BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG PLASMID TÁI TỔ HỢP CHỨA GEN MÃ HĨA ENZYME ENDOGLUCANASE D (CelD) TỪ VI KHUẨN Clostridium thermocellum TRÊN HỆ THỐNG NẤM MEN Pichia pastoris Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Thạc sĩ Nguyễn Xuân Đồng Sinh viên thực MSSV: 1051110247 : Phan Vũ Hải Yến Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa công bố cơng trình trước Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2014 Sinh viên thực Phan Vũ Hải Yến LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến T.S Nguyễn Thị Hai người kính mến hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình học tập hồn thành ḷn văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Th.S Nguyễn Xuân Đồng K.S Lê Thị Huỳnh Trâm tạo điều kiện, giúp đỡ kiến thức chuyên môn tận tình hướng dẫn tơi suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị phòng Cơng nghệ Vi sinh - Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện hỗ trợ tơi kinh phí thiết bị để tơi thực đề tài Tơi cảm ơn bạn nhóm ESS ln cổ vũ động viên tơi lúc khó khăn để vượt qua hoàn thành tốt luận văn Và cuối cùng, hết, từ đáy lòng cảm ơn ba mẹ sinh con, nuôi dạy khôn lớn, bên nguồn động viên to lớn con, tạo điều kiện tốt tinh thần vật chất suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành ḷn văn Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng năm 2014 Phan Vũ Hải Yến Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục đích nghiên cứu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứuc CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Cấu tạo lignocellulose 2.1.1 Cellulose 2.1.2 Hemicellulose 2.1.3 Lignin 2.2 Enzyme cellulase 2.2.1 Phân loại enzyme 2.2.2 Cơ chế tác dụng cellulase 2.2.3 Vi sinh vật sản xuất cellulase 10 2.3 Phức hợp cellulosome vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.1 Tổng quan vi khuẩn Clostridium thermocellum 11 2.3.2 2.4 Đặc điểm phức hệ cellulosome 12 Hệ thống biểu Pichia pastoris 14 2.4.1 Đặc điểm hệ thống biểu Pichia pastoris 14 2.4.2 Tích hợp gen ngoại lai vào P pastoris 14 2.4.3 Ưu điểm hệ thống biểu Pichia pastoris 15 i Đồ án tốt nghiệp 2.5 Các nghiên cứu nước tạo dòng gen từ Clostridium thermocellum 16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu: 19 3.1.1 Địa điểm nghiên cứu: 19 3.1.2 Thời gian nghiên cứu: 19 3.2 Nguyên liệu 19 3.2.1 Chủng vi sinh vật 19 3.2.2 Thiết bị dụng cụ 19 3.2.3 Hóa chất 20 3.2.4 Môi trường 22 3.2.4.1 Môi trường LB (Luria-Bertani): 22 3.2.4.2 Môi trường MD (Minimal Dextrose): 22 3.2.4.3 Môi trường YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) 22 3.2.4.4 Môi trường BMGY (Buffered Glycerol-complex): 22 3.2.4.5 Môi trường BMMY (Buffered Methanol-complex) bổ sung CMC 23 3.2.5 Plasmid 23 3.2.5.1 Plasmid pJET1.2/blunt 23 3.2.5.2 Plasmid pPIC9K 24 3.2.6 Các cặp mồi sử dụng 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu: 26 3.3.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD Clostridium thermocellum 26 3.3.1.1 Thiết kế mồi 26 ii Đồ án tốt nghiệp 3.3.1.2 Thu nhận gen CelD vi khuẩn C thermocellum phản ứng PCR dựa vào cặp mồi thiết kế .27 3.3.1.3 Quy trình tinh gen theo MEGAquick – spin Total Fragment DNA Purification Kit – INTRON Biotechnololy 28 3.3.1.4 Phương pháp ghép nối gen vào vector nhân dòng pJET1.2/ Blunt 28 3.3.1.5 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp .29 3.3.1.6 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ phương pháp hóa biến nạp 30 3.3.1.7 Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc 31 3.3.1.8 Phương pháp tách chiết plasmid từ tế bào E coli 32 3.3.1.9 Kiểm tra dòng biến nạp enzyme cắt giới hạn 33 3.3.1.10 Xác định trình tự gen so sánh trình tự gen thu với trình tự tương ứng GenBank 34 3.3.2.Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 34 3.3.2.1 Chuẩn bị dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn 34 3.3.2.2 Quy trình tinh gen plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System – INTRON 35 3.3.2.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD 36 3.3.2.4 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp .36 3.3.2.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pPIC9K-CelD vào E coli DH5α 36 3.3.2.6 Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng PCR khuẩn lạc 37 3.3.2.7 Kiểm tra dòng biến nạp enzyme cắt giới hạn 37 3.3.2.8 Xác định trình tự gen so sánh trình tự gen thu với trình tự tương ứng GenBank 38 iii Đồ án tốt nghiệp 3.3.3 Tạo dòng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D 38 3.3.3.1 Chuẩn bị tế bào Pichia pastoris GS115 khả nạp 39 3.3.3.2 Phương pháp điện biến nạp 39 3.3.3.3 Chọn lọc dòng Pichia pastoris mang nhiều gen CelD có khả năng tiết enzyme ngoại bào Endoglucanase D .40 3.3.3.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số .40 3.3.3.5 Kiểm tra dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu phương pháp PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 3.3.5 Định tính khả sinh enzyme cellulase dòng P pastoris tái tổ hợp 42 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid mang gen CelD Clostridium thermocellum 43 4.1.1 Khuếch đại gen CelD kĩ thuật PCR 43 4.1.2 Tạo dòng E coli mang plasmid nhân dòng chứa gen CelD 44 4.1.3 Kiểm tra thể biến nạp PCR khuẩn lạc 45 4.1.4 Phân tích plasmid tái tổ hợp phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR enzyme cắt giới hạn 46 4.1.5 Kiểm tra dòng tế bào E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2-CelD giải trình tự 48 4.2.1 Kiểm tra thể biến nạp PCR khuẩn lạc 52 4.2.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp phương pháp PCR với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR enzyme cắt giới hạn SnaBI EcoRI 53 4.2.3 Kiểm tra dòng E coli DH5α chứa plasmid tái tổ hợp pPIC9K – CelD giải trình tự 55 iv Đồ án tốt nghiệp 4.3 Tạo dòng Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen CelD 57 4.3.1 Biến nạp plasmid pPIC9K – CelD vào chủng Pichia pastoris GS115 58 4.3.2 Sàng lọc tế bào nấm men mang gen mã hóa cho endoglucanase D 59 4.3.3 Kiểm tra dòng Pichia pastoris mang gen mục tiêu phương pháp PCR với mồi AOX1F/ AOX1R 60 4.3.4 Định tính khả sinh enzyme cellulase dòng P pastoris tái tổ hợp 62 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 5.1 Kết luận 65 5.2 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .66 PHỤ LỤC v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT AOX Alcohol oxydase BMGY Buffered Glycerol-complex BMMY Buffered Methanol-complex bp Base pair CBD Cellulose binding domain CMC Carboxymethyl-cellulose dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Kb kilo base LB Luria-Bertani MD Minimal Dextrose Mut Methanol Utilisation NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus TAE Tris – acetate – EDTA TE buffer Tris EDTA buffer YNB Yeast Nitrogen Base YPD Yeast Extract Peptone Dextrose vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Tỉ lệ thành phần lignocellulose Hình 2.2 Lignocellulose .4 Hình 2.3 Cấu trúc phân tử Cellulose Hình 2.4 Cấu trúc cellulose Hình 2.5 Hemicellulose Hình 2.6 Lignin Hình 2.7 Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase Hình 2.8 Clostridium thermocellum 11 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động Cellulosome 12 Hình 3.1 Thang DNA Kb 21 Hình 3.2 Plasmid pJET 1.2 .24 Hình 3.3 Plasmid pPIC9K 25 Hình 3.