hay khó có ý nghĩa quan trọng ,giúp cho sinh viên có nhìn tổng quan Hợp chất thiên nhiên, cách chiết xuất thành phần có Hợp chất thiên nhiên mà cụ thể Glycosid tim trúc đào ,cây thông thiên Từ chiết xuất, sau định tính định lượng nhằm tổng hợp thuốc trợ tim phục vụ y học, dược liệu chữa bệnh tim cho người Phần hai HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHỨA GLYCOSID TIM & PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TIM TỪ LÁ CÂY TRÚC ĐÀO VÀ CÂY THÔNG THIÊN Chương TỔNG QUAN VỀ GLYCOSID TIM 1.1.Định nghĩa Glycosid tim 1.1.1.Ðịnh nghĩa: Glycosid tim glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim Ở liều điều trị có tác dụng cường tim, làm chậm điều hoà nhịp tim Nếu q liều gây nơn làm chảy nước bọt, mờ mắt, ỉa chảy, yếu cơ, loạn nhịp tim, giảm sức co bóp tim cuối làm ngừng tim thời kỳ tâm thu tim ếch tâm trương động vật máu nóng.Glycosid tim gọi glycosid digitalic glycosid digitan (Digitalis) dùng lâm sàng để chữa bệnh tim 1.1.2.Nguồn gốc: Glycosid tim có 45 loài thực vật chủ yếu thuộc họ: Apocynaceae, Asclepiadaceae, Celastraceae (Dây gối) , Cruciferae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Liliaceae, Meliaceae, Moraceae, Ranulculaceae, Scrophulariaceae, Sterculiaceae, Tiliaceae (Ðay), số côn trùng, glycosid tim có phận: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ, dò, nhựa mủ 1.1.3 Cấu trúc hoá học, phân loại Glycosid tim glycosid khác cấu trúc hoá học gồm hai phần: phần đường phần không đường (aglycon) 1.1.3.1 Phần khơng đường Phần khơng đường chia thành hai phần nhỏ: phần hydrocacbon mạch nhánh vòng lacton Phần hydrocacbon: dẫn chất 10,13-dimetyl xyclopentanopehydrophenantren (steroid)(10,13-dimethyl-hexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene) Ðính vào nhân có nhóm chức có chứa oxy Vòng lacton : Phần aglycon glycosid tim ngồi khung hydrocacbon nói đặc biệt có vòng lacton nối vào vị trí C-17 khung Vòng lacton coi mạch nhánh Hầu hết chất có tác dụng dược lý có vòng lacton hướng b Dựa vào vòng lacton nối vào vị trí C-17 người ta chia glycosid tim thành hai nhóm: - Nếu vòng lacton có cacbon có nối đơi vị trí a-b Những aglycon có vòng lacton có 23 cacbon glycosid tim thuộc nhóm cardenolid - Nếu vòng lacton có cacbon , có hai nối đơi -> aglycon có 24 cacbon ->glycosid tim thuộc nhóm bufa dienolid 1.1.3.2 Phần đường: Phần đường nối vào OH C-3 aglycon Chođến người ta biết khoảng 40 loại đường khác Ngoài đường thơng thường D-glucose, Lramnose, D-fucose, D-xylose có gặp nhóm glycosid khác, lại đường gặp glycosid tim Trong đường đáng ý đường 2,6-desoxy Dưới số đường 2,6-desoxy hay gặp: Những đường có đặc tính sau: dễ bị thuỷ phân, cho phản ứng màu với thuốc thử Kele-Kiliani, thuốc thử Xanthydrol Mạch đường monosacarit oligosacarit Gitoxin-xelobiozit có digitan tía có mạch đường với đơn vị đường đơn: Gitoxin-xelobiozit = Gitoxygenin + (digitoxoza)3 + (glucose)2 Ví dụ, số genin Glycozit trợ tim thường gặp : Hình 1.1 số genin Glycozit trợ tim 1.1.4 Tính chất: - Các glycosid tim chất kết tinh, không màu, vị đắng, có suất quay cực, tan nước, cồn, không tan benzen,ete, - Các glycosid tim nhạy cảm với thay đổi pH môi trường., glycosid tim có đường 2-desoxy dễ thuỷ phân đun với acid vô 0,05 N metonol 30 phút glycosid khác điều kiện không thuỷ phân Trong môi trường kiềm cacdenolid chuyển thành dẫn chất iso dây nối este bị cắt ( có) khơng hoạt tính Glycosid dễ bị thuỷ phân enzim.Thường enzim có sẵn cây, có khả cắt bớt phần glucose để chuyển thành glycosid thứ cấp Ví dụ: digilanidaza digitan lơng, digipuapidaza digitan tía, strophantobiaza hạt Strophanthus courmonti, xilarenaza Scilla maritima 1.1.5 Phân bố Glycosid tim phân bố hầu hết thực vật Một số dược liệu chứa glycosid tim: Dương địa hồng, Hành biển, Thơng thiên, Trúc đào, Strophanthus, đay … Glycosod tim có thân ,lá ,quả ,rể ,củ,cành ,vỏ tồn 1.2 Định tính & Định lượng 1.2.1.Các thuốc thử định tính định lượng: Các thuốc thử để định tính định lượng chủ yếu dựa thuốc thử tạo màu ánh sáng thường tạo huỳnh quang ánh sáng cực tím Trước tiến hành phản ứng, Chiết: - Loại tạp ete dầu hoả benzen - Chiết cồn - Pha loãng cồn loại tạp dung dịch chì acetat 15%, lọc - Chiết glycosid dịch lọc cloroform hỗn hợp cloroform-etanol 4:1 - Bốc dịch chiết hồ glycosid dung mơi thích hợp để tiến hành phản ứng Các thuốc thử chia thành hai loại: loại thuốc thử phản ứng với phần đường 2-desoxy loại thuốc thử phản ứng với aglycon 1.2.2 Các thuốc thử tác dụng lên phần đường: 1.2.2.1 Thuốc thử Xanthydrol Thuốc thử dương tính với đường 2-desoxy glycosid có đường Phản ứng cho màu đỏ mận rõ ổn định.Phản ứng nhạy với đường 2-desoxy acetyl hố âm tính với đường 2-desoxy nối với glucose vị trí 4.Các đường 6-desoxy âm tính với thuốc thử này.Phản ứng dùng để định tính định lượng Thuốc thử gồm 10mg xanthydrol hoà tan 99 ml acid acetic đặc thêm ml HCl đặc, trộn Tiến hành phản ứng: Lấy khoảng 20-200 mg glycosid cho vào ống nghiệm khô, thêm ml thuốc thử trộn đều, đậy nút bông, đặt nồi cách thuỷ sơi phút sau làm lạnh cách ngâm phút vào nước đá để nhiệt độ phòng 10 phút Ðọc quang phổ kế bước sóng 550 nm Ðể định tính khơng cần làm lạnh phản ứng tiến hành sau: Hoà it glycosid vào metanol, cho thêm vài giọt xanthydrol, đun nồi cách thuỷ cho khô cạn, hồ cặn vào acid acetic Sau cho thêm acid chlohydric vào đun sơi nồi cách thuỷ có màu đỏ thẫm 1.2.2.2 Thuốc thử acid photphoric đặc Thuốc thử dương tính với đường 2-desoxy glycosid có đường Phản ứng dùng để định tính định lượng 1.2.2.3 Thuốc thử Kele-Kiliani thuốc thử pha thành hai dung dịch, dung dịch gồm 100 ml acid acetic kết tinh trộn với ml dung dịch FeCl 5% Dung dịch gồm 100 ml H2SO4 đậm đặc trộn với ml dung dịch FeCl 5% Hoà tan mg glycosid vào dung dịch chồng thêm dung dịch Mặt ngăn cách có màu đỏ màu nâu đen lớp có màu xanh từ khuyếch tán lên Ðộ nhạy phản ứng thuốc thử xanthydrol Màu không ổn định 1.2.3 Các thuốc thử tác dụng lên phần aglycon Các thuốc thử chia thành hai nhóm, nhóm phản ứng lên nhân steroid nhóm phản ứng lên vòng laclon 1.2.3.1.Xác định phần steroid 1.2.3.1.1 Phản ứng Libermanm: Hồ glycosid vào vài ml anhydrid acetic, rót cẩn thận dung dịch lên thành mặt kính đồng hồ có chứa H 2SO4 đậm đặc Lớp anhydrid acetic có màu xanh vàng sau thành xanh sáng Phản ứng Libermanm- Burchard: Phản ứng không lên màu với glycosid tim mà lên màu với nhiều dẫn chất có nhân steroid khác Hồ glycosid vào vài giọt acid acetic, kết tinh trộn với hỗn hợp anhydrid acetic acid sulfuric đặc Sẽ có màu hồng chuyển sang xanh Cơ chế phản ứng khử nước acid mạnh 1.2.3.1.2 Thuốc thử acid