ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * - PHẠM THỊ HÒE NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI HẠT NANO KIM LOẠI ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERR) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN * - PHẠM THỊ HÒE NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI HẠT NANO KIM LOẠI ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERR) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hướng dẫn khoa học : TS Trần Mỹ Linh PGS.TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học TS Trần Mỹ Linh PGS.TS Nguyễn Lai Thành Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Phạm Thị Hòe LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Mỹ Linh (Viện Hóa sinh biển – Vện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) PGS.TS Nguyễn Lai Thành (Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN) tận tình bảo, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm làm việc, giúp em khắc phục khuyết điểm để thực tốt đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án KHCN trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam mã số VAST.TĐ.NANO-NN/15-18 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano nơng nghiệp” PGS TS Nguyễn Hồi Châu làm chủ nhiệm Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội trang bị kiến thức cho em suốt trình học tập Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Tƣờng Vân ThS Nguyễn Chi Mai cán Phòng Tài nguyên Sinh Vật - Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ em thời gian em thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời thân bên cạnh quan tâm, động viên tinh thần tạo điều kiện tốt suốt trình em học tập thực luận văn Hà Nội, ngày tháng năm Học viên Phạm Thị Hòe MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung đậu tƣơng 1.1.1 Các thời kỳ sinh trưởng phát triển đậu tương 1.1.2 Giá trị kinh tế đậu tương 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 1.2 Vai trò nguyên tố vi lƣợng phát triển trồng 1.2.1 Vai trò sắt phát triển trồng 10 1.2.2 Vai trò đồng phát triển trồng 11 1.2.3 Vai trò kẽm phát triển trồng 11 1.2.4 Vai trò coban phát triển trồng 12 1.3 Công nghệ nano ứng dụng nông nghiệp 12 1.3.1 Giới thiệu chung công nghệ nano 12 1.3.2 Hạt nano kim loại 14 1.3.3 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano – hạt nano kim loại nông nghiệp 14 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 22 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Thiết bị 22 2.2.3 Dụng cụ vật tư tiêu hao 23 ii 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Khử trùng hạt giống 23 2.3.2 Chuẩn bị dung dịch hạt nano kim loại 24 2.3.3 Xử lý hạt đậu tương với dung dịch hạt nano kim loại 24 2.3.4 Phân tích tiêu hình thái 24 2.3.5 Đánh giá ảnh hưởng hạt nano kim loại đến khả phân bào đỉnh sinh trưởng rễ 25 2.3.6 Đánh giá ảnh hưởng hạt nano kim loại đến trình nảy mầm đậu tương mức độ phân tử 26 2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến tỷ lệ nảy mầm tốc độ nảy mầm hạt đậu tƣơng 33 3.2 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại phát triển rễ mầm đậu tƣơng 35 3.3 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến phát triển chồi mầm đậu tƣơng 38 3.4 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến khả phân bào đỉnh sinh trƣởng rễ 40 3.5 Ảnh hƣởng số hạt nano kim loại đến mức độ methyl hóa DNA đậu tƣơng 41 3.5.1 Tách chiết DNA tổng số 41 3.5.2 Phân tích mức độ methyl hóa mẫu rễ mầm 18 43 3.5.3 Phân tích mức độ methyl hóa mẫu rễ mầm 48 44 3.6 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến biểu số gen liên quan đến trình nảy mầm hạt đậu tƣơng 46 3.6.1 Tách chiết RNA tổng số 46 iii 3.6.2 Ảnh hưởng hạt nano kim loại đến biểu số gen liên quan đến trình nảy mầm hạt đậu tương 48 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam giai đoạn 2011-2016 Bảng Các thiết bị sử dụng đề tài .23 Bảng Nồng độ dung dịch nano kim loại sử dụng nghiên cứu .24 Bảng Thơng tin gen đích mồi sử dụng phản ứng RT-PCR .31 Bảng Thành phần phản ứng RT-PCR .32 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR .32 Bảng Ảnh hưởng nFe, nCu, nZnO nCo đến tỷ lệ nảy mầm hạt đậu tương 34 Bảng Ảnh hưởng nFe, nCu, nZnO nCo đến chiều dài rễ mầm đậu tương 36 Bảng Ảnh hưởng nFe, nCu, nZnO nCo đến chiều dài chồi mầm đậu tương 38 Bảng 10 Ảnh hưởng hạt nFe, nCu, nZnO nCo đến trình phân bào tế bào đỉnh sinh trưởng rễ mầm đậu tương 41 Bảng 11 Kết đo quang phổ mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 18 42 Bảng 12 Kết đo quang phổ mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 48 43 Bảng 13 Mức độ methyl hóa DNA mẫu rễ mầm 18 43 Bảng 14 Mức độ methyl hóa DNA mẫu rễ mầm 48 44 Bảng 15 Kết đo quang phổ mẫu RNA tách từ mẫu rễ mầm 18 47 Bảng 16 Kết đo quang phổ mẫu RNA tách từ mẫu rễ mầm 48 47 v DANH MỤC HÌNH Hình Các mốc q trình nảy mầm đậu tương: hạt hút đủ nước, hạt bắt đầu nứt vỏ nảy mầm, phát triển rễ mầm (radicle), trụ mầm (hypocotyl) mầm (cotyledons) tách ra, chồi mầm xuất Hình Đường chuẩn định lượng cytidine mẫu phân tích 28 Hình Đường chuẩn định lượng 5-methylcytidine mẫu phân tích 28 Hình Hình thái rễ mầm đậu tương lơ thí nghiệm 37 Hình Hình thái chồi mầm đậu tương lơ thí nghiệm .39 Hình Hình thái nhiễm sắc thể kì phân chia tế bào đỉnh sinh trưởng rễ mầm đậu tương lô đối chứng .40 Hình Ảnh điện di DNA tổng số mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 (A) 48 (B) sau xử lý hạt 42 Hình Ảnh điện di RNA tổng số mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 (A) 48 (B) sau xử lý hạt .46 Hình Kết phân tích mức độ biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm 18 49 Hình 10 Kết phân tích mức độ biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm 48 50 vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic Acid DNase Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylenediamine tetra acetic acid HPLC High-performance liquid chromatography Kb Kilobase MWNT Multi walled carbon nanotubes mRNA messenger RNA NOM Natural Organic Material RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus UV Ultraviolet XDR X-Ray Diffraction vii Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận số trường hợp m6A (N6 methyl adenine) ty thể Sự methyl hóa thực vật kiểm soát hormone thay đổi trình nảy mầm, hoa chịu ảnh hưởng mầm bệnh virut, vi khuẩn, nấm Methyl hóa DNA có vai trò kiểm sốt tăng trưởng phát triển trồng, đặc biệt liên quan đến việc điều hòa biểu gen chép DNA [57] Sự methyl hóa vùng DNA điều khiển có vai trò ngăn cản q trình phiên mã gen tương ứng dẫn đến gen khơng biểu Do vậy, q trình biểu gen thường tỷ lệ nghịch với tỷ lệ methyl hóa DNA tế bào Tỷ lệ methyl hóa tương ứng với độ đóng mở (độ hoạt động) gen Thơng thường, gen kích hoạt biểu vùng điều khiển gen giải methyl hóa (demethylation) theo chế hoạt hóa tế bào dựa tín hiệu ngoại bào hormone sinh trưởng Vì thế, giải thích tượng giảm mức độ methyl hóa mẫu rễ mầm lô xử lý nano so với mẫu đối chứng tăng cường biểu số gen liên quan tới q trình phát triển rễ mầm Ngồi mẫu xử lý nano có tỷ lệ methyl hóa cao so với mẫu đối chứng, hai mẫu rễ mầm lô xử lý nano