Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE UỐN VÁN I GIỚI THIỆU VỀ BỆNH UỐN VÁN: Giới thiệu chung:  Uốn ván bệnh nhiễm trùng cấp tính có tỷ lệ tử vong cao ngoại độc tố trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani) gây Trực khuẩn phát triển vết thƣơng điều kiện yếm khí, sau giải phóng ngoại độc tố vào máu công vào vận động thần kinh – cơ, làm cho bệnh nhân bị co cứng cứng xuất co giật Lịch sử nghiên cứu bệnh uốn ván:  Năm 1884 Nicolaier tìm thấy trực khuẩn uốn ván gây bệnh  Năm 1889 Kitasato nuôi cấy đƣợc trực khuẩn uốn ván mơi trƣờng kỵ khí  Năm 1890 Faber tìm thấy ngoại độc tố trực khuẩn uốn ván vai trò gây bệnh  Sau đó, Von Behring Kitasato dùng huyết kháng độc tố uốn ván để điều trị bệnh uốn ván  Năm 1925 Ramon chế tạo đƣợc giải độc tố uốn ván làm vaccine phòng bệnh Vi khuẩn uốn ván Clostridium tetani: a Đặc điểm sinh học:  Hình thái:  Trực khuẩn thẳng mảnh, cong, dài từ 3-4 µm, rộng khoảng 0,4µm, khơng có vỏ, bắt màu Gram dƣơng nuôi cấy mơi trƣờng đặc vi khuẩn dài nhƣ sợi bắt màu gram, nuôi cấy lâu vi khuẩn dễ dàng màu gram Vi khuẩn có lơng di động mạnh mơi trƣờng kỵ khí Khi gặp điều kiện sống không thuận lợi vi khuẩn sinh nha bào thân nằm đầu làm cho vi khuẩn có dạng hình đinh ghim thấy dễ tiêu nhuộm gram, nhiệt độ thích hợp để tạo nha bào 37oC, nhiệt độ 24oC hình thành nha bào 4-10 ngày, 42oC khơng tạo nha bào Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Nuôi cấy:  Trực khuẩn uốn ván kỵ khí tuyệt đối, phát triển tốt mơi trƣờng thơng thƣờng, trực khuẩn uốn ván khơng cần nguồn dinh dƣỡng lớn chuyển hóa đơn giản, nhiệt độ 35°C pH = 7,3 kỵ khí tuyệt đối điều kiện thuận lợi cho trực khuẩn uốn ván phát triển  Các mơi trƣờng kỵ khí dùng cấy vi khuẩn uốn ván nhƣ mơi trƣờng Brewer có chứa hóa chất khử oxy hòa tan nhƣ natrithioglycolate, gluthation, mơi trƣờng canh thang thịt băm hay gan cục Trong môi trƣờng vi khuẩn phát triển làm đục môi trƣờng có cặn lắng  Mơi trƣờng đặc nhƣ thạch Veillon thạch VF, vi khuẩn uốn ván phát triển tạo khuẩn lạc vẩn nhƣ màu trắng đục, vi khuẩn sinh nhiều làm nứt thạch  Đặc điểm hóa sinh:  Trực khuẩn uốn ván làm lỏng gelatin chậm, không làm đông sữa, không phân giải protein, sinh indol, lên men yếu loại đƣờng: arabinose, galactose, lactose sucrose Trong môi trƣờng canh thang glucose, trực khuẩn uốn ván sinh axeton Nó khơng chuyển hóa nitrat thành nitrit, nhƣng có khả gây nên tan máu  Khả đề kháng:  Nha bào tồn nhiều năm môi trƣờng bên  Vi khuẩn trạng thái dinh dƣỡng dễ bị giết chết đun 56oC 30 phút, nhƣng trạng thái nha bào vi khuẩn trở nên đề kháng, để giết chết nha bào phải hấp nồi áp suất 120oC 30 phút ngâm dung dịch phenol 5% 8-10 đặc điểm cần lƣu ý tiệt trùng dụng cụ y tế  Độc tố:  Độc tố trực khuẩn uốn ván ngoại độc tố, chất protein, có trọng lƣợng phân tử vào khoảng 150K Dalton, bao gồm số lƣợng lớn acid amin Độc tố uốn ván khơng có ích cho vi khuẩn, khơng phá hủy cấu trúc tổ chức để giúp vi khuẩn xâm nhập vào mô động vật Độc tố uốn ván có hai loại: độc tố trực khuẩn uốn ván không bắt màu Gram độc tố