photphoric Acid photphoric phản ứng với phần đường 2- desoxy (nt) tác dụng lên phần aglycon cho huỳnh quang 1.2.3.1.3 Thuốc thử Tatgie gồm Acid photphoric, H2SO4 FeCl3 1.2.3.1.4 Phản ứng Rozenhem: Hồ glycosid vào chloroform, thêm dung dịch acid trichloacetic 90% xuất màu hồng tím, xanh biển Xác định phần lacton cạnh chưa no Các glycosid aglycon thuộc nhóm cacdenolid cho phản ứng với dẫn chất nitro thơm mơi trường kiềm tạo nên sản phẩm màu đỏ đến tím Phản ứng phụ thuộc vào nhóm metylen hoạt động vòng butenolit Một số hợp chất tự nhiên khác có phần cấu trúc tương tự ( b -thuyon, piperitenon, benzalaceton) dương tính với thuốc thử 1.2.3.1.5 Phản ứng Baljiet Cho glycosid tác dụng với dung dịch acid picric môi trường kiềm cho màu đỏ da cam tạo phức Meisenhemer, màu tương đối bền nên dùng để định tính định lượng Cơ chế phản ứng tạo thành phức: 1.2.3.1.6 Phản ứng Kedde: Thuốc thử dung dịch 3,5-dinitrobenzoic acid 2% etanol Chất thử hoà tan etanol, thêm thuốc thử thêm dung dịch xút, phản ứng có màu đỏ tía Màu ổn định, dùng để định lượng ( đọc bước sóng 540 nm.) 1.2.3.1.7.Phản ứng Raymond- Mactu: Thuốc thử m.dinitrobenzen 1% cồn tuyệt đối, thực mơi trường kiềm Phản ứng có màu tím, có xanh, màu khơng bền Ngồi thuốc thử nitro thơm nói người ta thấyd số thuốc thử khác 2,4 - dinitrophenylsunfon, 3,5 - dinitroanizol cho màu với nhóm cacdenolid 1.2.3.1.8 Phản ứng Legal: Cho glycosid tác dụng với dung dịch natri nitroprussiat môi trường kiềm xuất màu đỏ, màu nhanh Tiến hành phản ứng: Các chất thuộc nhóm cacdenolit hoà vào pyridin thêm dung dịch natri nitroprussiat 0,3 - 0,5% sau thêm xút 10 -15% để đảm bảo kiềm thừa xuất màu đỏ Các thuốc thử tác dụng lên vòng butenolid nói âm tính với dẫn chất thuộc nhóm bufadienolid.Muốn phát hiên nhóm dùng thuốc thử SbCl3 chloroform, có màu tím sau đun nóng.Tốt dựa vào quang phổ tử ngoại 1.2.3 Sắc ký: Ðể xác định , đối chiếu tách chất để nghiên cứu ta tiến hành sắc ký giấy sắc ký lớp mỏng Ðể màu dùng thuốc thử nói phần thường dùng thuốc thử Keđe ( màu đỏ), thuốc thử RaymonMactu ( màu tím) Các dẫn chất có đường 2-desoxy dùng thuốc thử xanthydrol Phổ tử ngoại Nhóm cacdenolid có đỉnh hấp thu cực đại vùng 215-218 nm log e khoảng 4,1; phân tử có thêm nhóm cacbonyl có đỉnh vai 272 - 305 nm, chất bufadienolid có đỉnh hấp thu cực đại khoảng 300 nm, loge khoảng 3,7 1.3 Ứng dụng Glycosid Tim dược liệu 3.1 Thuốc loại glycosid (glycosid trợ tim) Hiện digoxin digitoxin dùng lâm sàng Digitoxin khác digoxin khơng có OH C12 tan nước hơn.Các thuốc loại có đặc điểm chung: Tất có nguồn gốc từ thực vật: loài Digitalis, Strophantus Cấu trúc hố học gần giống nhau: có nhân steroid nối với vòng lacton khơng bão hòa C17, gọi aglycon genin, có tác dụng chống suy tim Vị trí C3 nối với nhiều phân tử đường(ose), khơng có tác dụng dược lý ảnh hưởng đến dược động học thuốc 1.3.2 Tác dụng digitalis: Tác dụng tim Đây tác dụng chủ yếu: digitalis làm tâm thu ngắn mạnh, tâm trương dài ra, nhịp tim chậm lại Nhờ đó, tim nghỉ nhiều hơn, máu từ nhĩ vào thất thời kỳ tâm trương nhiều hơn, cung lượng tim tăng nhu cầu oxy giảm Do bệnh nhân đỡ khó thở nhịp hơ hấp trở lại bình thường Digitalis làm giảm dẫn truyền nội tăng tính trợ tim nên tim bị loạn nhịp, thuốc làm nhịp trở lại 1.3.3 Các tác dụng khác Trên thận: digitalis