nFe* nCu lại dẫn tới tăng tỷ lệ methyl hóa so với mẫu đối chứng (Bảng 14) Điều giải thích tác động hạt nano kim loại dẫn tới giảm biểu ức chế số gen Khi so sánh mức độ methyl hóa mẫu rễ mầm 18 48 lô xử lý hạt nano kim loại (Bảng 13 Bảng 14), nhận mẫu xử lý nFe* có tỷ lệ methyl hóa thấp đối chứng giai đoạn rễ 18 lại cao so với đối chứng giai đoạn 48 Ngược lại với mẫu xử lý nCu*, nZnO mẫu nCo*, giai đoạn 18 giờ, tỷ lệ methyl hóa cao nhiều so với đối chứng giai đoạn 48 lại thấp so với đối chứng Như ảnh hưởng hạt nano kim loại lên trình nảy mầm phức tạp, cần tiếp tục nghiên cứu biểu nhóm gen, gen riêng biệt giai đoạn phát triển khác để làm rõ chế tác động loại hạt nano biểu gen K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 45 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận 3.6 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến biểu số gen liên quan đến trình nảy mầm hạt đậu tƣơng 3.6.1 Tách chiết RNA tổng số Tách chiết RNA tổng số khâu bước phân tích mức độ biểu gen mẫu nghiên cứu RNA tổng số mẫu rễ mầm 18 ký hiệu từ 18.1 đến 18.8 tương ứng với lô xử lý (Bảng 15) mẫu rễ mầm 48 ký hiệu từ 48.1 đến 48.8 tương ứng với lô xử lý (Bảng 16) tách chiết phương pháp Trizol Sau tách chiết, 5µl mẫu điện di kiểm tra gel agarose 0,8% Kết Hình cho thấy, tất mẫu tách chiết xuất băng rRNA (18S 26S) rõ nét Như vậy, tách RNA tổng số từ mẫu rễ mầm đậu tương 18 48 B A Hình Ảnh điện di RNA tổng số mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 (A) 48 (B) sau xử lý hạt.(Các mẫu ký hiệu theo bảng 15 bảng 16) Để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn DNA, mẫu RNA tổng số làm với DNase Sau làm sạch, mẫu RNA tổng số mẫu rễ mầm đậu tương 18 48 đo nồng độ xác định số liên quan đến độ tinh (A260/280, A260/230) máy Nanodrop Trong đó, số A260/230 xác định có mặt carbohydrate hợp chất chứa nhóm phenol; số A260/280 xác định có mặt protein RNA cho “sạch” số A260/280 nằm K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 46 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận khoảng 1,8 – 2,1 A260/230 đạt tối ưu 2,0 Kết đo quang phổ mẫu RNA tổng số tách từ mẫu rễ mầm đậu tương 18 (Bảng 15) 48 (Bảng 16) cho thấy, tất mẫu có nồng độ cao dao động từ 718 – 982 ng/µl, đồng thời số A260/280 A260/230 nằm mức cho phép Như vậy, RNA tổng số mẫu rễ mầm 18 48 đảm bảo đủ chất lượng để sử dụng cho thí nghiệm Bảng 15 Kết đo quang phổ mẫu RNA tách từ mẫu rễ mầm 18 Kí hiệu mẫu Lơ xử lý (mg/L) Nồng độ RNA (ng/µl) A260/280 A260/230 18.1 ĐC 849,7 1,97 1,96 18.2 50 nFe 827,3 1,97 2,00 18.3 50 nFe* 770,1 1,93 1,98 18.4 50 nCu 982,3 1,98 1,91 18.5 50 nCu* 962,6 1,97 2,04 18.6 50 nZnO 741,4 1,93 2,08 18.7 0,05 nCo 718,8 1,97 2,01 18.8 0,05 nCo* 945,8 1,94 1,95 ĐC: đối chứng; *: Hạt nano thương mại (Mỹ) Bảng 16 Kết đo quang phổ mẫu RNA tách từ mẫu rễ mầm 48 Kí hiệu mẫu Lơ xử lý (mg/L) Nồng độ RNA (ng/µl) A260/280 A260/230 48.1 ĐC 496,5 2,01 2,06 48.2 50 nFe 880,3 2,00 2,00 48.3 50 nFe* 594,9 1,86 2,08 48.4 50 nCu 448,9 1,91 2,09 48.5 50 nCu* 595,2 1,99 2,04 48.6 50 nZnO 580,5 1,99 2,08 48.7 0,05 nCo 556,8 1,99 2,01 48.8 0,05 nCo* 585,2 1,97 1,95 ĐC: đối chứng; *: Hạt nano thương mại (Mỹ) K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 47 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận 3.6.2 Ảnh hưởng hạt nano kim loại đến biểu số gen liên quan đến trình nảy mầm hạt đậu tương Nảy mầm hạt trình sinh lý phức tạp, điều khiển yếu tố bên nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… yếu tố bên hoạt động hormone thực vật, mức độ biểu gen,… Các yếu tố mơi trường tín hiệu hormone có tương tác với để điều khiển q trình nảy mầm thơng qua việc điều khiển hoạt động gen liên quan [13] Ngược lại, biểu gen mức độ khác có vai trò kiểm sốt hoạt động hormone thực vật Do đó, điều chỉnh mức độ biểu gen phương thức hiệu để tăng cường khả nảy mầm hạt [36] Nhằm tìm hiểu tác động việc xử lý nano kim loại tới khả nảy mầm phát triển rễ mầm đậu tương, nghiên cứu gen có vai trò quan trọng q trình nảy mầm hạt giai đoạn sớm (18 - 48 giờ) lựa chọn phân tích phương pháp RTPCR Các gen nghiên cứu bao gồm: gen mã hóa cho enzyme aminocyclopropane-1carboxylase synthase, enzyme chủ chốt đường sinh tổng hợp ethylene, hormone có liên quan tới phá ngủ nghỉ, có vai trò kích thích nảy mầm giai đoạn sớm [16]; gen mã hóa cho enzyme liên quan tới trình trao đổi chất giải phóng lượng từ chất dự trữ hạt lypoxygenase (trao đổi chất lipid), β-amylase alpha-glucan dikinase (trao đổi chất carbohydrate) [22]; gen mã hóa cho enzyme urease, enzyme có nhiều rễ họ đậu, có vai trò phân giải ure tạo nguồn cung cấp nitơ cho [44] Mẫu rễ mầm lơ thí nghiệm hai mốc 18 48 lựa chọn để phân tích mức độ biểu gen Kết phân tích cho thấy, việc xử lý hạt đậu tương trước gieo với dung dịch nano kim loại có tác động rõ rệt tới biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm giai đoạn 18 (Hình 9) 48 (Hình 10) K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 48 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận Hình Kết phân tích mức độ biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm 18 ((-): đối chứng âm phản ứng RT-PCR, ĐC: đối chứng không xử lý nano; ACS2: Aminocyclopropane-1-carboxylase synthase 2, LOX9-03: Lypoxygenase 3, LOX9-07: Lypoxygenase 7, AMY8: Amylase 8, AMYS: Saccharogen amylase, α-GLU: alpha-glucan dikinase,URE02: Urease 2, URE14: Urease 14) Mức độ biểu gen nội chuẩn Act3.2 tất mẫu tương đương nhau, chứng tỏ khác biệt mức độ biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm có ý nghĩa Đối với mẫu rễ mầm 18 giờ, gen ACS2, LOX9-07, AMY8, α-GLU, URE02 không biểu mẫu đối chứng không xử lý nano lại tăng cường biểu mẫu xử lý với dung dịch nano kim loại Trong mẫu xử lý nano, mức độ biểu gen ACS2 URE02 tương đương, ngoại trừ biểu yếu gen ACS2 mẫu xử lý với 0,05 mg/L nCo; gen AMY8 biểu mạnh rễ mầm lô xử lý với 50 mg/L nFe 50 mg/L nZnO Gen LOX9-03 biểu mẫu rễ mầm lô xử lý với 50 mg/L nFe*, 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo* Gen AMYS biểu mẫu rễ mầm lô xử lý với K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 49 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận 50 mg/L nFe 50 mg/L nZnO Mức độ biểu gen URE14 lô xử lý với 50 mg/L nZnO cao so với lô xử lý với hạt nano khác lô đối chứng Tác động hạt nano sản xuất từ dự án hạt nano thương mại đến mức độ biểu gen khơng có khác biệt đáng kể, trừ mẫu xử lý với nFe nFe* Ở giai đoạn này, 50 mg/L nZnO có tác động tốt đến hoạt hóa tăng cường biểu nghiên cứu (Hình 9) Hình 10 Kết phân tích mức độ biểu gen nghiên cứu mẫu rễ mầm 48 ((-): đối chứng âm phản ứng RT-PCR, ĐC: đối chứng không xử lý nano; ACS2: Aminocyclopropane-1-carboxylase synthase 2, LOX9-03: Lypoxygenase 3, LOX9-07: Lypoxygenase 7, AMY8: Amylase 8, AMYS: Saccharogen amylase, α-GLU: alpha-glucan dikinase,URE02: Urease 2, URE14: Urease 14) Đối với mẫu rễ mầm 48 giờ, hầu hết gen phân tích (trừ gen LOX9-07, AMYS) biểu mạnh rễ mầm lô xử lý với dung dịch nano kim loại, so với đối chứng Gen AMY8 biểu đồng mẫu rễ mầm xử lý với hạt nano kim loại, lô đối chứng không biểu Gen LOX9-03 có tăng cường biểu rõ rệt mẫu xử lý với 50 mg/L nZnO So với thời điểm 18 giờ, K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 50 Luận văn thạc sỹ khoa học Chƣơng Kết thảo luận biểu gen α-GLU tăng mức độ biểu mẫu xử lý với 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo Gen URE02 biểu mạnh mẫu xử lý với 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo Mức độ biểu gen URE14 cao lô xử lý với 0,05 mg/L nCo 0,05 mg/L nCo* Mức độ biểu gen khơng có khác biệt đáng kể mẫu xử lý với hạt nano kim loại sản xuất từ dự án hạt nano thương mại Trong số mẫu xử lý với hạt nano kim loại, 0,05 mg/L nCo thể tác động tốt đến hoạt hóa tăng cường biểu gen giai đoạn 48 sau xử lý hạt (Hình 10) Các kết cho thấy, 50 mg/L nFe, 50 mg/L nCu, 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo có tác động tích cực làm tăng cường mức độ biểu gen có vai trò quan trọng q trình nảy mầm ACS2, LOX9-03, LOX9-07, AMY8, AMYS, α-GLU, URE02 URE14 giai đoạn sớm Điều hoàn toàn phù hợp với kết phân tích hình thái Sự tăng cường biểu gen nguyên nhân thúc đẩy phát triển rễ mầm lô xử lý nano dẫn đến tăng tỷ lệ nảy mầm giống đậu tương thí nghiệm Theo Landa cộng (2012), nZnO nồng độ 100 mg/L có tác động tăng cường biểu 660 gen làm giảm mức độ biểu 826 gen rễ Arabidopsis thaliana; gen tăng cường biểu chủ yếu gen liên quan đến khả chống chịu điều kiện bất lợi [26] Gần đây, Mahakham cộng (2017) cải thiện khả nảy mầm hạt gạo xử lý với nAg nồng độ 10 ppm nAg có tác động làm tăng cường hoạt tính α-amylase kích thích hoạt động gen mã hóa protein kênh dẫn truyền nước (aquaporin) để tăng cường khả hấp thụ nước hạt giai đoạn nảy mầm [31] K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 51 Luận văn thạc sỹ khoa học Kết luận Kiến nghị KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Kết luận  Hạt nano sắt (nFe), nano đồng (nCu), nano kẽm oxit (nZnO) nano coban (nCo) có tác động tích cực đến q trình nảy mầm hạt đậu tương giống ĐT26 tăng cường tốc độ nảy mầm, kích thích phát triển rễ mầm chồi mầm, đồng thời không ảnh hưởng tới phát sinh hình thái mầm Các nồng độ nano thử nghiệm cho hiệu tăng cường tốt giai đoạn nảy mầm 50 mg/L nFe ; 50 mg/L nCu; 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo  Xử lý hạt đậu tương với loại dung dịch 50 mg/L nFe; 50 mg/L nCu; 50 mg/L nZnO 0,05 mg/L nCo làm thúc đẩy trình phân bào đỉnh sinh trưởng rễ mầm tăng cường mức độ biểu gen mã hóa cho enzyme có vai trò quan trọng giai đoạn nảy mầm (ACS2, LOX9-03, LOX9-07, AMYS, AMY8, α-GLU, URE02, URE14) Kiến nghị Những kết nghiên cứu đề tài cho thấy tác động hạt nano kim loại đến trình nảy mầm hạt đậu tương mức độ phân tử q trình methyl hóa tồn hệ gen phức tạp, số kiến nghị đưa cho nghiên cứu sau:  Tiếp tục đánh giá ảnh hưởng hạt nFe, nCu, nZnO nCo đến mức độ biểu số gen khác liên quan tới trình nảy mầm hạt đậu tương  Tiếp tục nghiên cứu sâu trình methyl hóa gen nhóm gen giai đoạn nảy mầm  Đánh giá ảnh hưởng hạt nFe, nCu, nZnO nCo giai đoạn phát triển đậu tương (giai đoạn con, giai đoạn hoa tạo quả,…) nhằm tạo sở khoa học mang tính tồn diện hướng tới ứng dụng chế phẩm nano kim loại vào thực tiễn K24 – Sinh học thực nghiệm Phạm Thị Hòe 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Chương, Phạm Thị Ngừng & Võ Như Cầm (2014), Khảo sát đánh giá vật liệu nano kim loại Cu, Fe Ag đến sinh trưởng phát triển giống đậu tương HLĐN 29 vụ Đông Xuân 2013/2014 Đồng Nai., Hội thảo khoa học lần thứ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano nông nghiệp Trần Văn Điền (2007), Giáo trình Cây đậu tương, NXB Nơng nghiệp Nguyễn Văn Đính, La Việt Hồng (2015), Sinh trưởng phát triển thực vật, NXB Giáo dục Lê Quý Kha, Phạm Văn Ngọc & Nguyễn Thị Bích Chi (2014), Khảo sát đánh giá vật liệu nano kim loại Cu, Fe Ag đến sinh trưởng phát triển ngô lai vụ Đông Xuân 2013/2014 Đồng Nai., Hội thảo khoa học lần thứ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano nông nghiệp Nguyễn Bá Lộc, Trương Văn Lung, Võ Thị Mai Hương, Lê Thị Hoa & Lê Thị Trĩ (2011), Giáo trình Sinh lí học thực vật, Trường ĐH Sư phạm Thái Nguyên, tr.40-60 Phạm Văn Thiều (2002), Cây đậu tương - Kĩ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp, tr.5-6 Trung tâm Thông tin Và Thống kê Khoa học Và Cơng nghệ (2016), Báo cáo phân tích xu hướng công nghệ: Xu hướng ứng dụng công nghệ nano canh tác trồng thủy sản, TP Hồ Chí Minh II TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Alloway, B.J (2008), “Zinc in soils and crop nutrition International Zinc Association, Brussels”, International Fertilizer Industry Association, Paris 53 Ashraf, M.Y., Mahmood K., Ashraf M., Akhter J & Hussain F (2012), “Optimal supply of micronutrients improves drought tolerance in legumes”, in Crop Production for Agricultural Improvement, Springer, pp 637-657 10 Asli, S & Neumann P.M (2009), “Colloidal suspensions of clay or titanium dioxide nanoparticles can inhibit leaf growth and transpiration via physical effects on root water transport”, Plant, cell & environment, 32 (5), pp 577584 11 Begum, P., Ikhtiari R & Fugetsu B (2014), “Potential impact of multi-walled carbon nanotubes exposure to the seedling stage of selected plant species”, Nanomaterials, (2), pp 203-221 12 Boonyanitipong, P., Kumar P., Kositsup B., Baruah S & Dutta J (2011), Effects of zinc oxide nanoparticles on roots of rice (Oryza sativa L.),International Conference on Environment and Bioscience, pp 172-176 13 Chen, H., Zhang J., et al (2008), “Integration of light and abscisic acid signaling during seed germination and early seedling development”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105 (11), pp 4495-4500 14 Chen, R., Ratnikova T A., et al (2010), “Differential uptake of carbon nanoparticles by plant and mammalian cells”, Small, (5), pp 612-617 15 Clough, S.J & Bent A.F (1998), “Floral dip: a simplified method forAgrobacterium‐mediated transformation ofArabidopsis thaliana”, The plant journal, 16 (6), pp 735-743 16 Corbineau, F., Xia Q., Bailly C & El-Maarouf-Bouteau H (2014), “Ethylene, a key factor in the regulation of seed dormancy”, Frontiers in plant Science, 17 Doshi, R., Braida W., Christodoulatos C., Wazne M & O’connor G (2008), “Nano-aluminum: transport through sand columns and environmental effects on plants and soil communities”, Environmental Research, 106 (3), pp 296303 54 18 Dowling, A., Clift R., et al (2004), Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties Royal Society and Royal Academy of Engineering, London, UK 19 Doyle, J (1991), “DNA protocols for plants”, in Molecular techniques in taxonomy, Springer, pp 283-293 20 El-Fouly, M.M., Mobarak Z.M & Salama Z A (2011), “Micronutrients (Fe, Mn, Zn) foliar spray for increasing salinity tolerance in wheat Triticum aestivum L”, African Journal of Plant Science, (5), pp 314-322 21 Hafeez, B., Khanif Y.M & Saleem M (2013), “Role of zinc in plant nutrition-a review”, American journal of experimental Agriculture, (2), pp 374 22 Han, C., Yin X., He D & Yang P (2013), “Analysis of proteome profile in germinating soybean seed, and its comparison with rice showing the styles of reserves mobilization in different crops”, PLoS