trực khuẩn uốn ván bắt màu Gram có độc tính cao Độc tố gồm hai phần: + Tetanolysin: tác dụng làm tan hồng cầu thỏ, ngƣời ngựa, gây hoại tử Độc tố có vai trò phụ gây bệnh + Tetanospasmin: độc tố thần kinh Phần độc tố gây nên triệu chứng đặc hiệu bệnh uốn ván Đây độc tố không chịu nhiệt, bị bất Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU hoạt nhiệt độ 65°C sau phút bị tiêu huỷ nhanh chóng men proteinase, đặc biệt dịch tiêu hóa Đây loại độc tố có tính kháng ngun mạnh, dùng để sản xuất vaccine phòng bệnh  Dựa vào kháng ngun lơng vi khuẩn uốn ván có khoảng 10 type, tất 10 type tạo ngoại độc tố mạnh Khi xử lý độc tố uốn ván formarlin nhiệt độ làm độc tính nhƣng trì tính chất kháng ngun, chế phẩm gọi giải độc tố dùng làm vaccine b Khả gây bệnh:  Dịch tễ học:  Vi khuẩn uốn ván tìm thấy nhiều lớp đất bề mặt, vi khuẩn sống hoại sinh đƣờng tiêu hóa ngƣời động vật vùng đơng dân cƣ, nhiệt độ nóng ẩm đất có nhiều phân súc vật giàu chất hữu có nhiều vi khuẩn uốn ván  Vi khuẩn bào tử xâm nhập vào thể qua vết thƣơng hỏa khí, tai nạn lao động có dây nhiều chất bẩn dị vật tạo điều kiện dễ dàng cho vi khuẩn uốn ván phát triển gây bệnh  Uốn ván xảy môi trƣờng bệnh viện liên quan đến phẫu thuật dụng cụ thao tác không đảm bảo vô trùng, uốn ván gặp tiêm bắp thịt khơng đảm bảo vô trùng loại thuốc nhƣ quinin, heroin  Uốn ván rốn trẻ sơ sinh cắt rốn dụng cụ không vô trùng  Bệnh xảy lứa tuổi hai giới  Bệnh sinh:  Vi khuẩn bào tử vào thể gặp điều kiện thuận lợi nhƣ tổ chức bị hoại tử, dị vật, vết thƣơng sâu môi trƣờng chỗ kỵ khí vi khuẩn phát triển tạo độc tố Vi khuẩn khơng xâm nhập q vị trí vết thƣơng nhƣng độc tố chúng hấp thụ vào máu qua đƣờng bạch huyết theo dây thần kinh khuếch tán qua tổ chức gần kề Phân tử độc tố gắn vào receptor đầu tế bào thần kinh, ngăn cản phóng thích chất dẫn truyền thần kinh (gamma-aminobutyric axit, glycine) cho synapse ức chế, khơng có tác dụng ức chế, gây nên kích thích mức vân Tác dụng đƣa đến co giật co cứng đặc thù bệnh uốn ván  Thời gian ủ bệnh trung bình 15 ngày, triệu chứng nhƣ cứng hàm, khó nuốt, cứng cổ, lƣng, bụng co cứng toàn thân đƣa đến tƣ ƣởn cong ngƣời Bệnh nặng xuất co giật cơ, co cứng co giật tăng cƣờng có kích thích nhƣ cấu véo, ánh sáng, âm Uốn ván rốn trẻ sơ sinh xảy khoảng 10 ngày sau sinh, bệnh thƣờng nặng tử vong nhanh  Triệu chứng bệnh uốn ván tăng dần đến ngày thứ 9-10 sau giảm dần, hồi phục hồn tồn 3-4 tuần Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU c Điều trị, phòng bệnh:  Điều trị: Theo nguyên tắc sau  Trung hòa độc tố kháng độc tố uốn ván  Dùng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn  Xử lý vết thƣơng  Điều trị triệu chứng hỗ trợ  Phòng bệnh:  Vết thƣơng phải xử lý thích hợp  Vết thƣơng nghi ngờ nhiễm vi khuẩn uốn ván nên để hở, tiêm huyết phòng uốn ván  Tiệt trùng kỹ dụng cụ y tế nhƣ kim tiêm, bơm tiêm, dụng cụ phẫu thuật, cắt rốn phải đảm bảo vô trùng để tránh uốn ván rốn  Dùng huyết giải độc tố uốn ván Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván II Nhóm – 55SH - NTU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE UỐN VÁN: (Quy trình tham khảo từ Viện Vaccine & Sinh phẩm y tế Nha Trang) Quy trình sản xuất vaccine uốn ván: a Sơ đồ quy trình sản xuất vaccine uốn ván: b Giải thích quy trình:  Nhân chủng Clostridium tetani:  Chủng Cl.tetani (Nhập từ Hà Lan Hungari) dạng đơng khơ, đƣợc hồn ngun môi trƣờng bán lỏng Thioglycolate trƣớc đƣa vào sản xuất  Môi trƣờng Thioglycolate môi trƣờng tổng hợp có tác dụng tăng sinh tế bào, sau pha đƣợc phân phối vào tube 22mm (20ml/tube) bình tam giác 3l (1500ml/Bình) hấp tiệt trùng 118oC/20ph Sau hấp bảo quản 28oC Trƣớc sử dụng lần cấy truyền đƣợc đun sôi làm lạnh nhanh để giải phóng Oxi hòa tan môi trƣờng, ủ tủ ấm 35oC nhằm ổn định nhiệt độ mơi trƣờng  Q trình cấy truyền qua đời với môi trƣờng Thioglycolate, đới cách 24 – 48h Quy trình cấy truyền ln đƣợc thực tủ cấy vô trùng + Đời I: Thêm 0,5ml môi trƣờng Thio vào ống đông khô để hồn ngun Sau đƣa tồn vào tube có sẵn 20ml mơi trƣờng + Đời II: Từ đời I cấy truyền vào ống tiếp theo, ống gồm 2ml dung dịch từ đời I 20ml môi trƣờng chuẩn bị sẵn + Đời III: Từ đời II cấy truyền vào ống tiếp theo, ống gồm 2ml dung dịch từ đời II 20ml môi trƣờng chuẩn bị sẵn Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU + Đời IV: Từ đời III cấy truyền vào ống tiếp theo, ống gồm 2ml dung dịch từ đời III 20ml môi trƣờng chuẩn bị sẵn + Đời V: Từ đời IV cấy truyền vào bình tam giác 3l, bình gồm 50ml dung dịch từ đời IV 1500ml môi trƣờng chuẩn bị sẵn  Giữa lần cấy truyền kèm theo test kiểm tra + Trƣớc cấy truyền dung dịch đƣợc soi dƣới kính hiển vi nhằm kiểm tra hình dạng tính khiết vi khuẩn uốn ván + Nuôi cấy canh khuẩn uốn ván đĩa thạch đồng thời với mẻ cấy truyền để đảm bảo độ khiết, không bị tạp nhiễm  Lên men:  Quá trình diễn từ 5-7 ngày nồi lên men 600l ba lớp vỏ Trƣớc đƣa vào vận hành đƣợc tiệt trùng 121oC/30ph, đồng thời kiểm tra hệ thống van  Môi trƣờng FMM (Fisek – Mueller – Miller), thành phần môi trƣờng acide amin từ nguồn Nz – Case TT (thủy phân từ Cazein), dung dịch đƣờng glucose, muối NaCl, vitamin số chất khoáng vi lƣợng Sử dụng 400l môi trƣờng FMM đƣa vào nồi lên men gia nhiệt đến 116oC/20ph Sau làm lạnh nhanh xuống 34oC, điều chỉnh pH = 7,3-7,4 Kiểm tra tính vơ trùng, tính ổn định thành phần hóa học  Đƣa 800ml chủng từ đời V vào nồi nuôi cấy Kể từ lúc đƣa mẫu vào nồi đến ngày lên men cuối ln có test hàng ngày + Sau đƣa chủng vào nồi: Lấy mẫu từ nồi để kiểm tra độ khiết môi trƣờng thạch + Sau lần lƣợt 24h, 48h kể từ lúc đƣa chủng vào nồi: Kiểm tra độ khiết mơi trƣờng thạch, soi kính hiển vi, đo pH + Sau 72h: Kể từ sau 72h, test thơng thƣờng nhƣ có thêm test hiệu giá độc tố Lf/ml MLD (Lên liều gây chết nhỏ nhất) Khi hiệu giá Lf/ml đạt mức cao ngừng trình lên men cách làm lạnh nhanh xuống 25oC  Ở giai đoạn hiệu giá độc tố đạt cao nhất, lúc tế bào vi khuẩn đƣợc ly giải gần nhƣ hoàn toàn Việc giảm nhiệt đột ngột làm ngƣng q trình lên men làm cho tế bào lại ly giải hồn tồn Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Hiệu giá độc tố đƣợc xác định dựa “tạo bông” kháng