làm tăng thải nước muối nên làm giảm phù suy tim Cơ chế tác dụng là: mặt, digitalis làm tăng cung lượng tim, nên nước qua cầu thận tăng; mặt khác, thuốc ức chế ATPase màng tế bào ống thận làm giảm tái hấp thu natri nước - Trên trơn: với liều độc, ATPase “bơm” Na + - K+ bị ức chế, nồng độ Ca 2+ tế bào thành ruột tăng làm tăng co bóp trơn dày, ruột (nơn, lỏng), co thắt khí quản tử cung (có thể gây xảy thai) - Trên mơ thần kinh: digitalis kích thích trực tiếp trung tâm nơn sàn não thất phản xạ từ xoang cảnh, quai động mạch chủ 1.3.4 Chế phẩm liều lượng 1.3.4.1 Digitoxin Nồng độ điều trị huyết tương 10 - 25 ng/ mL, nồng độ độc > 35 ng/ mL Liều điều trị: 0,05- 0,2 mg/ ngày Chế phẩm: viên nén 0,05 0,1 mg 1.3.4.2 Digoxin Nồng độ điều trị huyết tương 0,5 - 1,5 ng/ mL, nồng độ độc 0,2ng/ mL Liều điều trị: 0,125- 0,5 mg/ ngày.Chế phẩm: viên nén 0,125- 0,25-0,5mg ống tiêm 0,1- 0,25 mg/ Ml Chương CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT 2.1 Phân loại phương pháp chiết xuất 10 -Ngược dòng -Xi dòng -Chéo dòng 2.1.5 Dựa vào trạng thái làm việc hai pha,có phương pháp -Ngâm -Ngấm kiệt 2.1.6 Dựa vào biện pháp kỹ thuật đặc biệt Có thể rút ngắn thời gian chiết Phương pháp sau : -Phương pháp siêu âm - Phương pháp tạo dòng xốy - Phương pháp mạch nhịp 2.2 Một số phương pháp chiết xuất 2.2.1 Phương pháp chiết xuất gián đoạn 2.2.1.1 Phương pháp ngâm Phương pháp ngâm phương pháp đơn giản có từ thời xưa Tiến hành: sau chuẩn bị nguyên liệu ,người ta đổ dung môi ngập dược liệu bình chiết xuất,sau thời gian rút lấy dịch chiết (lọc gạn), khuấy trộn để tăng cường hiệu chiết xuất Có nhiều cách ngâm: ngâm tĩnh ngâm động,ngâm nóng ngâm lạnh,ngâm lần hay nhiều lần • Ưu điểm : phương pháp đơn giản,thiết bị rẻ tiền • Nhược điểm :năng suất thấp ,thao tác thủ cơng,khó chiết hết dược liệu chiết lần 2.2.1.2 Phương pháp ngấm kiệt Sau chuẩn bị nguyên liệu ,người ta đổ dung môi ngập dược liệu bình chiết xuất,sau thời gian rút lấy dịch chiết(lọc gạn),rút nhỏ giọt dịch chiết phía dưới,đồng thời bổ sung dung mơi,cho dung mơi chảy chậm.Lớp dung mơi ngập dược liệu khoảng 3-4 cm • Ưu điểm : dược liệu chiết kiệt -Tiết kiệm dung mơi (tái ngấm kiệt) • Nhược điểm: 12 -Năng suất thấp,còn thủ cơng -Tốn dung mơi -Cách tiến hành phức tạp so với phương pháp ngâm 2.2.2 Phương pháp chiết xuất bán liên tục Phương pháp có sử dụng hệ thống thiết bị gồm nhiều bình chiết khác nhau,gồm dãy 4-16 bình chiết mắc nối tiếp,ở trình coi ngược chiều tương đối thực tế dược liệu khơng chuyển động • Ưu điểm (so với Phương pháp chiết xuất gián đoạn) -Dịch chiết đậm -Dược liệu chiết kiệt • Nhược điểm: -Hệ thống thiết bị cồng kềnh,tốn nhiều diện tích -Vận hành phức tạp,thao tác thủ công 2.2.3 Phương pháp chiết xuất liên tục Phương pháp thực thiết bị làm việc liên tục,dược liệu dung môi cho vào liên tục ngược chiều Ưu điểm -Năng suất làm việc cao,tiết kiệm thời gian chiết -Hệ thống làm việc tự động -Dịch chiết đậm đặc chiết kiệt -Dung mơi tốn • Nhược điểm: -Thiết bị kết cấu phức tạp,đắt tiền -Vận hành phức tạp • Chương PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TIM TỪ LÁ CÂY TRÚC ĐÀO 3.1 Giới thiệu đôi nét trúc đào 3.1.1 Trúc đào: loài bụi hay gỗ nhỏ, thường xanh họ La bố ma (Apocynaceae) Nó lồi phân loại chi Nerium 13 Hình 3.1.Một bụi trúc đào thành phố Long Xuyên.Việt Nam Nó lồi địa khu vực rộng từ Morocco Bồ Đào Nha kéo dài phía đơng tới khu vực Địa Trung Hải miền nam châu Á.[1] Thơng thường lồi mọc xung quanh lòng suối khơ Nó cao tới 2–6 m, với cành mọc gần thẳng Các mọc thành cặp hay vòng xoắn gồm ba lá, dầy bóng da, màu lục sẫm, hình mũi mác hẹp, dài khoảng 5–21 cm rộng 1-3,5 cm, mép nhẵn Hoa mọc thành cụm đầu cành; màu trắng, vàng hay hồng (tùy theo giống), đường kính 2,5–5 cm, tràng hoa thùy với tua bao quanh ống tràng trung tâm tràng hoa Thơng thường (nhưng khơng phải ln ln) hoa trúc đào có hương thơm Quả loại nang dài hẹp, kích thước dài 5–23 cm, nứt chín để giải phóng hạt nhỏ phủ đầy lơng tơ 3.1.2 Độc tính Trúc đào lồi thực vật có độc tính cao chứa nhiều hợp chất có độc, nhiều hợp chất số gây tử vong người, đặc biệt trẻ em Độc tính trúc đào coi cao có nhiều thông báo cho thấy số trường hợp cần lượng nhỏ đủ gây hậu tử vong hay cận kề tử vong (Goetz 1998) Đáng kể số chất độc oleandrin neriin, cácglicozit tim mạch (Goetz 1998) Chúng có mặt tồn phận lồi này, chủ yếu tập trung nhựa 14 Người ta cho trúc đào chứa nhiều hợp chất chưa rõ hay chưa nghiên cứu khác chúng có tác động nguy hiểm (Inchem, 2005) Vỏ trúc đào chứa rosagenin, có tác động tương tự strychnin.Tồn này, bao gồm nhựa màu trắng sữa độc phận gây phản ứng có hại cho sức khỏe 3.1.3 Các triệu chứng ngộ độc Hình 3.2.Oleandrin, chất độc có trúc đào Ăn phải trúc đào gây triệu chứng đường ruột tim mạch Các triệu chứng đường tiêu hóa bao gồm buồn nơn nôn mửa, tiết nhiều nước bọt, tổn thương vùng bụng, tiêu chảy lẫn hay khơng lẫn máu, đặc biệt ngựa đau bụng (Inchem 2005) Các triệu chứng đường tim mạch bao gồm loạn nhịp tim, với đặc trưng nhịp nhanh sau chậm mức bình thường Tim đập thất thường khơng có dấu hiệp nhịp cụ thể Các trường hợp nghiêm trọng dẫn tới nhợt nhạt da lạnh tuần hồn máu hay khơng ổn định Các tác động ngộ độc lồi tác động tới hệ thần kinh trung ương Các triệu chứng bao gồm thờ thẫn, run rẩy chân tay cơ, tai biến ngập máu, xẹp chí mê dẫn tới tử vong Nhựa trúc đào gây tấy rát da, sưng, tấy rát mắt nghiêm trọng phản ứng dị ứng đặc trưng viêm da 3.2 Phương pháp chiết xuất glycoside tim trúc đào 3.2.1 Sơ đồ quy trình chiết tách 15 10 g trúc đào,tán nhỏ Bình nón 250 ml Thêm 100 ml cồn 25% Ngâm 24 h Gạn dịch chiết vào bình 100 ml Thêm 3ml chì acetat 30% khuấy Lọc Chiết cloroform lần ,mỗi lần ml Loại nước Tiến hành natrisulfat khan phản ứng định tính định lượng Dịch chiết 16 3.2.2 Thuyết minh quy trình Cân khoảng 10g Trúc đào khô tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 250ml Thêm 100ml cồn 25% ngâm 24 Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ dung tích 100ml Nhỏ vài giọt dịch lọc vào ống nghiệm, thêm giọt chì acetat Nếu xuất tủa ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại tiếp tục thử đến dịch lọc khơng tủa với chì acetat Chuyển tồn dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Chiết glycosid tim cách lắc với cloroform lần, lần 8ml Gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ sấy khơ Gộp dịch chiết chloroform loại nước natrisulfat khan 17 Chia dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ sấy khô Đặt ống nghiệm lên giá bốc nồi cách thủy đến khô Cắn thu đem tiến hành làm phản ứng định tính sắc ký lớp