One, (2), pp e56947 23 Holister, P., Weener J.W., Vas R.C & Harper T (2003), “ Nanoparticles: Technology White Paper 3” 24 Joseph, T & Morrison M (2006), Nanotechnology in agriculture and food: a nanoforum report, Nanoforum org 25 Khodakovskaya, M., Dervishi E., et al (2009), “Carbon nanotubes are able to penetrate plant seed coat and dramatically affect seed germination and plant growth”, ACS nano, (10), pp 3221-3227 26 Landa, P., Vankova R., et al (2012), “Nanoparticle-specific changes in Arabidopsis thaliana gene expression after exposure to ZnO, TiO 2, and fullerene soot”, Journal of hazardous materials, 241, pp 55-62 27 Lee, W.M., An Y.J., Yoon H & Kweon H.S (2008), “Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolus radiatus) and wheat (Triticum aestivum): plant agar test for water‐insoluble nanoparticles”, Environmental toxicology and chemistry, 27 (9), pp 1915-1921 55 28 Lin, S., Reppert J., et al (2009), “Uptake, translocation, and transmission of carbon nanomaterials in rice plants”, Small, (10), pp 1128-1132 29 López-Moreno, M.L., De La Rosa G., et al (2010), “Evidence of the differential biotransformation and genotoxicity of ZnO and CeO2 nanoparticles on soybean (Glycine max) plants”, Environmental science & technology, 44 (19), pp 7315-7320 30 Luong Thien Nghia, Hoang Thanh Tung, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan & Duong Tan Nhut (2017), “The effect of silver nanoparticles on growth of Chrysanthemum morifolium Ramat cv." JIMBA" in different cultural systems”, Vietnam Journal of Science and Technology, 55 (4), pp 513 31 Mahakham, W., Sarmah A.K., Maensiri S & Theerakulpisut P (2017), “Nanopriming technology for enhancing germination and starch metabolism of aged rice seeds using phytosynthesized silver nanoparticles”, Scientific Reports, (1), pp 8263 32 Mahmoodzadeh, H., Nabavi M & Kashefi H (2013), “Effect of nanoscale titanium dioxide particles on the germination and growth of canola (Brassica napus)”, J Ornamental Hortic Plants, 3, pp 25-32 33 Martins, P K., Jordão B.Q., et al (2008), “Differential gene expression and mitotic cell analysis of the drought tolerant soybean (Glycine max L Merrill Fabales, Fabaceae) cultivar MG/BR46 (Conquista) under two water deficit induction systems”, Genetics and Molecular Biology, 31 (2), pp 512-521 34 Mcwilliams, Da, Berglund Dr & Endres Gj (1999), “Soybean growth and management quick guide”, North Dakota State University and University of Minnesota 35 Melnik, A.V & Shagalina O.V (2011), History of Nanotechnology, Siberian Federal University 36 Miransari, M & Smith D.L (2014), “Plant hormones and seed germination”, Environmental and Experimental Botany, 99, pp 110-121 56 37 Moraru, Panchapakesan, Huang, Takhisto, Sean & Kokini (2003), “Nanotechnology: a new frontier in food science”, Food Technology, 57 (12), pp 24-29 38 Ngo Quoc Buu, Dao Trong Hien, et al (2014), “Effects of nanocrystalline powders (Fe, Co and Cu) on the germination, growth, crop yield and product quality of soybean (Vietnamese species DT-51)”, Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology, (1), pp 015016 39 Nie, S., Xing Y., Kim G J & Simons J W (2007), “Nanotechnology applications in cancer”, Annu Rev Biomed Eng., 9, pp 257-288 40 Palit, S., Sharma A & Talukder G (1994), “Effects of cobalt on plants”, The botanical review, 60 (2), pp 149-181 41 Parsons, J.G., Lopez M.L., et al (2010), “Toxicity and biotransformation of uncoated and coated nickel hydroxide nanoparticles on mesquite plants”, Environmental