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi CelDF/ CelDR .27 Hình 3.5 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi pJET1.2F/ pJET1.2R 32 Hình 3.6 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/ AOX1R .37 Hình 3.7 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR với cặp mồi AOX1F/ AOX1R 41 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CelD .43 Hình 4.2 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5𝛼 chứa plasmid tái tổ hợp pJET1.2CelD mơi trường LB/ Ampicillin (50 µg/ml) 444 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định dòng E coli DH5α/pJET1.2-CelD với cặp mồi pJET1.2F/pJET1.2R 45 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pJET1.2-CelD enzyme SnaBI EcoRI sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp pJET1.2-CelD với mồi đặc hiệu CelDF/ CelDR 46 Hình 4.5 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5𝛼 chứa pPIC9K-CelD mơi trường LB/ ampicillin (50 µg/ml) .51 vii Đồ án tốt nghiệp Himmel, M E., Ding, S Y., Johnson, D K., DNAey, W S., Nimlos, MR., Brady, J W., Foust, T D (2007) Biomass recalcitrance: engineering plants and enzyms for biofuels production, Science, 315, 804 – 807 Hsu, T.A., Ladisch, M.R., Tsao, G.T (1980) Alcohol from cellulose, Chemical Technology, 10 (5), 315 – 319 Jian – Ming Liu, Xiu Juan Xin, Chun – Xiu Li, Jian – He Xu, Jie Bao (2011) Cloning of Thermostable Cellulase Genes of Clostridium thermocellum and Their Secretive Expression in Bacillus subtilis, Applied Biochemistry and Biotechnology, 166 (3), DOI 10.1007/s12010 – 011 – 9456 – z Joseleau, J P., Comtat, J., Ruel, K (1992) Chemical structure of xylans and their interaction in the plant cell walls In Xylan and xylanases, eds J Visser, G Beldman, M A Kusters-van Someren and A G J Voragen, Elsevier, Science Publishers, Amsterdam, – 15 Kim, S., Holtzapple, M T (2006) Effect of structural feature and enzym digestibility of cellulose, Bioresource Technol, 95, 583 – 591 Kobayashi T., M P Romanie, U.Fauth and A L Demain (1990) Subcellulosome Preparation with High Cellulase Activity from Clostridium thermocellum, Applied and Environmental Microbiology, 56 (10), 3040 – 3046 Lamed R., Setter E., Bayer E A (1983) Characterization of Cellulose – Binding Celllulase – Containing Complex in Clostridium thermocellum, Journal of Bacteriology Lee, M.S., Henry, M., and Silver, P.A (1996) A protein that shuttles between the nucleus and the cytoplasm is an important mediator of RNA, Genes Dev, 10, 1233 – 1246 Lee, S B., and Taylor J W (1990) Isolation of DNA from fungal mycelia and single spore, In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M 68 Đồ án tốt nghiệp Innis, D Gelfand, J Sninsky and T White , eds.), Academic Press, Orlando, Florida, chapter 34, 282 – 287 Mohammad Mainul Ahsan, Tetsuya Kimura, Shuichi Karita, Kazuo Sakka and Kunio Ohmiya (1996) Cloning, DNA Sequencing and Expression of the Gene Encoding Clostridium thermocellum Cellulase CelJ, the Largest Catalytic Component of the Cellulosome, Journal of Bacteriology, 178 (19), 5732 – 5740 Nakazawa, H., Okada, K., Kobayashi, R., Kubota, T., Onodera, T., Ochiai, N., Omata, N., Ogasawara, W., Okada, H and Morikawa, Y (2008) Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli, Applied Microbiology Biotechnology, 81 (4), 681 – 689 Odier, E and Artaud, I (1992) Degradation of Lignin In Microbial Degradation of Natural Products, ed G Winkelmann, VCH Publishers, Inc., New York, 161 – 191 Pérez J., J Munõz-Dorado, T