mỏng 3.2.3 Tiến hành phản ứng định tính 3.2.3.1 Phản ứng Liberman Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 1ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Ở mặt tiếp xúc hai lớp chất lỏng xuất vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh 3.2.3.2 Phản ứng Baljet Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to phần dung dịch acid picric 1% phần dung dịch NaOH 10% Lắc Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha xuất màu đỏ da cam So sánh màu sắc với ống chứng ống khơng có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng 3.2.3.3 Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Nhỏ giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc xuất màu đỏ cam So sánh màu sắc với ống chứng ống khơng có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam đậm ống chứng 18 Chú ý: Các phản ứng vòng lacton cho màu sắc khơng bền nên cần quan sát màu sau nhỏ thuốc thử 3.2.3.4 Phản ứng Keller-Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90% Lắc cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha acid acetic Lắc Nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulphuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Ở mặt tiếp xúc lớp chất lỏng xuất vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía có màu xanh 3.2.3.5 Phản ứng Xanthydrol Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycosid tim 0,5 ml thuốc thử Xanthydrol Ðun ống nghiệm nồi cách thuỷ sôi phút, xuất màu đỏ 3.2.4 Sắc ký lớp mỏng Dịch chấm sắc ký: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim giọt CHCl3 - EtOH (1 : 1), lắc nhẹ để hòa tan cắn dịch chấm sắc ký Lấy 1mg tinh thể Neriolin chuẩn hòa tan 0,5ml CHCl - EtOH (1 : 1), lắc nhẹ dung dịch Neriolin chuẩn để chấm sắc ký Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), hoạt hóa 1100C giờ, bảo quản bình hút ẩm để chấm sắc ký Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký dung dịch Neriolin chuẩn lên 19 mỏng silicagel kích thước x 10cm Hệ dung mơi khai triển: CHCl3 - n-BuOH (9 : 0,5) Bình sắc ký bão hòa dung mơi khai triển Sau khai triển sắc ký, quan sát vết đèn tử ngoại bước sóng 254nm 366nm, sau phun thuốc thử vanilin 1%/ H2SO4 Kết quả: Sắc ký đồ dịch chiết cắn glycosid tim từ Trúc đào phải có vết tương ứng với vết Neriolin chuẩn với Rf = 0,75, có màu xanh đen bước sóng 254nm Chương PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TIM TỪ HẠT CÂY HƠNG THIÊN 4.1 Giới thiệu đơi nét thông thiên 4.1.1 Tên : Thông thiên, đầu tây Mô tả : Cây nhỏ, cao - 3m Cành mang nhiều vết sẹo rụng để lại Lá mọc so le, hình mác hẹp, gân rõ.Hoa to, màu vàng tươi mọc thành xim gồm - kẽ gần ngọn.Quả hạch, có cạnh nhẵn.Hạt màu nâu.Tồn có nhựa mủ trắng 20 Hình 4.1 Cây thơng thiên Phân bố : Cây nhập trồng làm cảnh khắp nơi Bộ phận dùng : Hạt Thu hái chín Phơi khơ.Khi dùng, đập vỡ vỏ, lấy nhân Thành phần hóa học : Hạt thông thiên chứa glucosid trợ tim theventin (A, B) 2`-O-acetyl cerberosid, neriifolin, cerberin, peruvosid, theveneriin, acid peruvosidic Công dụng : Thuốc trợ tim, chữa suy tim Dùng hoạt chất thevetin chiết từ hạt dạng dung dịch 1o/oo để uống, ngày - 2ml, dạng ống tiêm 2ml = 1mg, ngày - ống.Hạt giã nát dùng làm thuốc trừ sâu.Thuốc độc 4.1.2 Thành phần hố học Hạt Thơng thiên chứa glycosid tim thuỷ phân cho phần aglycon cannogenin, cannogenol, digitoxigenin, acid cannogenic: - Thevetin A: Cannogenin + L-thevetose + D-glucose + D-glucose 21 - Peruvosid: Cannogenin + L-thevetose -Acetyl peruvosid: Cannogenin + acetyl L-thevetose -Theveneriin: Cannogenol + L-thevetose - Thevetin B: digitoxigenin + L- thevetose + D-glucose + D-glucose - Acetyl thevetin B: digitoxigenin + acetyl L-thevetose + (glucose)2 -Thevebiosid: digitoxingenin + L- thevetose + D glucose - Neriifolin: Digitoxingenin + L-thevetose - Acetyl? neriifolin: Digitoxingenin + acetyl L-thevetose -Thevefolin: uzarigenin + L-thevetose (uzarigenin khác digitoxingenin cấu hành C5) - Perusitin: acid cannogenic + L-thevetose Thevetin tên gọi hai chất thevetin A thevetin B Hai chất có độ chảy gần giống (190 - 1950C) đồng kết tinh Trong hạt lượng neriifolin chiếm nhiều đến - 8% Hạt chứa flavonoid methylether apigenin iridoid glucosid thevesid Thevetosid hỗn hợp glucosid tim chiết từ hạt Thông thiên gồm peruvosid, neriifolin cerberin Ngồi chất glucosid khác chưa xác định tên 4.2 Chiết xuất: Hạt loại chất béo ether dầu hoả chiết methanol nóng, bốc dung mơi, dùng cắn thực phản ứng định tính sắc ký lớp mỏng Q trình định tính sắc ký lớp mỏng tương tự phương pháp chiết xuất trúc đào 4.3 Tác dụng công dụng Những chế phẩm từ Thơng thiên có tác dụng điển hình thuốc cường tim tăng cường sức co bóp tim Với liều điều trị, thuốc làm chậm nhịp tim, với liều lớn lại gây ngộ độc, làm nhịp tim đập nhanh, rối loạn nhịp cuối ngừng đập thời kỳ tâm thu Tác dụng cường tim chế phẩm từ 22 Thông thiên xuất nhanh, thời gian trì tác dụng ngắn, hấp thu tốt qua đường tiêu hố, độ tích luỹ thể thấp Do đó, chế phẩm dùng điều trị dài ngày mà khơng có tượng ngộ độc tích luỹ Hiệu lực chế phẩm từ Thông thiên thuốc cường tim khác thường biểu thị đơn vị mèo, ếch, bồ câu chuột lang Phần ba KẾT LUẬN Dựa vào kỹ thuật tách chiết với có mặt chloroform ta thu cắn glycosid tim ,sau tiến hành phản ứng định tính định lượng trước sắc ký mỏng silicagel Để thu dịch chiết có hiệu suất cao ,đòi hỏi kỹ thuật viên thao tác cẩn thận xác, trình lọc phải thực nhiều lần để lấy tồn dịch chiết Trong khuôn khổ đề tài cho, em hồn thành “ tìm hiểu phương pháp chiết xuất glycosid tim trúc đào hạt thông thiên” ,đây hai loại điển hình chứa họ glycosid tim, ngồi loại này,còn có nhiều khác chứa họ glycosid tim phương pháp chiết xuất tương tự ,tuy nhiên cần ý đến hệ dung môi dung để tách cho trình tách hiệu quả,thu hiệu suất cao 23 Phần bốn PHỤ LỤC CÁC LOẠI CÂY CĨ CHỨA GLYCOSID TIM DƯƠNG ĐỊA HỒNG Tên khác: Mao địa hoàng, Địa chung hoa, Digital Tên khoa học: Digitalis purpurea L.; Digitalis lanata Ehr số loài Digitalis khác, họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae) Mơ tả: Cây sống năm, tạo thành năm đầu vòng hoa thị gốc; phiến dài 10-30cm, hình bầu dục có lơng mềm; năm thứ hai, tạo cán hoa lá, cao tới 1-2m phân nhánh Hoa có màu tía đẹp, hình chng, dạng ngón găng tay; phần hoa sáng với Bộ chấm màu phận sẫm Ra dùng: Lá hoa tháng (Folium 5-9 Digitalis) Phân bố: Cây châu Âu, ta nhập trồng Hà Nội (Văn Điển), Vĩnh Phú (Tam Đảo) Thu hái: Thu hái Lào năm đầu Cai vào mùa (Sapa) thu, phơi khơ Thành phần hố học: Các glycosid tim: có digitoxin (0,15-0,79g/kg khơ), gitoxin (0,1-0,7g/kg khơ) gitalin, girorin, girotin