ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cơm mẻ 1.1.1 Giới thiệu cơm mẻ 1.1.2 Vi sinh vật có cơm mẻ 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Lactobacillus 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Lịch sử nghiên cứu Lactobacillus spp 1.2.3 Đặc điểm phân bố 1.2.4 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Lactobacillus spp 1.2.5 Đặc điểm sinh trưởng vi khuẩn Lactobacillus spp 1.2.6 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn Lactobacillus spp 1.2.7 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus spp 14 1.2.8 Khả phân giải protein vi khuẩn Lactobacillus spp 14 1.2.9 Khả sinh chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh .14 1.2.10 Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm phân bón vi sinh hữu nông nghiệp 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 16 2.1.2 Thời gian nghiên cứu .16 2.2 Vật liệu nghiên cứu .16 2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 16 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 16 2.2.3 Hóa chất môi trường 17 i ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3 Bố trí thí nghiệm 18 2.3.1 2.4 Bố trí thí nghiệm chi tiết 19 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu 27 2.4.2 Phương pháp tăng sinh 27 2.4.3 Phương pháp pha loãng mẫu 28 2.4.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả sinh acid lactic 28 2.4.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập 30 2.4.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 30 2.4.7 Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 31 2.4.8 Xác định mật độ tế bào phương pháp đo mật độ quang (OD600nm) 33 2.4.9 Phương pháp đục lỗ thạch .34 2.4.10 Phương pháp nghiên cứu khả phân giải tinh bột, protein 34 2.4.11 Phương pháp xử lý số liệu .35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ 36 3.1 Đặc điểm hình thái chủng phân lập từ cơm mẻ 36 3.2 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập 50 3.3 Xác định hàm lượng acid tổng .50 3.4 Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập 52 3.4.1 Khảo sát khả đối kháng sinh khối của chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập với nấm Neoscytalidium .52 3.1.1 Khảo sát khả đối kháng dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập với nấm Neoscytalidium .54 3.1 Khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 Kết luận 60 Đề nghị .61 ii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO .62 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 63 TÀI LIỆU INTERNET 66 PHỤ LỤC iii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT - Ϊ  Ϊ CFU Colony Form Unit ĐKVKN Đường kính vòng kháng nấm ĐKVKK Đườn kính vòng kháng khuẩn MT Mơi trường NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth OD Optical Density VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật LAB Lactic Acid Bacteria iv ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG - Ϊ  Ϊ Bảng Danh sách chủng vi khuẩn phân lập 36 Bảng Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 37 Bảng 3 Kết định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu cơm mẻ .38 Bảng Hàm lượng % acid lactic 11 chủng vi khuẩn Lactobacillus nuôi cấy 24 .51 Bảng Tỉ lệ ức chế nấm Neoscytalidium chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 52 Bảng Tỉ lệ ức chế chủng nấm vi khuẩn Lactobacillus phân lập 54 Bảng Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus 57 v ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH - Ϊ  Ϊ Hình 1 Vi khuẩn Lactobacillus sakei Hình Hình dạng tế bào số chủng vi khuẩn Lactobacillus .8 Hình Sơ đồ tổng quát bố trí bước thí nghiệm .18 Hình 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn có khả sinh acid lactic từ cơm mẻ 19 Hình Quy trình định danh sơ chủng phân lập 21 Hình Quy trình khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 22 Hình Quy trình khảo sát khả kháng nấm dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 24 Hình Quy trình khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 26 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L1 .39 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L2 .40 Hình 3 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L3 .41 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L4 .42 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L5 .43 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L6 .44 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L7 .45 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L8 .46 Hình Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L9 .47 Hình 10 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L10 48 Hình 11 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L11 49 Hình 12 Khảo sát khả phân giải tinh bột chủng vi khuẩn Latobacillus phân lập 50 Hình 13 Hàm lượng % acid lactic sinh 11 chủng Lactobacillus sau 24 nuôi cấy 51 Hình 14 Tỷ lệ ức chế nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 53 Hình 15 Đĩa nấm đối kháng vi khuẩn Lactobacillus với nấm Neoscytalidium .53 Hình 16 Tỷ lệ ức chế nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập 55 Hình 17 Đĩa nấm đối kháng vi khuẩn Lactobacillus với nấm Colletotrichum .55 Hình 18 Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập .57 vi ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 19 Đĩa đối kháng vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn E coli 58 Hình 20 Đĩa đối kháng vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Salmonella 58 Hình 21 Đĩa đối kháng vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Staphylococcus .59 vii ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Trong năm gần đây, lượng rác thải từ thực phẩm rác thải nông nghiệp, rác thải từ khu công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm rác thải nhà bếp không ngừng tăng nhanh trở thành vấn đề mang tính tồn cầu Đây loại rác thải hữu cơ, phân hủy phát tán môi trường lượng lớn loại khí nhà kính methane carbon dioxide làm tình trạng nóng lên tồn cầu ngày xấu [45] Theo nghiên cứu vào năm 2012 cho thấy có gần 9.278 chất thải rắn thị, có khoảng 3.337 rác thải từ thực phẩm xử lý bãi rác ngày [46] Việc loại chất thải xử lý cách chôn lấp không thân thiện với môi trường thiếu tính bền vững Vì việc xử lý chúng tiêu tốn gần 75% đến 80% chi phí xử lý rác thải đô thị ngân sách chưa kể đến phí chơn lấp chúng chiếm đến 30% Ngồi chơn lấp rác thải từ thực phẩm làm hao phí nhiều giá trị lượng, giá trị dinh dưỡng mà loại rác thải đem lại từ trình phân hủy đất [47], [48] Mới nhiều nghiên cứu cho thấy việc tái sử dụng nguồn rác thải hữu thức ăn thừa cách sử dụng vi khuẩn LAB để lên men lactic nhằm tạo loại phân bón hữu xu hướng phát triển mang tính bền vững [51], [53], [54] Đây phương pháp có tính khả thi cao, hiệu quả, tốn chi phí mà việc tái tạo nguồn tài nguyên tạo lượng lớn phân bón hữu thân thiện với mơi trường, khơng có khả kháng loại vi khuẩn gây bệnh cho mà có khả khăng kích thích tăng trưởng trồng [55] Hiện việc sử dụng chủng vi khuẩn lên men lactic (LAB) chủng Lactobacillus spp để lên men loại rác thải nhà bếp có nhiều tiềm to lớn [49] Thông thường loại rác thải từ nhà bếp bao gồm hầu hết tinh bột, loại đường hòa tan, lipid, protein, số hợp chất dễ phân hủy sinh học [50] Đây nguồn chất lý tưởng để tiến hành lên men vi khuẩn lactic khơng giàu chất dinh dưỡng, tốn chi phí mà giúp làm giảm ô nhiễm môi trường [51] Đối với chủng vi khuẩn LAB, chúng đặc trưng khả lên men nguồn chất ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cellulose, hemicellulose tinh bột tạo đường acid lactic Ngoài theo Wang đồng tác giả (2002) việc sử dụng vi khuẩn LAB lên men lactic kiểm sốt ổn định cách kiểm sốt thích hợp điều kiện lên men (nhiệt độ, oxy, pH,…) [56] Dựa sở đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ” thực nhằm tìm chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả sinh nhiều acid lactic, khả kháng nấm, kháng khuẩn mạnh để làm vật liệu sản xuất phân bón từ nguồn rác thải nhà bếp đề tài thiết thực Mục đích nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập chọn lọc vi khuẩn Lactobacillus - Định danh sơ - Khảo sát đặc điểm ni cấy, hình thái khả lên men lactic - Khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập chủng nấm Neoscytalidium sp., Fusarium sp nấm Colletotrichum sp - Khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh Salmonella, Ecoli Staphylococcus Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tổng hợp tài liệu: Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet tổng hợp tài liệu có liên quan đến mục tiêu đề đề tài - Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: + Phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ + Khảo sát hình thái, thực thử nghiệm sinh lý sinh hóa để định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP + Bố trí thí nghiệm khảo sát khả sinh acid lactic, khả kháng chủng nấm chủng vi khuẩn gây bệnh chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập - Phương pháp thu thập xử lý số liệu: + Ghi nhận số liệu từ kết thí nghiệm thời điểm khảo sát + Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu vẽ đồ thị + Sử dụng phần mềm Statgraphics, phân tích ANOVA Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: + Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp - Phạm vi giới hạn: + Phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ + Thực lên men tạo chế phẩm phân bón quy mơ phòng thí nghiệm Các kết đạt đề tài - Phân lập 11 chủng vi khuẩn có khả sinh acid lactic từ cơm mẻ Từ kết phân lập định danh sơ cho thấy 11 chủng vi khuẩn có đặc tính vi khuẩn Lactobacillus spp - Khảo sát khả sinh acid lactic, kháng nấm, kháng khuẩn chọn lọc chủng có đủ tiêu chí đề - Ứng dụng chủng vi khuẩn chọn lọc vào lên men sản xuất phân bón Kết cấu đồ án - Phần Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu - Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến dụng cụ, thiết bị phương pháp nghiên cứu đồ án - Chương 3: Kết thảo luận – nội dung chương đưa kết mà đề tài thực đưa thảo luận, biện chứng cho kết thu ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N KhangColetotrichum A A 77.259 L2 A A 75.545 L10 B 71.184 L5 B B 68.536 L8 C 58.100 L1 D 30.062 L7 D D 28.505 L3 E 22.430 L6 E E 20.561 L4 E E 20.405 L11 B.4 Định lượng % acid lactic chủng vi khuẩn Lactobacillus spp THI NGHIEM SINH LACTIC The ANOVA Procedure Class Level Information Class Lactic Levels Values 11 L1 L10 L11 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 THI NGHIEM SINH LACTIC 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 3.34612105 0.33461210 Error 22 0.55337850 0.02515357 Corrected Total 32 3.89949955 13.30 F 10 3.34612105 0.33461210 13.30