de la Rubia, J Martínez (2002) Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview, Int Microbiol, 5, 53 – 63 Sambrook J, Fritsch E.F., Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Schimz KL, Broll B, John B (1983) Cellobiose photphorylase (EC2.4.1.20) of Cellulomonas: occurrence induction and its role in cellobiose metabolism, Arch Microbiol, 135, 241 – 249 Schwarz WH, Grabnitz F, Staudenbauer WL (1986) Properties of Clostridium thermocellum endoglucanase produced in Escherichia coli, Appl Environ Microbiol, 51, 1293 – 1299 69 Đồ án tốt nghiệp Schwarz WH (2001) The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria Appl Microbiol Biotechnol, 56, 634 – 649 Shen – Long Tsai, Jeongseok Oh, Shailendra Singh, Ruizhen Chen and Wilfred Chen (2009) Functional Assembly of Minicellulosomes on the Saccharomyces cerevisae Cell Surface on Cellulose Hydrolysis and Ethanol Production Applied and Environmental Microbiology, 75 (19), 6087 – 6093 Shoham Y, Lamed R, Bayer E.A (1999) The cellulosome concept as an efficient microbial strategy for the degradation of insoluble polysaccharides, Trends Microbiol, (7), 275 – 281 Sloneker, J H (1971) Determination of cellulose and apparent hemicellulose in plant tissue by gas-liquid chromatography, Anal Biochern, 43, 539 Taiz, L., Zeiger, E (2006) Plant physiology, Sinauer Associates, Inc William K Wang, Kristiina Kruus and David Wu J H (1993) Cloning and DNA Sequence of the Gene Coding for Clostridium thermocellum Cellulase SS (CelS) a Major Cellulosome Component Journal of Bacteriology, 175 (5), 1293 – 1302 William K Wang, Kristiina Kruus and David Wu J H (1994) Cloning and expression of the Clostridium thermocellum CelS gene in Escherichia coli, Applied Microbiol Biotechnol, 42, 346 – 352 70 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Kết giải trình tự gen CelD plasmid pJET1.2 Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Phụ lục B: Kết giải trình tự gen CelD plasmid pPIC9K Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Phụ lục C: Kết xử lí số liệu đo vòng phân giải CMC dòng Pichia pastoris tái tổ hợp Summary Statistics for duong kinh Mau Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Stnd skewness Stnd kurtosis 13.5833 3.3229 24.4631% 10.0 17.0 7.0 -0.0750651 -1.33917 13.0833 3.80022 29.0463% 8.0 17.0 9.0 -0.376797 -1.08766 15.1667 0.60553 3.99251% 14.0 15.5 1.5 -1.95171 1.82851 16.75 1.72482 10.2974% 14.0 19.0 5.0 -0.460406 0.259516 15.5 2.36643 15.2673% 12.0 18.5 6.5 -0.458421 -0.30971 6 15.75 2.27486 14.4436% 12.0 18.0 6.0 -1.07985 -0.0150529 16.5833 1.02062 6.1545% 15.0 18.0 3.0 -0.333131 0.25824 18.4167 2.37522 12.8971% 16.0 21.5 5.5 0.138369 -1.19845 Total 48 15.6042 2.75403 17.6493% 8.0 21.5 13.5 -2.16211 1.24718 10 Đồ án tốt nghiệp ANOVA Table for duong kinh by Mau Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 125.063 17.8661 3.09 0.0107 Within groups 231.417 40 5.78542 Total (Corr.) 356.479 47 Multiple Range Tests for duong kinh by Mau Method: 95.0 percent LSD Homogeneous Groups Mau Count Mean 13.0833 X 13.5833 X 15.1667 XX 15.5 XX 6 15.75 XXX 16.5833 XX 16.75 XX 18.4167 X 11 ... sản xuất cồn từ cellulose Trên sở đề tài: Tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme endoglucanase D (CelD) từ vi khuẩn Clostridium thermocellum hệ thống nấm men Pichia pastoris tiến... nấm men Pichia pastoris mang gen mã hóa enzyme endoglucanase D từ vi khuẩn Clostridium thermocellum 1.3 Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận gen mã hóa endoglucanase D (CelD) từ Clostridium thermocellum. .. - Tạo d ng tế bào E coli DH5