nguyên kháng độc tố uốn ván Hiệu giá cho thấy hàm lƣợng kháng nguyên có 1ml mẫu lấy từ nồi Ống 10 NaCl 0,9% (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Kháng độc tố (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Độc tố (ml) 1 1 1 1 1 Lf/ml 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100  Liều gây chết nhỏ MLD đƣợc xác định mức độ pha loãng độc tố liều lỗng nhất, nhƣng có khả gây chết vật chủ (Chuột nhắt trắng) Từ đây, nhà sản xuất kết luận đƣợc độc lực giai đoạn sản xuất  Độ biến thiên pH có thay đổi qua 24h Từ 0-48h đầu, pH có chiều hƣớng giảm từ 7,3 xuống 6,5 trình đƣờng phân diễn nồi lên men Nhƣng từ 72h trở đi, bắt đầu xảy trình ly giải tế bào, pH dần tăng từ 6,5 lên 7,5-7,6 168h kể từ lên men  Trong suốt trình lên men, hệ thống nồi không sử dụng cánh khuấy, mà sử dụng hệ thống đĩa rung đặt dƣới đáy nồi Việc sử dụng đĩa rung nhằm hạn chế không khí hòa tan vào mơi trƣờng  Trong q trình lên men sản sinh khí H2S gây ức chế ngƣợc lại vi khuẩn uốn ván Vì nồi ln có hệ thống thổi nhằm đẩy khí ngồi đƣợc lắp đặt mặt thống nồi lên men Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Lọc độc tố, giải độc tố:  Quá trình lọc độc tố bao gồm công đoạn lọc loại bỏ xác tế bào (Hệ thống TFF) lọc vô trùng (Cột lọc Cartridge) + Để thực lọc trong, ngƣời ta sử dụng công nghệ màng lọc dòng chảy tiếp tuyến TFF (Tangental Flow Filtration) Hệ thống lọc sử dụng màng lọc có kích thƣớc lỗ xuyên màng 0,45μm cho độc tố qua dịch môi trƣờng + Sau lọc thu độc tố uốn ván, toàn đƣợc chuyển sang hệ thống cột lọc vô trùng nhằm loại bỏ tạp nhiễm Cột lọc có kich thƣớc lỗ xuyên màng 0,2μm cho độc tố uốn ván qua, tế bào tạp nhiễm bị giữ lại Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Độc tố sau lọc vơ trùng đƣợc chuyển vào bình thủy tinh 10l (Thông thƣờng mẻ sản xuất Viện Vaccine Sau lọc xong thƣờng đƣợc chiết khoảng 40 bình) Việc chia nhỏ bình nhằm tăng hiệu suất cho công đoạn giải độc độc tố  Để giải độc độc tố, ngƣời ta cho vào bình 40ml Formalin 37% lắc Sau đƣợc ủ phòng ấm 35oC tuần (Hằng tuần lắc bình để khuếch tán Formalin) Nhƣ vậy, dƣới tác dụng Formalin, kháng nguyên bị độc tính nhƣng giữ đƣợc cấu trúc đặc hiệu chúng  Sau tuần bình đƣợc đƣa bảo quản 2-8oC trình lấy mẫu thực test pH, ổn định hóa học, tính vơ trùng, Lf/ml Ngồi có thêm test an toàn đặc hiệu (Test thực chuột Lang) nhằm kiểm tra tính an tồn đặc hiệu sau đƣợc giải độc Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Tinh chế:  Q trình tinh chế gồm cơng đoạn đặc, cắt tủa phân đoạn, hoàn nguyên loại bỏ gốc (SO4)2-, lọc vô trùng, thực hiên test trƣớc đƣa thành phẩm cuối  Bắt đầu trình đặc tồn dung dịch độc tố qua hệ thống lọc TFF với màng lọc có kích thƣớc lỗ 20K Dalton nhằm loại bỏ tồn dịch mơi trƣờng Nhƣ sau lọc tồn dung dịch giảm từ khoảng 400l xuống 10l (Dung dịch Protein kháng nguyên protein khác)  Để loại bỏ Protein khác giữ lại Protein kháng nguyên uốn ván, ngƣời ta dùng phƣơng pháp cắt tủa phân đoạn (NH4)2SO4 Biết đƣợc Protein kháng nguyên có trọng lƣợng phân tử 150K Dalton, ta thực tạo tủa