Còn có tanin, inositol, luteolin nhiều acid chất béo Tác dụng: Với liều dược dụng, làm cho tim hoạt động, làm cho hưng phấn, cường tim, tăng thêm sức co bóp tim làm cho tim đập dịu; có tác dụng lợi tiểu Với liều cao, gây độc mạnh Công dụng: Làm thuốc trường hợp suy tim nhịp không đều; làm nguyên liệu chiết xuất glycosid tim HÀNH BIỂN Hành biển - Scilla maritima L (Urginea maritima (L.)Bak.), thuộc họ Hành biển - Hyacinthaceae 24 Mô tả: Cây thảo mọc thẳng sống nhiều năm cao 18-20cm, có củ to 10-15cm, màu nâu đo đỏ nhiều vẩy kết hợp Lá hẹp, dài 30-40cm hay hơn, không lông Cụm hoa xuất trụi lá, vào mùa hè, cao 30-150cm, có bắc dài 1,2-1,5cm, mỏng, màu lục mốc mốc Hoa có đài, cánh hoa cao 1cm màu trăng trắng, nhị, noãn; cuống hoa dài 1,5cm Quả nang có góc, ngăn có 3-4 hạt Cây rụi vào mùa hè xuất vào mùa thu đông Bộ phận dùng: Củ - Bulbus Scillae Có thể dùng tồn Nơi sống thu hái: Cây gốc sống Địa Trung Hải, nhập trồng làm thuốc chưa phát triển rộng Thu hái củ vào mùa hè, dùng tươi hay phơi khô Thành phần hóa học: Củ chứa glucoscillaren A, scillaren A, proscillaridin A, scillaridin A, scilliglancoside, scilliphaeoside, glycoscilliphaêoside, scillicyanoside, scillicoeloside, scillazuroside, scillicryptoside Còn có flavonoid stigmasterol, phytosterol oxalat calcium Tính vị, tác dụng: Vị hắc đắng, khơng mùi, tính mát, độc; có tác dụng trợ tim, lợi tiểu, long đờm, tiêu viêm Công dụng, định phối hợp: châu Âu, châu Phi, người ta dùng nước ngâm nước sắc hoa để diệt sâu bọ Dùng làm thuốc thông tiểu, viêm thận bí đái nitơ; dùng làm thuốc long đờm bệnh khí thủng phổi, ho gà, viêm phế quản Liều dùng 0,10-0,30g ngày, tối đa 1g 24 Cũng dùng làm thuốc diệt chuột diệt sâu bọ (cắt nhỏ củ, đồ với cồn acetic, sau đun sơi với cồn acetic, lọc lấy riêng nước ra, bã lại chiết cồn sơi; hợp hai thứ dịch chiết lại cô tới độ cao mềm; Cao có tác dụng mạnh gấp lần bột, gấp lần cao chế theo phương pháp thơng thường) Ghi chú: Tồn có độc Nó gây viêm ống tiêu hố, nơn mửa, ỉa lỏng, làm niệu, khơng dùng Hành biển viêm thận hay viêm ruột Nếu dùng 25 liều dùng lâu ngày có triệu chứng đái máu, vô niệu, nôn mửa, ỉa chảy, mạch nhanh nhỏ, vật vã, chết ngừng tim Ngoài số loại khác đay ,dây gối,mướp đắng… TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Hợp chất thiên nhiên-TS.Nguyễn Văn Bời-ĐHCN.TPHCM Giáo trình chuyên đề Hợp chất thiên nhiên – thầy Lê Văn Đăng – ĐHSP.TPHCM http://www.hopchatthiennhien.wordpress.com/ http://www.duoclieu.org/ http://www duoclieu.net/ www.vinabook.com 7.Chemistry of Natural Compounds -www.springer.com 26 ... ,giúp cho sinh viên có nhìn tổng quan Hợp chất thiên nhiên, cách chiết xuất thành phần có Hợp chất thiên nhiên mà cụ thể Glycosid tim trúc đào ,cây thông thiên Từ chiết xuất, sau định tính định... ,dây gối,mướp đắng… TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình Hợp chất thiên nhiên- TS.Nguyễn Văn Bời-ĐHCN.TPHCM Giáo trình chuyên đề Hợp chất thiên nhiên – thầy Lê Văn Đăng – ĐHSP.TPHCM http://www.hopchatthiennhien.wordpress.com/... tim phục vụ y học, dược liệu chữa bệnh tim cho người Phần hai HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHỨA GLYCOSID TIM & PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TIM TỪ LÁ CÂY TRÚC ĐÀO VÀ CÂY THÔNG THIÊN Chương TỔNG QUAN