toxicology and chemistry, 29 (5), pp 1146-1154 42 Prasad, Tnvkv, Sudhakar P., et al (2012), “Effect of nanoscale zinc oxide particles on the germination, growth and yield of peanut”, Journal of plant nutrition, 35 (6), pp 905-927 43 Rameshaiah, Pallavi & Shabnam (2015), “Nano fertilizers and nano sensors–an attempt for developing smart agriculture”, Int J Eng Res Gen Sci, (1), pp 2091-2730 44 Real-Guerra, R., Stanis Uaski F & Carlini C (2013), “Soybean urease: Over a hundred years of knowledge”, in A Comprehensive Survey of International Soybean Research-Genetics, Physiology, Agronomy and Nitrogen Relationships, InTech 45 Rico, C.M., Majumdar S., et al (2011), “Interaction of nanoparticles with edible plants and their possible implications in the food chain”, Journal of agricultural and food chemistry, 59 (8), pp 3485-3498 57 46 Rio, D C, Ares M., Hannon G J & Nilsen T W (2010), “Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent)”, Cold Spring Harbor Protocols, 2010 (6), pp pdb prot5439 47 Roduner, E (2006), “Size matters: why nanomaterials are different”, Chemical Society reviews, 35 (7), pp 583 48 Stampoulis, D., Sinha S K & White J C (2009), “Assay-dependent phytotoxicity of nanoparticles to plants”, Environmental Science & Technology, 43 (24), pp 9473-9479 49 Stark, J.C., Westermann D.T & Hopkins B (2004), Nutrient management guidelines for Russet Burbank potatoes, University of Idaho, College of Agricultural and Life Sciences 50 Takahashi, M., Nozoye T., et al (2009), “In vivo analysis of metal distribution and expression of metal transporters in rice seed during germination process by microarray and X-ray Fluorescence Imaging of Fe, Zn, Mn, and Cu”, Plant and Soil, 325 (1-2), pp 39 51 Tarafdar, J.C., Sharma S & Raliya R (2013), “Nanotechnology: Interdisciplinary science of applications”, African Journal of Biotechnology, 12 (3) 52 Thomas, S., Grohens Y & Ninan N (2015), Nanotechnology Applications for Tissue Engineering, William Andrew 53 Wang, H., Kou X., et al (2011), “Physiological effects of magnetite (Fe3O4) nanoparticles on perennial ryegrass (Lolium perenne L.) and pumpkin (Cucurbita mixta) plants”, Nanotoxicology, (1), pp 30-42 54 Welch, R.M & Shuman L (1995), “Micronutrient nutrition of plants”, Critical Reviews in plant sciences, 14 (1), pp 49-82 55 Zeng, J., Zou Y.P., Bai J.Y & Zheng H.S (2002), “Preparation of total DNA from “recalcitrant plant taxa””, Acta Botanica Sinica, 44 (6), pp 694-697 58 56 Zhu, H., Han J., Xiao J Q & Jin Y (2008), “Uptake, translocation, and accumulation of manufactured iron oxide nanoparticles by pumpkin plants”, Journal of Environmental Monitoring, 10 (6), pp 713-717 57 Vanyushin, B.F (2006), “DNA methylation in plants”, in DNA methylation: basic mechanisms, Springer, pp 67-122 TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN TRANG WEBSITE 58 https://www.customs.gov.vn/Lists/ThongKeHaiQuan/Default.aspx 59 ... tài Nghiên cứu ảnh hƣởng số loại hạt nano kim loại đến trình nảy mầm hạt đậu tƣơng (Glycine max (L. ) Merr) thực nhằm mục tiêu đánh giá tác động bốn loại hạt nano kim loại (Fe, Cu, ZnO, Co) đến. .. - PHẠM THỊ HÒE NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI HẠT NANO KIM LOẠI ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƢƠNG (GLYCINE MAX (L. ) MERR) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN... mầm 48 44 3.6 Ảnh hƣởng hạt nano kim loại đến biểu số gen liên quan đến trình nảy mầm hạt đậu tƣơng 46 3.6.1 Tách chiết RNA tổng số 46 iii 3.6.2 Ảnh hưởng hạt nano kim loại đến