lần + Lần thứ nhất: Các Protein có trọng lƣợng phân tử nhẹ 150K Dalton bị ƣu tiên tạo tủa trƣớc, trở nên nặng nhiều so với ban đầu Sau ta thực hiên ly tâm, Protein lắng xuống đáy bị loại bỏ + Lần thứ hai: Quá trình tạo tủa ƣu tiên tạo tủa với Protein kháng nguyên Sau ta lại ly tâm thu lấy Protein kháng nguyên bị đính kèm gốc (SO4)2-  Nhƣ vậy, sau trình cắt tủa phân đoạn, ta loại bỏ đƣợc Protein không chứa kháng nguyên Hỗn hợp Protein chứa kháng nguyên thu đƣợc đƣợc hoàn nguyên nƣớc muối sinh lý để trở thành 10l dung dịch Protein kháng nguyên Tuy nhiên Protein kháng nguyên bị đính kèm với gốc (SO4)2-  Để loại bỏ gốc (SO4)2-, ta lại cho toàn dung dịch chạy tuần hoàn qua hệ thống TFF để loại bỏ gốc 10 Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Sau loại bỏ hoàn toàn gốc (SO4)2-, cuối ta lại sử dụng cột lọc Cartridge để tinh hoàn toàn tạp nhiễm cho thành phẩm cuối dung dịch nƣớc muối sinh lý chứa Protein kháng nguyên đƣợc giải độc  Để bảo quản ngừa nấm mốc phát triển, ngƣời ta thêm vào lƣợng merthiolat tỉ lệ 1/10.000 (w/v)  Lấy mẫu kiểm tra vô trùng, pH, Lf/ml, Lf/mg NP (độ kháng nguyên), formalin, merthiolate, an toàn đặc hiệu, khả hồi độc  Thành phẩm:  Để tạo thành vaccine uốn ván, ngƣời ta cho hấp phụ kháng nguyên uốn ván với gel phốt phát nhôm AlPO4 (Gel đƣợc tạo AlCl3 NaPO4) Việc hấp phụ vào gel giúp cho vaccine đƣa vào thể ổn định hơn, khuếch tán chậm tránh gây tác động đột ngột đến thể, kéo dài thời gian đáp ứng miễn dịch  Trƣớc đƣa thành phẩm, dung dịch trải qua test kiểm định chất lƣợng pH, hóa sinh, vật lý, tính an tồn đặc hiệu thể thử nghiệm (Chuột) 11 Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Khi đạt tiêu chuẩn chất lƣợng đƣợc chiết vào ống thủy tinh, đóng hộp, nhập kho bảo quản Tác dụng phụ vaccine phòng ngừa uốn ván:  Các phản ứng phụ thƣờng nhẹ khu trú nơi tiêm  Có thể xuất quầng đỏ, sƣng đau chỗ tiêm, sốt 38–39oC Các triệu chứng nói chung nhẹ tự  Đôi thấy hạch nơi tiêm, nhƣng gặp Hiện tƣợng thâm nhiễm giảm dùng băng ép lạnh 12 Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU TÀI LIỆU THAM KHẢO VACCINE VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ CƠ BẢN – P.GS LÊ VĂN HIỆP QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE UỐN VÁN – THƢ VIỆN VIỆN VACCINE VÀ SINH PHẨM Y TẾ NHA TRANG BACKGROUNDS OF PRODUCTION OF DTP GROUP VACCINE WHO – MANUAL FOR THE PRODUCTION AND CONTROL OF VACCINE – TETANUS TOXOID 13 ... tố uốn ván Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván II Nhóm – 55SH - NTU QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE UỐN VÁN: (Quy trình tham khảo từ Viện Vaccine & Sinh phẩm y tế Nha Trang) Quy trình sản xuất vaccine. . .Quy trình sản xuất Vaccine Uốn ván Nhóm – 55SH - NTU  Nuôi cấy:  Trực khuẩn uốn ván kỵ khí tuyệt đối, phát triển tốt mơi trƣờng thơng thƣờng, trực khuẩn uốn ván khơng cần nguồn... Vaccine & Sinh phẩm y tế Nha Trang) Quy trình sản xuất vaccine uốn ván: a Sơ đồ quy trình sản xuất vaccine uốn ván: b Giải thích quy trình:  Nhân chủng Clostridium tetani:  Chủng Cl.tetani (Nhập