Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu Những kết số liệu trích dẫn luận văn tốt nghiệp trung thực, không chép nguồn khác Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường cam đoan TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Thị Bích Thưởng _ Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Thạc sĩ Võ Minh Sơn, cảm ơn giáo viên giới thiệu Th.s Phạm Minh Nhựt nhiệt tình hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ để tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban giám đốc anh chị làm việc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành tốt trình thực nghiệm đồ án Xin cảm ơn Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II hỗ trợ tồn kinh phí máy móc, trang thiết bị để tơi thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, q thầy Khoa Cơng Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường tận tâm bảo, giảng dạy truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường để áp dụng hồn thành tốt đồ án Tôi xin cảm ơn chân thành, sâu sắc đến gia đình tơi tạo điều kiện cho học tập phấn đấu bốn năm qua Cảm ơn bạn lớp 11DSH02, 11DSH01 bạn làm việc, giúp đỡ suốt trình thực nghiệm Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Sau cùng, xin gửi tới thầy cô Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh tồn thể anh chị Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II lời cảm ơn chân thành _ Đồ án tốt nghiệp _ Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cá tra 1.1.1 Giới thiệu cá tra 1.1.1.1 Phân loại 1.1.1.2 Phân bố 1.1.1.3 Hình thái, sinh lý cá tra 1.1.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng sinh sản 1.1.2 Tình hình ni trồng xuất cá tra Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình ni trồng cá tra 1.1.2.2 Tình hình xuất cá tra 1.1.3 Tình hình bệnh gan thận mủ cá tra 1.2 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn E ictaluri 1.2.2 Các đường xâm nhiễm vi khuẩn E ictaluri 1.2.3 Dấu hiệu bệnh lý cá tra E ictaluri gây 1.3 Tổng quan miễn dịch 11 1.3.1 Giới thiệu miễn dịch 11 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Hệ miễn dịch tự nhiên 12 1.3.2.1 Miễn dịch thực bào 12 1.3.2.2 Miễn dịch dịch thể 16 1.3.3 Chất tăng cường miễn dịch 17 1.4 Chế phẩm LP20 22 1.4.1 Sản phẩm HK L-137 22 1.4.2 Thức ăn LP20 23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu thí nghiệm 25 2.2.1 Mẫu thí nghiệm 25 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 25 2.2.3 Mơi trường hóa chất 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Chuẩn bị thức ăn 27 2.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh 28 2.3.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm miễn dịch 28 2.3.3.1 Thí nghiệm cảm nhiễm 30 2.3.3.2 Thí nghiệm miễn dịch 32 2.4 Xử lí số liệu 38 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39 3.1 Kết thí nghiệm 39 3.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm 39 ii Đồ án tốt nghiệp 3.1.1.1 Xác định liều gây chết 50% (LD50) vi khuẩn E ictaluri cá 39 3.1.1.2 Khả bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ sau 60 ngày nuôi 40 3.1.2.2 Khả bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ sau 75 ngày nuôi 41 3.1.2.3 Kết kiểm tra vi khuẩn E ictaluri 42 3.1.2 Các thông số miễn dịch tự nhiên 45 3.1.2.1 Hoạt tính lysozyme 45 3.1.2.2 Hoạt động thực bào 47 3.2 Thảo luận chung 49 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐC: Đối chứng E Ictaluri: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri LD50: Liều lượng vi khuẩn E ictaluri gây chết 50% LP20 : Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 20% L-15: Môi trường leibovitiz – 15 MD: Miễn dịch NT: Nghiệm thức RPS: Tỷ lệ sống tương đối TLS: Tỷ lệ sống iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Ảnh hưởng chất tăng cường miễn dịch cá (Sakai, 1998) 18 Bảng 1.2 Sự khác HK L – 137 vi khuẩn sống 22 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thực nghiệm 28 Bảng 3.1 Kết khảo sát LD50 phương pháp tiêm 39 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa E.ictaluri Gly09M 44 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cá tra Hình 1.2 Vi khuẩn E ictaluri Hình 1.3 Cá tra khỏe mạnh nội tạng bình thường (A); Cá tra bệnh với triệu chứng nội tạng sưng to nhiều đốm mủ trắng thận, lách gan (B) Hình 1.4 Thực bào trình giết vi sinh vật bên tế bào 15 Hình 1.5 Mẫu bao gói nhãn thức ăn LP20 23 Hình 2.1 Thức ăn bổ sung LP20 27 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm bể kính 150 lít 29 Hình 2.3 Tiêm 0,2 ml vi khuẩn E.ictaluri vào cá tra ăn thức ăn chứa LP20 31 Hình 2.4 Sơ đồ thu huyết cá tra từ mẫu máu 32 Hình 2.5 Lấy máu động mạch chủ đuôi cá ống tiêm vơ trùng 33 Hình 2.6 Máu cá tra sau ly tâm (A); Huyết thu từ máu cá tra (B) 33 Hình 2.7 Lấy thận trước cá tra (A); Thận trước cá tra sau vô trùng L-15 (B); Nghiền thận cối xứ vô trùng với môi trường L-15 (C) 35 Hình 2.8 Dịch bạch cầu sau ly tâm nằm percol 37/51% (A); Dịch bạch cầu thu sau q trình xử lí từ thận trước (B) 35 Hình 2.9 Sơ đồ thu nhận dịch bạch cầu từ thận trước cá tra 36 Hình 2.10 Dịch bạch cầu có định lame tất nghiệm thức (A); Dịch bạch cầu rửa PBS sau nhuộm màu với propidium (B) 37 Hình 2.11 Sơ đồ trình xác định hoạt động thực bào 38 Hình 3.1 Tỷ lệ sống cá tra sau cảm nhiễm với E Ictaluri Gly09M sau 60 ngày sử dụng LP20 40 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3 Kết kiểm tra hình thái bên cá tra sau gây bệnh với vi khuẩn E ictaluri Gly09M 43 Hình 3.4 E ictaluri Gly 09M nuôi cấy môi trường Blood agar bổ sung 5% máu cừu 43 Hình 3.5 Đồ thị phương trình đường chuẩn lysozyme từ lòng trắng trứng gà với Microccoccus luteus ATCC 9341 45 Hình 3.6 Hoạt tính lysozyme huyết cá tra sau cho ăn thức ăn trộn với LP20 Số liệu biểu thị giá trị trng bình độ lệch chuẩn (n = 3) 46 Hình 3.7 Tỷ lệ thực bào tế bào bạch cầu cá tra sau cho ăn thức ăn trộn LP20 Số liệu biểu thị số trung bình sai số chuẩn (n = 3) Các chữ (thuờng) khác thời điểm thu mẫu biểu thị khác biệt có ý nghĩa với p < 0,05 47 Hình 3.8 Chỉ số thực bào tế bào bạch cầu cá tra sau cho ăn thức ăn trộn LP20 Số liệu biểu thị số trung bình sai số chuẩn (n = 3) Các chữ (thuờng) khác thời điểm thu mẫu biểu thị khác biệt có ý nghĩa với p < 0,05 48 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng C3 Số cá chết sau cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri (sau 75 ngày cho ăn) Nghiệm thức DC (-) DC (+) Pzpro 1000ppm LP20 (20ppm) LP20 (50ppm) LP20 (100ppm) Các ngày theo dõi số cá chết (ngày) 1, 2, 3, 10 0 0 0 0 5 0 6 0 0 0 0 3 0 0 0 5 0 0 0 1 5 0 4 0 0 0 _ Đồ án tốt nghiệp Bảng C4 Tỷ lệ sống cá tra vòng 10 ngày cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri sau 75 ngày cho ăn thức ăn bổ sung LP20 Nghiệm thức Ngày DC (+) NT1- Pzpro NT2 - LP20 NT3 - LP20 NT4 - LP20 (1000 ppm) (20ppm) (50 ppm) (100ppm) 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0 100 ± 0,0a 93,3 ± 3,8a 97,8 ± 2,2a 97,8 ± 2,2a 100 ± 0,0a 84,5 ± 2,2ab 73,3 ± 3,8b 88,9 ± 4,4ab 93,3 ± 3,8a 91,1 ± 2,2a 44,5 ± 2,2a 57,8 ± 5,8a 55,6 ± 8,0a 60,0 ± 3,9a 62,2 ± 4,5a 11,1 ± 2,2b 20,0 ± 3,9ab 20,0 ± 3,9ab 28,9 ± 5,9a 15,6 ± 5,9ab 4,47± 2,2a 2,23 ± 2,2a 4,47 ± 2,2a 8,90 ± 2,2a 2,23 ± 2,2a 10 2,23 ± 2,2a 2,23 ± 2,2a 4,47 ± 2,2a 8,90 ± 2,2a 2,23 ± 2,2a 0,0 % 2,27 % 6,82 % 0,0 % RPS Ghi chú: Số liệu trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn, số liệu dòng có ký tự viết lên khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê (p